여기에서는 생체 내 갈색 지방 조직의 총 지방산 de novo 지방 형성 분석을 위해 산화중수소 및 가스 크로마토그래피 질량분석법(GCMS)을 활용하는 저렴한 정량 분석법을 제시합니다.
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방법 논문
산화중수소를 사용한 갈색 지방 조직에서 de novo 지방산 합성의 정량적 측정
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
지방산 합성은 전신 대사 항상성 및 기타 생리학적 및 병리학적 과정을 제어하는 데 중요한 기능적 역할을 하는 복잡하고 에너지가 많이 필요한 대사 경로입니다. 포도당 처리와 같은 다른 주요 대사 경로와 달리 지방산 합성은 일상적으로 기능적으로 평가되지 않아 대사 상태에 대한 불완전한 해석으로 이어집니다. 또한 해당 분야의 신규 이민자에게 적합한 공개적으로 사용 가능한 세부 프로토콜이 부족합니다. 여기에서는 생체 내 갈색 지방 조직에서 총 지방산 de novo 합성 분석을 위해 산화중수소 및 가스 크로마토그래피 질량분석법(GCMS)을 활용하는 저렴한 정량 분석법을 설명합니다. 이 방법은 탄소원과 독립적으로 지방산 합성효소 생성물의 합성을 측정하며, 거의 모든 조직, 모든 마우스 모델 및 외부 섭동 하에서 잠재적으로 유용합니다. GCMS 및 다운스트림 계산을 위한 샘플 준비에 대한 세부 정보가 제공됩니다. 우리는 높은 수준의 de novo 지방산 합성과 대사 항상성 유지에 중요한 역할로 인한 갈색 지방 분석에 중점을 둡니다.
서론
비만과 관련 대사 질환은 현재와 미래 세대를 위험에 빠뜨리는 전염병이다 1,2. 일반적으로 에너지 섭취와 소비 사이의 불균형의 결과로 단순화되는 비만과 관련된 대사 조절 장애는 환경 및 내인성 요인에 의해 조절되는 많은 대사 경로에 영향을 미친다3. 그러나 대사 조절 장애의 동물 모델에서 일상적으로 테스트되는 경로는 소수에 불과합니다.
예를 들어, 포도당 폐기는 포도당 및 인슐린 내성 검사에 의해 일상적으로 측정되는데, 이는 휴대용 혈당 모니터의 사용이 간편하기 때문일 수 있다4. 전신 포도당 및 지질 산화 상대 속도는 또한 간접 열량계 분석의 호흡 교환 비율을 기반으로 일상적으로 추정됩니다 5,6. 그러나 신진대사의 다른 모든 측면의 대부분은 일상적으로 기능적으로 평가되지 않습니다. 이로 인해 신진대사 상태에 대한 불완전한 해석과 치료 옵션을 놓치게 됩니다. 이러한 주요 경로 중 하나는 de novo lipogenesis입니다.
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프로토콜
모든 실험은 신시내티 아동 병원 메디컬 센터(Cincinnati Children's Hospital Medical Center)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.
1.D2O의 제조
알림: 실험 변동을 피하려면 실험 기간 동안 모든 마우스에 충분한 용액/식수를 준비하십시오.
- 복강 내 주사의 경우: D 2 O 리터당 9g의 NaCl을 용해시켜 0.9% w/v 식염수 D 2 O를 생성합니다.비발열성0.2μm 필터를 통해 여과하여 멸균합니다.
- D 2 O- 물 : 일반 음용수 920 mL 당80 mL의 D 2 O를 혼합하여 식수로 사용할 8 % v / v D2O 농축수를 생성합니다. 일반 식수는 마우스 시설에서 얻을 수 있습니다. 비발열성 0.2μm 필터를 통해 여과하여 살균합니다.
2. 온도 순응에 의한 BAT 활성 조절
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결과
1단계에서 설명한 D 2 O 투여량에 따라 일반적으로 체수가2.5%에서 6% 범위로 농축되고 체수분 내 중수소 농축의 기준 수준이 1시간 내에 빠르게 달성되고 8% 농축 음용수를 통해 연구 기간 동안 유지됨을 알 수 있습니다(그림 1). 지속적인 정상 상태 체수 농축은 6단계에서 사용된 계산의 가정이므로 새로운 실험 모델에서 체수 농축 역학의 실험적 검증을 권장합니다.
