세포외 소포 하위 집합 분석을 위한 Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip의 다중 모드 분석 플랫폼

진단 및 치료제 1,2,3,4,5에 대한 EV 연구에 대한 관심이 증가함에 따라 이 분야가 직면한 과제와 함께 이러한 소포를 정량화하거나 특성화하기 위한 다양한 접근 방식과 기술이 개발 및 구현되었습니다. EV 식별에 가장 널리 사용되는 방법은 EV의 기원을 확인하기 위한 단백질 특이적 면역블로팅 및 단백질체학, 구조를 확인하기 위한 투과 전자 현미경(TEM), 샘플 부피에서 EV의 수와 크기 분포를 정량화하기 위한 나노입자 추적 분석(NTA)입니다.

그러나 이러한 기술 중 어느 것도 자체적으로 EV 하위 집합을 특성화하는 데 필요한 모든 정보를 제공하지 않습니다. 생화학적 및 물리적 특성의 다양성으로 인한 EV의 고유한 이질성은 특히 혼합물(원유 샘플)에 포함된 EV의 경우 신뢰할 수 있고 재현 가능한 글로벌 분석을 방해합니다. 따라서 검출 및 특성화 방법은 EV에 개별적으로 그리고 일반적으로 더 빠르지만 선택적이지 않은 다른 방법을 보완하는 데 필요합니다⁶.

TEM(또는 cryoTEM) 또는 AFM에 의한 고해상도 이미징을 통해 나노미터 분해능 7,8,9,10,11,12로 EV의 형태 및 계측을 측정할 수 있습니다. 그러나 EV와 같은 생물학적 물체에 대한 전자 현미경 사용의 주요 한계는 샘플의 고정 및 탈수가 필요한 연구를 수행하기 위해 진공이 필요하다는 것입니다. 이러한 준비는 관찰된 구조에서 용액 내 EV 형태로 변환하는 것을 어렵게 만듭니다. 이러한 시료의 탈수를 피하기 위해, cryoTEM의 기술은 EV 특성화에 가장 적합하다⁽¹³). EV의 미세 구조를 결정하는 데 널리 사용됩니다. 생체 기능화된 금 나노입자에 의한 소포의 면역 표지는 또한 EV의 특정 하위 집단을 식별하고 복잡한 생물학적 샘플에 존재하는 다른 입자와 구별하는 것을 가능하게 합니다. 그러나 전자 현미경으로 분석하는 EV의 수가 적기 때문에 복잡하고 이질적인 샘플을 대표하는 특성화를 수행하기 어려운 경우가 많습니다.

이러한 크기의 이질성을 밝히기 위해 ISEV(International Society for Extracellular Vesicles)는 더 작은 이미지와 함께 충분한 수의 광시야 이미지를 분석하여 고해상도¹⁴의 개별 EV를 밝힐 것을 제안합니다. AFM은 EV 연구를 위한 광학 접근 방식 및 전자 회절 기술의 대안입니다. 이 기술은 하나의 지지대에 증착된 샘플을 한 줄씩 스캔하고 피드백 루프를 통해 존재하는 요소와 팁 사이의 거리를 조정하는 유연한 캔틸레버로 고정된 날카로운 팁을 사용합니다. 이를 통해 샘플의 지형을 특성화하고 형태역학적 정보^(15,16,17,18)를 수집할 수 있습니다. EV는 원자적으로 평평한 기판에 증착된 후 또는 항체, 펩티드 또는 앱타머에 의해 기능화된 특정 기판 상에 포획된 후 AFM에 의해 스캔되어 다양한 하위 집단을 특성화할 수 있다(^18,19). 전처리, 라벨링 또는 탈수 없이 복잡한 생물학적 시료 내에서 EV의 구조, 생체역학 및 막 생체 분자 함량을 정량화하고 동시에 조사할 수 있는 능력으로 인해 AFM은 이제 온도 및 매체의 생리학적 조건에서 미세하고 다중모수적인 방식으로 EV를 특성화하는 데 점점 더 많이 사용되고 있습니다.

본 논문은 다중화 형태로 (생)화학적으로 기능화할 수 있는 핵심 금 바이오칩을 이용한 방법론을 제안한다. 이 기판은 표면 플라즈몬 공명에 의한 EV 하위 집합의 생체 검출을 결합한 강력한 분석 플랫폼의 초석이며, EV가 칩에 흡착/이식 또는 면역포획되면 AFM은 EV의 도량형 및 형태역학적 특성화를 가능하게 합니다. 칩에 캡처된 EV 하위 집합의 라만 시그니처와 결합된 이 분석 플랫폼을 사용하면 사전 분석 단계 없이 라벨이 없는 방식으로 생물학적 샘플에 존재하는 EV를 검증할 수 있습니다. 이 백서는 기판 준비 및 데이터 수집에서 매우 엄격한 방법론의 도움을 받는 강력한 기술의 조합이 EV 분석을 심층적이고 확실하며 강력하게 만든다는 것을 보여줍니다.

제안된 접근 방식의 원리는 금 기판을 준비하고, EV 아형을 흡착/접목 또는 포획하고, AFM으로 스캔하여 각 EV 하위 집합의 크기와 형태를 추정하는 것입니다. 또한 흡착된 EV는 라만 분광법으로 분석됩니다. 이 기판은 실제로 복잡성이 증가하는 세 가지 유형의 인터페이스, 즉 네이키드, 화학적으로 기능화된 또는 리간드 마이크로어레이를 나타낼 수 있습니다. 프로토콜의 여러 단계를 설명하기 전에 독자는 표면 플라즈몬 공명 영상(SPRi), AFM 및 분광법을 결합한 그림 1의 나노바이오 분석 플랫폼(NBA) 접근 방식의 개략도를 참조합니다.

