SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인을 표시하는 외막 소포를 기반으로 하는 "플러그 앤 디스플레이" 나노입자 백신 플랫폼

요약

본 프로토콜은 외막 소포의 생명공학을 생산, 정제, 생체접합 및 특성화를 포함하는 "플러그 앤 디스플레이" 백신 플랫폼으로 설명합니다.

초록

박테리아 또는 바이러스로부터 얻은 생체 모방 나노 입자는 백신 연구 및 개발에 상당한 관심을 끌었습니다. 외막 소포(OMV)는 평균 성장 동안 주로 그람 음성 박테리아에 의해 분비되며, 나노 크기의 직경과 자가 보조 활성을 가지고 있어 백신 전달에 이상적일 수 있습니다. OMV는 단백질, 핵산 및 소분자에 대한 다면적 전달 시스템으로 기능했습니다. OMV의 생물학적 특성을 최대한 활용하기 위해 생체 공학 대장균 유래 OMV를 운반체로, SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인(RBD)을 항원으로 활용하여 "플러그 앤 디스플레이" 백신 플랫폼을 구축했습니다. 스트렙토코커스 화농성 내의 SpyCatcher (SC) 및 SpyTag (ST) 도메인을 접합체 OMV 및 RBD에 적용하였다. Cytolysin A (ClyA) 유전자는 플라스미드 형질 감염 후 융합 단백질로서 SC 유전자와 함께 번역되어 OMV 표면에 반응 부위를 남겼습니다. 종래의 완충 시스템에서 RBD-ST를 밤새 혼합한 후, OMV와 RBD 사이에 공유 결합이 형성되었다. 따라서, 다가 표시 OMV 백신이 달성되었다. OMV 백신 플랫폼은 다양한 항원으로 대체함으로써 다양한 이종 항원을 효율적으로 표시하여 잠재적으로 전염병 전염병을 신속하게 예방할 수 있습니다. 이 프로토콜은 생산, 정제, 생체 접합 및 특성화를 포함하여 OMV 백신 플랫폼을 구성하는 정확한 방법을 설명합니다.

서론

잠재적인 백신 플랫폼으로서 외막 소포(OMV)는^{최근 몇 년} 동안 점점 더 많은 관심을 끌고 있습니다^1,2. 주로 그람 음성 박테리아³에 의해 자연적으로 분비되는 OMV는 일반적으로 20-300 nm⁴ 크기의 지질 이중층으로 구성된 구형 나노 스케일 입자입니다. OMV에는 박테리아 항원 및 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)을 포함한 다양한 모 박테리아 구성 요소가 포함되어 있으며, 이는 고체 면역 강화제^역할을 합니다5. OMV는 고유한 구성 요소, 천연 소포 구조 및 우수한 유전 공학 변형 부위의 이점을 활용하여 박테리아 백신⁶, 보조제⁷, 암 면역 요법 약물⁸, 약물 전달 벡터⁹ 및 항균 접착제¹⁰을 포함한 많은 생물 의학 분야에서 사용하기 위해 개발되었습니다.

2020년부터 전 세계적으로 확산된 SA....

프로토콜

1. 플라스미드 구성

1. SpyCatcher 서열을 코딩하는 DNA (보충 파일 1)를 BamH I 및 Sal I 부위 사이의 암피실린 내성 pThioHisA-ClyA 플라스미드 (재료 표 참조)에 삽입하여 이전에 발표 된 보고서²⁰에 따라 플라스미드 pThioHisA ClyA-SC를 구축합니다.
2. 합성된 SpyTag-RBD-Histag 융합 유전자(보충 파일 1)를 BamH I 및 EcoR I 부위 사이의 pcDNA3.1 플라스미드( 재료 표 참조)로 라이게이트하여 이전에 공개된 보고서¹⁹에 따라 플라스미드 pcDNA3.1 RBD-ST를 구축합니다.

2. OMV-SC 준비

1. 아래 단계에 따라 ClyA-SC 변환을 수행합니다.
   1. 50μL의 BL21 적격 균주에 5μL의 pThioHisA ClyA-SC 플라스미드 용액(50ng/μL)을 추가하고 부드럽게 불어넣고 얼음에서 30분 동안 식힙니다.