우리는 de novo 합성 지방산의 양이 BAT의 열중성에 비해 실온에서 증가한다는 것을 발견했습니다(그림 2). D2O투여 3일 후 열중성 및 실온에서 마우스의 BAT에서 팔미테이트의 질량 동위원소 분포는 실온에서 더 높은 M1 및 M2 중수소 농축을 보여줍니다(그림 2A). 이러한 .......
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토론
복잡한 대사 경로 간의 균형과 상호 작용을 이해하는 것은 대사 관련 질병의 생물학적 기초를 이해하는 데 없어서는 안될 단계입니다. 여기에서, 우리는 de novo 지방산 합성의 변화를 결정하기 위한 비침습적이고 저렴한 방법론을 보여줍니다. 이 방법은 지방산 중수소 농축(31)으로부터 새로운 합성 플럭스를 추정하기 위한 계산과 체수(39)에서D2O의 상대적 백분율을 결정하기 위한 중수소-아세톤 교환을 사용하기 위한 계산을 개발한 이전에 발표된 방법으로부터 채택된 것이다. 최근 몇 년 동안 우리는 여기에 설명 된 방법을 사용하여 지방 저장소, 뇌, 간 및 종양에서 다양한 지방산 합성의 변화를 밝히는 데 적용했습니다 9,22,40. .......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
귀중한 토론을 해주신 Sanchez-Gurmacches와 Wallace 연구실 구성원에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 심장 협회(18CDA34080527 JSG 및 19POST34380545 - RM), NIH(R21OD031907 - JSG), CCHMC Trustee Award, CCHMC Center for Pediatric Genomics Award, CCHMC Center for Mendelian Genomics & Therapeutics Award의 보조금으로 지원되었습니다. 이 연구는 신시내티에 있는 소화기 질환 연구 핵심 센터의 NIH P30 DK078392에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. RT와 MW는 UCD Ad Astra Fellowship의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 4mL 유리 바이알 | Fisher Scientific | 14-955-334 | |
| 0.2 &마이크로; m 필터 | Olympus 플라스틱 | 25-244 | |
| 26G 니델 주사기 | BD | 309597 | |
| 아세톤 | Merck | 34850 | |
| 아세토니트릴 | Merck | 900667 | |
| Blue GC 나사 캡(격막 포함 | Agilent | 5190-1599 | |
| 원심분리기 | Eppendorf | 5424R | |
| 클로로포름 | 시그마 | 366927 | |
| 중수소 산화물 | 시그마 | 151882 | |
| Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) FAME 컬럼 선택 | Merck | B1378 | |
| Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) FAME 컬럼 선택 | Agilent | CP7419 | |
| EDTA 튜브 | Sarstedt | 411395105 | |
| Ethanol | Merck | 51976 | |
| Hexadecenoic-d31 Acid | Larodan | 71-1631 | |
| Hexane | Merck | 34859 | |
| 메탄올 | Merck | 34860 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브 | Olympus 플라스틱 | 24-282 | |
| 마우스 환경 챔버 | Caron | Caron Caron 7001-33 | |
| 염화칼 | 피셔 생물 시약 | BP366-500 | |
| 인산칼 | MP Biomedicals | 194727 | |
| SafeLock 마이크로 원심분리기 튜브 | Eppendorf | 30120086 | |
| Screw top amber GC 바이알 | Agilent | 5182-0716 | |
| 염화나트륨 | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
| 수산화나트륨 | Merck | S5881 | |
| 인산나트륨, 이염기 | 성 피셔 생물 시약 | BP332-500 | |
| 황산나트륨 | 머크 | 239313 | |
| 황산 | 머크 | 258105 | |
| 바이알 인서트 | 애질런트 | 5183-2088 |
참고문헌
- The Lancet, Diabetes Endocrinology. Childhood obesity: a growing pandemic. The Lancet. Diabetes & Endocrinology. 10 (1), 1(2022).
- Gonzalez-Muniesa, P., et al. Obesity. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17034(2017).
- Müller, T. D., Blüher, M.....
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재인쇄 및 허가