그림 1 : NanoBioAnalytical 플랫폼. 이 접근 방식은 (A) 표면 플라즈몬 공명 영상, (B) 원자력 현미경 및 적외선/라만(나노) 분광법을 결합하며, 모두 동일한 기판(다중화된 금 칩)에 결합됩니다. 약어: NBA = NanoBioAnalytical platform; SPRi = 표면 플라즈몬 공명 영상; AFM = 원자력 현미경; EV = 세포외 소포체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

핵심 금 바이오칩은 모든 무표지 특성화 기술이 이 바이오칩에서 수행되기 때문에 플랫폼의 핵심을 구성합니다. EV 특성화(글로벌/전체 EV 또는 EV 하위 집합)의 요구와 사용된 방법의 한계/요구에 따라 세 가지 유형의 금 바이오칩 표면이 개발되었습니다: "네이키드", 화학적으로 기능화된 "C11/C16" 또는 "리간드" 금 표면이라고 하는 리간드 생체 기능화.

"네이키드(naked)"라고 불리는 네이키드 바이오칩은 금에 EV를 간단하게 흡착할 수 있습니다. 사용되는 완충액을 선택하고 수동적 인 방법 (배양 후 헹굼 단계)으로 또는 흐름 (SPRi)에서 모니터링하여이 흡착을 실현할 수 있습니다. 또한, 이 수동 흡착은 전체 칩(매크로어레이)에서 실현되거나 마이크로피펫 스포터를 사용하여 마이크로어레이에 국한될 수 있습니다. "언더 플로우 절차"를 통해 조사관은 동역학과 EV 흡착 수준을 추적할 수 있습니다. 네이키드 골드 기판에 대한 이러한 접근 방식은 화학층 계면이 분석 방법(예: 라만 분광법)을 방해할 수 있을 때 채택됩니다.

"C11/C16"이라고 하는 화학적으로 기능화된 바이오칩은 EV 샘플에 대한 글로벌 관점을 갖는 것이 목적일 때 티올레이트와 1차 아미드 결합을 형성하여 금 표면에 공유 결합된 EV의 조밀하고 견고한 "카펫"을 만드는 데 사용됩니다. 실제로, 이 경우, 금은 메르캅토-1-운데칸올(11-MUOH: "C11") 및 메르캅토-1-헥사데칸산(16-MHA: "C16")의 티올레이트 혼합물에 의해 기능화되고, 티올레이트의 분획은 화학적으로 활성화되어 표적과의 공유 결합을 확립한다. 다시 말하지만, 이 전략은 수동적으로("매크로어레이" 또는 마이크로피펫 스포터를 사용하는 여러 마이크로어레이에서 배양 후 헹굼 단계) 또는 유속(SPRi)에서 실현되어 금 표면의 EV 접목 및 동역학 수준을 따를 수 있습니다.

"리간드"라고 하는 리간드 생체 기능화 바이오칩은 화학적으로 활성화되어 서로 다른 리간드(예: 항체, 수용체)를 공유 접목하여 생물학적 샘플에 공존하는 서로 다른 EV 하위 집합을 선택적으로 (친화도로) 캡처합니다.

1. 금 기판 준비

참고: 금 칩에는 1) 노출된 표면, 2) 화학적으로 기능화된, 3) 생체 기능화된(C11C16 층에 접목된 리간드) 세 가지 유형의 표면이 생성됩니다. 이 시점부터 각각 "네이키드", "C11C16" 및 "리간드"라고 불릴 것입니다.