결과

이 프로토콜의 순서도는 그림 1에 나와 있습니다. 이 프로토콜은 OMV를 백신 플랫폼으로 활용하는 일반적인 접근 방식일 수 있습니다. 항원의 유형에 따라 적절한 발현 시스템을 선택하기 만하면됩니다.

도 2는 실현 가능한 플라스미드 설계 스킴을 제공한다. SC 유전자는 유연한 링커를 통해 ClyA 유전자와 연결되고, ST는 정제 및 검증을 위해 His-tag 유전자로 RBD 유전자의 5' 말단에 연결됩니다. 웨스턴 블롯은 OMV-SC가 증가함에 따라 반응이 점진적으로 완료되는 것을 보여주었다(도 3A). 초원심분리 후, 거의 모든 미반응 RBD-ST가 상청액에 남아있었다. 두 번째 초원심분리는 첫 번째 시간에 비해 더 유의한 이점을 제공하지 않았습니다(그림 3B).

토론

"플러그 앤 디스플레이" 나노입자 백신 플랫폼을 만들기 위해 SC 융합 ClyA는 단백질 발현²⁴의 장점으로 인해 재조합 단백질 생산에 가장 널리 사용되는 모델 중 하나인 BL21(DE3) 균주에서 발현되어 박테리아 증식 과정에서 OMV 표면에 충분한 SC 단편이 표시됩니다. 동시에, 항원과 OMV 사이의 화학적 결합을 위해 ST-융합 표적 항원을 제조하였다. 이 실험 계획의 장점과 향후 적용 전망은 주로 세 가지 측면에 반영됩니다. 첫째, 서로 다른 항원과 생물학적 나노 입자의 "플러그 앤 디스플레이"시스템이 실현됩니다. 반응 및 정제 과정은 빠르고 간단할 수 있으며, 이는 신흥 전염병 및 기타 시나리오에 대한 백신 개발에 상당한 이점이 있습니다. 둘째, 고밀도 항원 표시의 목표를 달성하고 면역원성이 낮은 일부 항원에 대한 백신 설계 방법을 제공합니다. 셋째, OMV 및 RBD(항원 단백질)의 개별 발현은 기존의 원핵생물 발현 시스템이 특정 보조 인자, 분자 샤페론 및 번역 후 변형과.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
암피실린 나트륨	Sangon Biotech	A610028
자동 세포 계수기	Countstar	BioTech
BCA 단백질 정량 키트	cwbio	cw0014s
ChemiDoc Touching 이미징 시스템	Bio-rad
Danamic 광 산란	Malvern	Zetasizer Nano S90
전기영동 장치	Cavoy	Power BV
EZ-Buffers H 10X TBST Buffer	Sangon Biotech	C520009
Goat pAb to mouse IgG1	Abcam	ab97240
High speed freezing centrifuge	Bioridge	H2500R
His-Tag mouse mAb	Cell signaling technology	2366s
Imidazole	Sangon Biotech
이소 프로필 베타 -D- 티오 갈라 락토피라 노시드	Sangon Biotech	A600118
Ni-NTA His-Bind Superflow	Qiagen	70691
무 지방 분유	Sangon Biotech	A600669
OPM-293 세포 배양 매체	Opm biosciences	81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST 플라스미드	우한 genecreat 생물 공학,
인산염 완충액, 식염수	ZSGB-bio	ZLI-9061
폴리 에틸 레니민, 선형	Polysciences,	23966-1
Prestained protein ladder	Thermo	26616
pThioHisA, ClyA-SC 플라스미드	무한 genecreat, 생물 공학,
PVDF, Western Blotting Membranes	Roche
Quixstand 탁상용 시스템(100kD 중공사 컬럼)	GE healthcare
SDS-PAGE 로딩 버퍼(5개)	Beyotime	P0015
염화나트륨	Sangon Biotech	A100241
Supersignal west pico PLUS(향상된 화학발광 솔루션)	Thermo	34577
서스펜션 기기	라이프 테크놀로지	훌라 믹서
투과 전자 현미경	히타치	HT7800
트립톤	옥소이드	LP0042B
초원심분리기	벡크만 쿨터	XPN-100
자외선 분광 광도계	히타치	U-3900
효모 추출물	Sangon Biotech	A610961

A600277, , , , , , , , 03010040001