1. 금 기판 준비:
   참고: 이 프로토콜의 경우 금 바이오칩은 클린룸에서 사내에서 제조되었습니다. 집에서 만든 바이오칩은 크롬(2nm Cr)과 금(48nm Au)이 코팅된 유리 슬라이드(SF11)로 구성되었습니다. 바이오칩의 길이는 28 mm, 폭은 12.5 mm, 두께는 0.5 mm였다(²⁰).
   1. DC 마그네트론 스퍼터링¹⁵ 를 사용하여 PVD(Physical Vapor Deposition)로 슬라이드를 코팅합니다.
2. 화학적 기능화:
   1. 머캅토-1-운데칸올(11-MUOH: C11)과 메르캅토-1-헥사데칸산(16-MHA: C16)의 90%/10% 몰 혼합물에서 하룻밤 동안 배양하여 네이키드 칩을 기능화합니다.
      참고: 이 단계는 리간드의 접목에 유용한 안정적인 자체 조립 단층(SAM)을 형성합니다.
   2. 무수 에탄올과 초순수로 바이오칩을 세척(부드럽게 세척)하고 질소로 건조시킨 후 클린룸 조건에서 보관합니다.
   3. 화학적으로 기능화 된 바이오 칩의 활성화 :
      참고: 이 단계부터 실험은 분석 실험실에서 수행해야 합니다.
      1. 바이오칩을 초순수로 부드럽게 세척하여 세척한 후 부드러운 공기 흐름으로 칩을 건조시킵니다. C16 카르복실기를 활성화하기 위해 바이오칩을 200mM 에틸(디메틸아미노프로필) 카르보디이미드/N-하이드록시숙신이미드(EDC)와 50mmol/L N-하이드록시숙신이미드(Sulfo-NHS)의 혼합물에서 실온의 어두운 곳에서 최소 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 접목 실험 전에 물로 헹굽니다.
3. 기능화된 바이오칩 상의 리간드 접목: Grafting of the ligands on the functionalized biochip:
   참고: 칩에서 리간드(또는 일부 실험의 경우 EV)의 고정화는 SPRi 기기 외부에서 수동적으로 수행되거나(활성화된 칩에 한 방울의 인큐베이션) SPRi 기기로 동적으로 유동적으로 수행될 수 있습니다. 이는 전기차 또는 리간드 개질된 칩을 구성한다. 그림 2 는 금 바이오칩, 마이크로피펫 스포터 및 각각 300nL의 16개의 리간드 방울로 스팟팅한 후의 바이오칩을 보여줍니다.
   1. 리간드 이식의 경우 항체(예: 면역글로불린-항CD41[ N-PEV라고 하는 천연 혈소판에서 파생된 EV에 특이적], 항CD61, 항CD62P, 항CD9 및 항OVA[오브알부민에 대한 대조 항체]) 및 Annexin V. 산성 용액(리간드 활성 또는 기능에 대한 최적 pH에 따라 pH 4.5에서 6까지)에서 200μg/mL로 희석합니다.
      참고: 항체 이식을 위한 최적 pH는 리간드 이식을 위한 최적 pH를 결정하기 위해 SPR 기기에서 수행된 사전 농축 실험에 의해 이전에 결정되었습니다( 그림 3 참조). 사용되는 항체의 클론에 따라 이식 조건이 변경되므로 SPRi 실험을 진행하기 전에 이러한 조건을 결정하는 것이 좋습니다.
   2. 이식 절차의 경우 스포터를 사용하여 300nL의 EV/리간드 용액을 추가합니다.
      알림: 물에 잠긴 종이 조각은 물방울이 증발하지 않도록 왼쪽 우물과 오른쪽 우물 모두에 보관해야 합니다. 이 단계는 EV/리간드를 안정성과 기능성을 위한 최적의 조건으로 유지하는 데 중요합니다.
   3. 스포팅 후 바이오칩을 음파 수조(주파수: 37kHz, 전력: 30%)에서 30분 동안 배양합니다. 바이오칩을 초순수로 상단부터 세척하고 바이오칩과 동일한 굴절률(RI)을 가진 프리즘에 부드럽게 올려놓는다. 프리즘 상단의 바이오칩을 조정하는 동안 프리즘과 동일한 RI를 가진 오일 방울(~ 2.3μL)을 추가하여 바이오칩과 프리즘 사이에 균일하고 얇은 층을 만듭니다.
      참고: 이 단계에서는 광 경로에서 동일한 RI의 연속 매체를 보장합니다. 이 단계에서 오일 층에 기포를 통합하지 않는 것이 중요한데, 이는 경로의 광학적 특성을 변경하고 추가 분석을 방해하기 때문입니다.

그림 2: 바이오칩 및 수동 스포터. 금 바이오칩(왼쪽), 마이크로피펫 스포터(가운데), 각각 300nL의 리간드 방울로 스팟팅한 후의 바이오칩(오른쪽). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 리간드 이식을 위한 최적의 pH를 결정하기 위한 사전 농도 테스트. 센서그램은 표면에 2분 동안 동일한 농도로 무작위로 주입된 하나의 리간드에 대한 시간의 함수로 상호 작용 수준을 나타냅니다. OG는 각 주입 사이에 기준선을 회수할 수 있는 세제입니다. 여기서, 센서그램은 pH 6이 1091 RU의 SPRi 신호로 가장 많은 리간드 이식을 허용했음을 나타낸다. 약어: OG = 옥틸 글루코사이드; RU = 응답 단위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 표면 플라즈몬 공명 영상

1. SPRi 시스템에 바이오칩을 장착합니다. PBS 버퍼(러닝 버퍼)의 유속 을 50μL/min으로 유지합니다.
   알림: 기포가 있는 경우 유속을 최대 500-1,000μL/min까지 높이고 40mM 옥틸 글루코사이드(OG)를 자주 주입하여 가능한 한 빨리 제거하십시오.
2. SPRi 기기의 금 바이오칩 컨디셔닝: 작동 각도 선택
   1. 소프트웨어 왼쪽의 드롭다운 메뉴를 클릭하고 작업 디렉토리 를 클릭하여 실험 데이터를 저장할 폴더를 정의합니다. 그런 다음 Plasmon | 이미지 획득.
   2. 다른 지점이 보이는 이미지(그림 4A 참조)를 찾아 이 이미지를 클릭하여 선택합니다. 그림 4와 같이 관심 영역(ROI)을 정의하려면 스팟 내부의 자동 감지 또는 수동 정의(그림 4B)를 클릭하거나 칩을 클릭하여 스폿이 없어도 특정 위치를 참조합니다(그림 4C).
   3. 다중화된 바이오칩을 사용하는 경우 리간드 패밀리의 이름을 쓴 다음 해당 지점을 클릭합니다.
      참고: 리간드 패밀리는 동일한 리간드로 기능화된 여러 지점에 해당합니다. 일반적으로, 칩은 적어도 각 리간드의 중복을 나타내고 심지어 종종 삼중을 나타낸다.
   4. 종 정의 완료를 클릭하고 얻은 플라즈몬 곡선이 포함된 창으로 이동할 때까지 기다립니다.
   5. 작업 각도를 선택합니다. 커서가 있는 검은색 선을 최적의 작업 각도로 드래그하고 미러를 작업 각도로 이동을 클릭합니다.
      참고: 플라즈몬 곡선은 반사율(%) 대 각도 값으로 구성되며 소프트웨어는 기울기(%) 대 각도 값으로 다른 곡선을 제공합니다. 좋은 작업 각도를 선택하려면 기울기 값이 가장 높은 각도를 선택하십시오.
      1. 장치 내부에서 수행되는 부동태화 단계(알부민으로 인해)의 경우 표면에 대한 최적의 감도를 얻기 위해 작동 각도 를 선택하여 표면 반응성의 품질 관리를 설정합니다.
         참고: 이 패시베이션 단계는 샘플과 바이오칩 표면 사이의 비특이적 상호작용을 줄이기 위해 칩이 친화성/포획 바이오검출을 위해 준비될 때 중요합니다.
3. Kinetics를 클릭하여 실시간 키네틱 모니터링을 시작합니다. 소프트웨어가 사용자에게 음성 대조군을 정의하라는 메시지를 표시하면 이 시점에서 음성 대조군을 선택하지 않습니다(음성 대조군 지점에서 동역학을 관찰할 수 있기 때문에).
   1. 쥐 혈청 알부민(RSA, 200μg/mL, 아세테이트 완충액, pH 4.5에서 준비)을 50μL/min으로 4분 동안 주입하여 반점 주위의 표면을 부동태화하고 리간드 반점 내부의 빈 공간을 채울 수 있습니다.
      참고: RSA는 어떤 리간드에도 결합되지 않은 바이오칩을 덮기 위해 주입됩니다.
   2. 에탄올아민(1M)을 20μL/min의 속도로 10분 동안 주입하여 표면에 여전히 존재하고 반응성인 카르복실기를 비활성화합니다.
   3. 40분 동안 50μL/min의 속도로 40mM OG를 주입하여 바이오칩을 세척합니다.
      참고: 패시베이션 단계 후, 작업 각도가 조정됩니다(샘플 주입 전 새로운 기준선 결정으로) 관심 지점에서 가장 높은 감도를 유지합니다.
4. 시료 주입:
   1. 패시베이션 후 플라즈몬 곡선을 재정의하고 이번에는 리간드에 따라 작업 각도를 선택합니다.
   2. 동역학 모니터링에서는 유속을 20μL/min으로 줄이고 기준선이 안정될 때까지 기다립니다.
   3. 선택한 농도(EV와 접목된 리간드 사이의 친화도에 따라 1 x 10 8 EVs/mL에서 1 x^{10 10} EVs/mL까지)로 시료를 주입하고 수동 주입 또는 자동 주입을 클릭합니다. 수동 주입의 경우 샘플 200μL를 주입한 후 주입 중지를 클릭합니다. 주입 시간은 일반적으로 10분이므로 상호 작용의 동역학을 따르기 시작하고 동역학 모니터링 중에 관찰된 주입 시작과 끝 사이의 반사율 차이를 계산하여 반사율 변화를 측정합니다(그림 5).
      참고: 주입된 다른 샘플은 대표 결과 섹션에 설명되어 있습니다.
5. 샘플 주입 후 다음 두 가지 방법 중 하나에 따라 SPRi 실험을 완료합니다.
   1. 고정되지 않은/액체 내 접근 방식에서는 SPRi 장치에서 바이오칩을 꺼내 그 위에 액체 방울을 추가한 다음 액체 표면의 추가 AFM 특성 분석을 진행합니다.
   2. 고정된 접근 방식에서는 물에 희석한 글루타르알데히드(0.5%)를 20μL/min의 속도로 10분 동안 주입하여 바이오칩에 포획된 분자를 고정합니다. 물을 주입하여 표면을 헹구고 바이오칩을 꺼내 증류수로 매우 부드럽게 씻은 다음 자연 건조하여 AFM에서 추가 분석합니다.

그림 4: 바이오칩의 SPRi CCD 이미지. (A,B) 알부민 패시베이션 후 멀티플렉싱된 바이오칩. (A) 기본값이 없는 칩; (B) 칩에 나타난 일부 결함: 스폿의 융합(i), 약한 접목(ii) 또는 먼지 또는 "오염 물질"(iii). 스폿의 색상(리간드 계열당 한 가지 색상)의 ROI는 이러한 "오염 물질"을 피하기 위해 선택되었습니다. 스폿이 합쳐졌을 때, 그것들은 주목되었고 무시되거나 "리간드 1과 2의 혼합물"로 명명되었습니다. (C) 금에 대한 EV의 흡착을 조사하는 실험을 위한 마이크로어레이가 없는 네이키드 골드 칩. 파란색 화살표는 흐름 방향을 나타냅니다. 이 칩에는 스폿이 없었으며, 시료 주입 중 라인 1(L1, 빨간색 원)에서 라인 4(L4, 보라색 원)까지 반사율 신호를 등록하기 위해 ROI를 선택했습니다. 스케일 바 = 세 이미지 모두에 대해 1mm입니다. 약어: SPRi = 표면 플라즈몬 공명 영상; CCD = 전하 결합 소자; ROI = 관심 영역; EVs = 세포외 소포체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 바이오칩에 EV를 주입하는 SPRi 실험. (A) 상이한 리간드의 반사율 신호를 보여주는 다중화된 바이오칩에 대한 캡처 실험. 여기서, 상이한 리간드에 대한 신호 대 잡음비는 음성 대조군의 반응이 무시할 수 있었기 때문에 매우 양호했다(특히 항CD41 스팟에서). (B) 네이키드 바이오칩에 대한 EV의 흡착 실험. Sensorgram은 버퍼 및 OG 세척(1)의 두 번의 플러시, EV 샘플 주입(2) 및 EV 상호 작용 후의 반사율 신호(3)를 통해 칩의 컨디셔닝을 제공합니다. 이 바이오칩에는 음성 대조군이 없었지만 반사율 신호(동역학, 주입 후 안정성)가 높았기 때문에 해당 EV가 금 칩에 흡착되어 안정적으로 유지될 수 있었습니다. 약어: EV = 세포외 소포; OG = 옥틸 글루코시드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 원자력 현미경

1. 접촉 모드를 사용하여 공기 중의 바이오칩을 스캔하고 정량적 이미징 모드를 사용하여 액체 상태의 바이오칩을 스캔합니다.
2. 바이오칩을 유리 슬라이드(실험실에서 개발)의 마스크 상단에 정렬하여 바이오칩에서 각 마이크로스팟의 위치를 식별합니다(그림 6A).
   참고: 마스크에는 사용된 스팟터에 따른 리간드의 스팟 위치에 해당하는 스팟 표시가 포함되어 있습니다. 이 마스크는 두 개의 수직 쐐기가 칩을 배치 할 수있는 유리 슬라이드로 구성됩니다. 또한, 유리 슬라이드에는 칩의 스폿 위치 파악에 해당하는 16개의 펠트 도트가 표시되어 있어 투명도를 통해 스폿을 찾고 원하는 영역을 스캔할 수 있습니다.
3. 팁의 위치:
   1. AFM 상단의 CCD 카메라를 사용하여 스캔해야 하는 올바른 지점에 캔틸레버의 위치를 지정합니다. 이 프로토콜을 따르려면 길이 200μm, 너비 28μm, 스프링 상수 0.08N/m의 삼각형 캔틸레버를 사용하십시오.
4. 캔틸레버 상단의 레이저를 피드백 제어 메커니즘에서 최적의 응답을 제공하는 위치에 맞춥니다.
5. 스캔:
   1. 바이오칩 표면과 접촉하고 접촉하면 접촉 모드 또는 정량 이미징 모드에서 3-5개의 넓은 영역(일반적으로 10 × 10 μm²)에서 작은 영역(1 x 1 μm²)까지 AFM 수집을 시작합니다.
      참고: 스캔할 수 있는 다양한 영역의 표현이 그림 6D에 나와 있습니다. AFM 특성 분석이 전체 mm² 스폿을 대표하는지, 강력한 분석(각 조건에 대해 최소 300개의 EV를 계산 및 분석)을 위해 충분한 EV가 적절한 해상도로 시각화되는지 확인하고 계측 및 형태 측정을 수행합니다.
6. AFM 이미지 처리:
   1. 먼저 높이 채널을 선택하여 JPK 데이터 처리 소프트웨어로 AFM 이미지를 처리합니다.
   2. 각 선에서 뺄 다항식 피팅 을 선택하여 곧게 펴진 스캔 선을 얻습니다.
   3. 표면의 거칠기를 제거하기 위해 금 입자의 높이 임계값 을 선택합니다. 참조된 소프트웨어( 재료 표 참조)에서 입자 추출 모듈 내에서 8.5nm의 높이 임계값을 사용하여 입자를 표시합니다. 그레인이 필터링되면 그레인 수가 나타납니다.
      참고: 일반적으로 거친 금 기판(RMS ~3nm)과 화학 물질 및 리간드 층의 존재로 인해 임계값 을 8.5nm로 설정해야 합니다.
   4. 표시된 그레인의 여러 속성( 예: 높이, 부피, 지름)을 추출하려면 참조된 소프트웨어에서 이미지를 열고 데이터 처리 | 곡물 | 임계값으로 표시합니다.
   5. 속성 함수에서 필터 그레인을 선택합니다. 새 창이 나타나면 값 = 최대 z-최대, 표면 = 투영된 표면 A₀ 매개 변수를 선택합니다_. 그런 다음 기준 A와 B를 선택합니다.
   6. 개방 곡물 분포; 표시되는 창에서 [Value](최대), [Volume]([Base: 0]) 및 [Boundary](길이)를 선택합니다. 표시되는 테이블(.txt 형식)을 관찰하면 이미지당 설정된 임계값에서 감지된 모든 입자에 대한 높이, 부피 및 지름 값이 있는 세 개의 열이 표시됩니다.
   7. 높이 h와 지름 D에서 방정식 (1)⁸을 사용하여 각 EV의 곡률 반경 Rc를 계산한 다음 방정식 (2)를 사용하여 부피 V를 계산합니다.
      (1개)
      (2개)
   8. V에서 방정식 (3)을 사용하여 각 EV(동일한 부피를 가진 구의 직경)의 유효 직경 d _eff를 계산합니다.
      (3)
   9. EV의 크기(측정된 높이, 측정된 직경 및 계산된 유효 직경)를 보여주는 플롯 그래프로, 각 입자 계수는 점으로 표시됩니다.
      참고: 따라서 특성화가 끝나면 NBA 플랫폼은 생체 검출 신호의 상관 관계를 가능하게 한 다음 표현형을 EV 하위 집합의 수 및 크기와 함께 사용할 수 있습니다.

그림 6: AFM에 의한 바이오칩 특성 분석. SPRi 실험 후, 칩은 AFM 특성화를 위해 고정되고 건조되거나 액체로 유지되었습니다. (A) 가공된 유리 슬라이드(그림에 "w"로 표시된 두 개의 수직 위치 지정 쐐기 포함)는 16개의 바이오칩 마이크로어레이의 국소화가 있는 마스크 피팅을 제공합니다. AFM 특성 분석을 위해 유리 슬라이드를 설치하면 AFM 팁을 원하는 지점에 배치하여 특성을 분석할 수 있습니다. (B) 바이오칩을 "마스크" 슬라이드 상에 설치하고 완충액 한 방울 아래에 설치하여 액체 조건에서 스캔합니다. (C) 16개 마이크로어레이의 SPRi 이미지. (d) 직경 920 nm의 생체 기능화 보정 나노입자의 면역포획 후 광학 현미경으로 이미지화된 하나의 마이크로어레이. 흰색 사각형은 AFM 특성화를 강력하게 만들기 위해 각 관심 지점에서 AFM이 스캔한 다양한 영역의 샘플링을 나타냅니다. 스케일 바 = (C) 1mm, (D) 500μm. 약어: AFM = 원자력 현미경; SPRi = 표면 플라즈몬 공명 영상. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 라만 분광법

참고: 라만 분광법의 경우 기판으로 사용되는 유리 슬라이드를 라만 시그니처가 무시할 수 있는 CaF₂ 슬라이드로 교체합니다.

1. 획득을 위한 광학 조건:
   1. 라만 이미징 현미경에 대해 다음 조건을 설정합니다: 현미경 대물렌즈: 50x; 레이저 파장: 532nm; 레이저 출력: 10mW; 노출 시간: 500ms; 축적 수: 140; 스펙트럼 범위: 450 cm-1에서 3,200 ^cm-1.
      참고: 너무 많은 전력 및/또는 너무 긴 획득 시간을 사용하면 샘플이 손상될 수 있으며, 이는 시간이 지남에 따라 불안정한 스펙트럼으로 입증됩니다. 적은 양의 에너지로 시작하고 신호가 너무 약하면 이 값을 높입니다. 더 높은 레이저 파장(633nm, 785nm)을 사용하여 라만 측정에 해로운 형광을 줄일 수 있습니다. 그러나 파장의 4승에 따라 강도가 감소하므로 카메라의 스펙트럼 감도를 고려해야 합니다.
2. 라만 이미징:
   1. 먼저, 감소된 누적 수(10)로 라이브 스펙트럼을 관찰하여 신호 대 잡음비가 가장 좋은 영역을 찾습니다.
      알림: 고주파 영역(2,800-3,000cm-1)의 강한 신호는 이전에 표시된 것처럼 낮은 노출 시간으로 표면에서 EV를 쉽게 감지할 수 있습니다¹⁰.
   2. ROI가 선택되면 수집에 사용할 수 있는 시간에 따라 공간 해상도를 선택합니다.
      참고: 공간 분해능은 회절 한계(~500nm)에 의해 제한됩니다.
   3. 라만 매핑 수집을 시작합니다.
3. 데이터 전처리:
   1. Python 통합 개발 환경(IDE)(예: Spyder)을 사용하여 스펙트럼이 포함된 파일을 엽니다.
   2. 스펙트럼의 기준선을 빼서 가능한 형광으로 인한 간섭을 보정합니다. 예를 들어, 패키지 "irfpy"²³의 "arpls" 함수를 사용합니다. 매개변수 "lam"의 다른 값을 테스트하여 최상의 기준선 보정을 제공하는 값을 찾습니다(일반적으로 10³ 에서 10⁷ 사이).
   3. 예를 들어, 스펙트럼의 모든 강도를 2,900cm-1에서의 강도로 나누거나 스펙트럼의 평균을 뺀 다음 표준 편차로 나누어 스펙트럼을 정규화합니다("표준 정규 변량" 정규화).
      알림: 이 단계는 EV의 상대적인 분자 구성을 비교하는 데 필요합니다.

리간드 그라프팅을 위한 최적의 pH 조건 결정
바이오칩을 제조하는 데 사용되는 다양한 리간드는 pH 및 티올레이트 화학 층과 상호 작용할 수 있는 가용성의 함수로 테스트됩니다(그림 3). 리간드는 상이한 pH 값에서 아세테이트 완충액에 희석되고, C11C16 층으로 화학적으로 기능화된 바이오칩 상에 주입된다. 용액을 표면에 무작위로 주입하고 각 리간드 주입 후 세제(40mM에서 OG)를 주입하여 기준선을 회수합니다. 이 사전 농도 테스트를 통해 각 리간드 이식에 대한 최적의 pH를 결정할 수 있습니다. 도 3에 제시된 예에서, 리간드 그라프팅의 기울기 및 수준 측면에서 가장 좋은 pH로서 pH 6이 선택되었다.

SPRi CCD 이미지
SPRi 기계에 삽입한 후 바이오칩에 등록된 SPRi CCD 이미지(네이키드, 화학적 기능화 또는 프리젠테이션 마이크로어레이)가 그림 4에 나와 있습니다. 마이크로어레이 제시 바이오칩의 경우, 알부민 표면의 패시베이션 후 이미지를 촬영하였다. 스폿의 중복 또는 삼중이 칩 상에서 체계적으로 실현되었고, 음성 대조군도 칩에 자동으로 존재하였다. 음성 대조군은 주로 관련 없는 항체로 구성되었습니다. SPRi에서 바이오칩을 스포팅 없이 사용했을 때(네이키드 골드에 흡착하거나 화학적으로 기능화된 바이오칩에 EV를 직접 접목하기 위해) ROI는 감지 영역에서 임의로 선택되었습니다. 예를 들어, 그림 4C 는 EV를 주입하기 전에 네이키드 골드 칩에서 선택한 ROI를 보여줍니다.

이 SPRi CCD 이미지 덕분에 접목 중에 이러한 문제가 나타나면 특정 지점을 무시할 수 있습니다. 또한 SPRi CCD 이미지를 통해 스팟 내부 그라프팅의 균질성을 추정할 수 있고, 동일한 리간드의 서로 다른 스팟 간 그라프팅의 재현성을 보장하며, 마지막으로 표면 밀도 측면에서 동등한 어레이에서 EV 생체 검출이 진행되도록 합니다.

SPRi 결과
ROI를 선택하면 기준선이 안정적이어서 시료를 주입할 수 있습니다. 그림 5 는 다중화된 바이오칩에서 얻은 다양한 결과를 보여주며, 특정 면역어레이에 대해 높은 신호 대 잡음비를 보여줍니다(반사율 신호는 음성 대조군의 반응이 0.02%인 것에 비해 항CD41에서 1.4%임). 도 5B 는 EV 샘플을 네이키드 골드 칩 상에 주입한 후 얻어진 EV 흡착에 대한 결과를 나타낸다. N-PEVs 샘플은 혈소판에서 추출되었습니다. 용액을 22°C에서 15분 동안 3,000 × g 에서 원심분리하였다; 이어서, 상청액을 22°C에서 15분 동안 20,000 × g 에서 다시 원심분리하였다. 생성된 펠렛을 완충액에 재현탁시켰다. 면역포획된 N-PEV에서 얻은 SPRi 결과를 웨스턴 블롯(WB) 결과와 비교했습니다. WB는 해당 샘플에서 CD41, CD62P 및 CD9의 강력한 발현을 밝혀 SPRi 결과와 좋은 상관 관계를 강조했습니다(보충 그림 S1).

도 5B는 인간 일차 유방 상피 세포(HMEC)로부터 EV 샘플을 네이키드 골드 칩 상에 주입한 후 얻어진 EV 흡착에 대한 결과를 나타낸다. HMEC 세포 배양액을 3,650 × g에서 10 분 동안 원심 분리한 후, 상층액을 4°C에서 30 분 동안 10,000 × g에서 다시 원심분리하였다. 얻어진 펠렛을 1x PBS 완충액에 재현탁하여 세척하고, 4°C에서 30분 동안 다시 10,000×g에서 원심분리를 수행하였다. 마지막으로, 펠렛을 1x PBS 완충액에 현탁시켰다.

AFM 특성화
SPRi 실험 및 바이오칩에 EV 로딩(흡착, 접목 또는 친화성 캡처)한 후, AFM은 방법론에 따라 큰 스캔(10 x 10μm²)을 스캔한 다음 (~10 이상) 작은 스캔(수 μm²)을 스캔했습니다. 그림 7 은 바이오칩에서 EV의 대규모 및 소규모 AFM 이미지의 예를 보여줍니다.

그림 7: 바이오칩에서 EV의 AFM 특성화. 건조된 샘플의 접촉 모드에서 얻은 이미지. (A) 칩에 대한 mm² ROI의 대표적인 보기를 제공하는 큰 스캔 영역의 한 예. 이 결과는 화학적으로 변형된 표면에 EV를 공유 접목한 후에 얻어졌다. (B) 면역어레이 상에서 EV를 포획한 후 얻어진 큰 스캔 영역의 또 다른 예. (C) 물체를 자세히 관찰하여 고해상도를 얻고 EV의 계측(높이 및 직경)을 가능하게 합니다. (D) 3D 기울어진 이미지를 갖는 (A)의 이미지에서 바이오칩을 자세히 본 것. (E) 기울어진 3D 이미지에서 벌거벗은 금 바이오칩에 흡착된 하나의 대형 EV를 확대한 모습. Z 스케일은 (A, B) 30nm 및 (C) 20nm입니다. 스케일 바 = (A, B) 2 μm, (C) 500 nm. 약어: AFM = Atomic Force Microscopy; EVs = 세포외 소포체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Gwyddion 분석
Gwyddion 소프트웨어는 AFM 이미지의 모든 배치에서 시각화된 각 소포에 대한 데이터를 처리하는 데 사용되었습니다. 먼저, 칩 상의 mm² ROI의 대표적인 보기를 보여주는 넓은 영역(10 x 10 μm² 범위)을 스캔하였다. 그림 7A의 이미지는 표면이 물체로 조밀하게 덮여 있음을 보여줍니다. 이 경우, EV(소 우유에서)를 2.5 × 1010/mL로 활성화된 티올 기능화 칩에 주입했습니다. 샘플에서 카제인을 제거한 후, Amicon 100kDa 원심 필터 유닛을 사용하여 4,000 × g 및 20 °C에서 원심 분리하여 유청 상청액을 농축하고, 수크로오스 구배 초 원심 분리 접근법을 사용하여 EV를 분리했습니다. 이 결과는 화학적으로 변형된 표면에 공유 접목된 EV에 해당합니다. 도 7B는 면역어레이 상에서 EVs의 포획 후에 얻어진 큰 스캔 영역의 또 다른 예를 나타낸다. 여기에서도 물체가 표면에 존재했지만 EV가 칩에 공유 결합되었을 때보다 덜 조밀한 커버리지를 보여주었습니다. 그림 7C에서 ROI의 여러 위치에서 자세히 살펴보면 EV의 고분해능과 계측(높이 및 직경)이 가능합니다. 3D 기울어진 이미지와 함께 그림 7A에 표시된 바이오칩의 또 다른 자세히 보기(그림 7D)는 소포이지만 필라멘트(왼쪽 상단)인 물체를 보여줍니다. 실제로, 면역칩은 EV 하위 집합의 선택적 및 차등 캡처를 가능하게 하는 반면, 공유 이식은 샘플에 존재하는 유리 아민 그룹이 있는 모든 개체를 이식합니다. 그림 7E에서 AFM은 벌거벗은 금에 흡착된 HMEC 배양에서 하나의 대형 EV를 보여줍니다. 따라서 AFM은 소형에서 대형 EV까지 표시하고 측정할 수 있으며 각 EV의 시각화를 허용하여 mm²당 물체 수를 계산하는 데 도움이 됩니다.

각 EV의 측정된 높이와 직경을 결정하여 유효 직경을 얻었습니다. EV 높이는 10nm에서 50nm 범위이며 평균 15nm입니다. 측정된 EV 직경은 50nm에서 300nm까지의 범위를 포함했으며 평균은 100nm였습니다. 우리는 EV의 유효 직경이 30nm에서 300nm 사이이며 대부분이 약 60nm임을 관찰했습니다(그림 8A). 이러한 측정은 액체에서 또는 고정 및 건조 후에 수행되었습니다. 도 8B 는 이들 두 조건에서 얻어진 결과가 비교 가능하다는 것을 보여준다.

그림 8: 바이오칩에서 EV의 AFM 특성화에 의해 생성된 결과. (A) 8.5nm의 임계값으로 2.5 ×10/mL의 EV 샘플을 주입한 후 한 지점에서 EV의 계측(항CD41 면역어레이). "유효 계산 직경"이 표시되며, 각 점은 AFM 이미지에서 시각화 된 입자에 해당합니다. (B) EVs의 유효 직경의 분포를 보여주는 (A)의 데이터로부터 생성된 히스토그램. 공기(빨간색: 샘플 고정 및 건조) 및 액체(파란색: 고정되지 않음)에서 얻은 결과. 약어: AFM = 원자력 현미경; EVs = 세포외 소포체 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

AFM에 의한 N-PEV 분석을 NTA 결과와 비교하였다. NTA의 마지막 "용액 내" 결과는 32nm에서 650nm까지의 EV 직경 분포를 보여주었으며 대부분은 직경이 90nm에서 250nm 사이였습니다. 따라서 NTA가 작은 크기(50nm에 가까움)에 민감하지 않다는 점을 고려하면 이러한 AFM 측정은 이러한 결과와 좋은 상관관계를 보여줍니다(보충 그림 S2).

네이키드 칩에 흡착된 EV에서 실현된 라만 실험은 고무적인 결과를 보여주었습니다. 구체적으로, EV의 명확한 스펙트럼이 얻어졌다 (그림 9). 라만 스펙트럼은 세 가지 범위로 구분할 수 있습니다 : 분자 특이 적 패턴을 형성하는 피크를 포함하는 "지문"영역 (1,800cm-1 미만)은 식별 목적으로 가장 중요한 부분입니다. "생체 침묵"영역 (1,800-2,800 cm-1)은 피크를 포함하지 않기 때문에 생물학적 샘플을 연구 할 때 일반적으로 폐기됩니다. 그리고 "고주파" 영역은 주로 지질에 대한 정보를 포함하고 종종 스펙트럼에서 가장 강렬한 부분이지만 덜 구체적입니다. 스펙트럼은 주로 CH 2 진동 (2,853 cm-1, 1,444 cm-1 및 130 cm-1)에 해당하는 피크를 나타내며, 이는 EV 막의 지질과 페닐알라닌 아미노산21에 해당하는 피크와 관련이 있습니다. EV에 존재하는 공통 분자의 라만 피크 할당 표는 Penders et al.22의 논문에서 찾을 수 있습니다.

그림 9: 바이오칩에서 EV의 라만 분광법 특성화. 여기서, EV 샘플은 HMECculture에서 추출되었으며 20,000 × g에서 원심분리에 의해 회수되었습니다. (A) 노출된 바이오칩(평균 강도)에 흡착된 EV의 라만 이미지의 예로, 명시야 이미지에 오버레이됩니다. (B) EV의 측정된 라만 스펙트럼의 예. 점선은 식별된 진동에 해당합니다. α, 가위질; τ, 비틀림; υ, 스트레칭 (s, 대칭, as, 비대칭). 스케일 바 = (A) 50 μm. 약어: EVs = 세포외 소포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S1: N-PEV의 나노입자 추적 분석(NTA) 측정. EV는 PBS로 희석되었습니다. 실험은 MALVERN 기기 NS300을 사용하여 세 번 수행되었습니다. 평균 직경 = 137.5 nm ± 1.3 nm; 모드 직경 = 104.9 nm ± 13.3 nm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S2: N-PEV의 웨스턴 블롯 분석. N-PEV (1) 및 (2)는 2개의 혈소판 농축액 포켓으로부터 제조된 N-PEV의 2개 배치에 해당한다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.