여기에 제시된 것은 대장 균 BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD 및 ΔrecB)의 엑소 뉴 클레아 제 V 녹아웃 균주로부터 세포 추출물의 제조 및 완충액 교정을위한 프로토콜입니다. 이것은 선형 DNA 주형을 사용하는 무세포 단백질 합성 시스템에서 발현을 위한 빠르고 쉽고 직접적인 접근 방식입니다.
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방법 논문
선형 DNA 주형을 활용한 엑소뉴클레아제 결핍 세포 추출물의 무세포 단백질 합성
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
무세포 단백질 합성(CFPS)은 최근 수많은 장점으로 인해 합성 생물학 분야에서 매우 인기를 얻고 있습니다. CFPS에 선형 DNA 템플릿을 사용하면 클로닝, 형질 전환 및 플라스미드 추출 단계를 제거하여 실험 시간을 단축하여 기술이 잠재력을 최대한 발휘할 수 있습니다. 선형 DNA는 PCR에 의해 빠르고 쉽게 증폭되어 고농도의 주형을 얻을 수 있으므로 잠재적인 생체 내 발현 독성을 피할 수 있습니다. 그러나, 선형 DNA 주형은 세포 추출물에 자연적으로 존재하는 엑소뉴클레아제에 의해 빠르게 분해된다. 이 문제를 해결하기 위해 뉴클레아제 억제제를 추가하거나 보호를 위한 선형 DNA 말단의 화학적 변형과 같은 몇 가지 전략이 제안되었습니다. 이러한 모든 전략은 추가 시간과 자원을 소비하며 아직 플라스미드에 가까운 수준의 단백질 발현을 얻지 못했습니다. CFPS에 선형 DNA 템플릿을 사용하기 위한 대체 전략에 대한 자세한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다. 엑소뉴클레아제 결핍 녹아웃 세포의 세포 추출물을 사용하면 선형 DNA 주형이 최종 변형 없이 그대로 유지됩니다. 우리는 선형 DNA에 대해 특히 Mg-글루타메이트 (Mg-glu) 및 K- 글루타메이트 (K-glu)에 대한 초음파 용해 및 완충액 보정에 의한 대장균 BL21 Rosetta2 ΔrecBCD 균주에서 세포 용해물의 준비 단계를 제시합니다. 이 방법은 대장균 CFPS의 플라스미드 DNA와 유사한 단백질 발현 수준을 달성할 수 있습니다.
서론
무세포 단백질 합성(CFPS) 시스템은 바이오센서 엔지니어링, 분산 제조 및 유전자 회로의 프로토타이핑을 위한 빠르고 간단하며 효율적인 방법으로 점점 더 많이사용되고 있습니다1. CFPS 시스템은 큰 잠재력으로 인해 합성 생물학 분야에서 정기적으로 사용됩니다. 그러나 지금까지 CFPS 시스템은 기술이 잠재력을 최대한 발휘하는 것을 제한할 수 있는 원형 플라스미드에 의존합니다. 플라스미드 DNA를 준비하는 것은 클로닝 및 다량의 DNA 분리 중 많은 시간이 소요되는 단계에 따라 달라집니다. 반면에, 플라스미드 또는 합성된 DNA 주형으로부터의 PCR 증폭은 몇 시간 내에 CFPS 주형을 간단히 제조하는데 사용될 수 있다(2,3). 따라서 선형 DNA의 적용은 CFPS에 대한 유망한 솔루션을 제공합니다. 그러나, 선형 DNA는 세포 추출물4에 자연적으로 존재하는 엑소뉴클레아제에 의해 빠르게 분해된다. λ- 파지 GamS 단백질5 또는 카이 사이트6을 포함하는 DNA를 보호제로 사용하거나 말단....
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프로토콜
1. 배지 및 완충액 준비
- 2xYT+P 배지(고체 및 액체)의 제조
- 표 1에 설명된 대로 액체 및 고체 매체를 준비한 다음 고압멸균으로 멸균합니다.
참고: 이 프로토콜에는 클로람페니콜(10μg/mL)을 포함하는 2xYT+P 한천 플레이트 1개가 필요합니다. 액체 매체의 부피는 필요한 용해물의 부피에 비례합니다. 여기서, 5 L의 액체 2xYT+P 매체의 시작 부피가 사용된다. 그러나 1L의 세포 배양이 2 내지 3mL의 최종 세포 용해물을 생성한다는 것을 알고 필요에 따라 부피를 조정할 수 있습니다.
- 표 1에 설명된 대로 액체 및 고체 매체를 준비한 다음 고압멸균으로 멸균합니다.
- 클로람페니콜의 제조 (34 mg / mL)
- 클로람페니콜 0.34g을 달아서 에탄올 10mL를 넣고 혼합하여 녹인다. 각각 1 mL를 여러 개의 튜브에 분취하고, 나중에 사용하기 위해 -20°C에서 보관한다.
- S30A 완충액의 제조
- 이 버퍼의 2L를 목표로 표 2에 따라 S30A 버퍼를 준비합니다.
참고: 다시 한번,이 완충액의 부피는 필요한 용해물의 부피에 비례합니다. - 오토클레이빙하기 전에 빙초산을 사용하여 완충액의 pH를 7.7로 조정합니다.....
- 이 버퍼의 2L를 목표로 표 2에 따라 S30A 버퍼를 준비합니다.
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결과
대표적인 결과는 선형 및 플라스미드 DNA에 대해 별도로 최적의 Mg-글루타메이트 및 K-글루타메이트 수준에 대한 용해물을 보정한 후 여기에 표시됩니다(그림 1). Mg- 글루타메이트 최적 농도는 8mM에서 Δ recB 및 ΔrecBCD 추출물에서 유사합니다 (그림 1B). 그러나 플라스미드 DNA에 대한 최적의 K- 글루타메이트 농도는 140mM인 반면, 동일한 추출물에 대한 선형 DNA의 최적 K- 글루타메이트 농도는 20mM입니다 (그림 1C). WT 및 ΔrecBCD 세포로부터의 추출물에서의 GFP 발현의 비교 분석에서, 추출물의 완충액 조성은 엑소뉴클레아제 V 결실 추출물에 사용된 선형 및 플라스미드 DNA로부터 최적의 발현을 위해 특이적으로 보정되어야 한다는 것을 알 수 있었다.
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토론
여기에서 우리는 recB 또는 recBCD 오페론에 대한 게놈 녹아웃을 가진 대장균 BL21 Rosetta2에서 준비된 세포 용해물이 선형 DNA 주형에서 높은 단백질 발현을 지원한다는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜은 선형 DNA 템플릿에 특이적인 단계별 용해물 보정 절차(그림 2)를 정교하게 설명하며, 이는 선형 DNA의 σ70 프로모터에서 높은 발현을 유도하여 등몰 DNA 농도에 대한 플라스미드 근처 수준에 도달하는 중요한 단계입니다. 이 프로토콜은 최종 응용 분야에서 사용되는 DNA 유형(선형 또는 플라스미드)에 따른 버퍼 교정의 중요성을 강조합니다.
이 프로토콜은 플라스미드 클로닝을 방지하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 시간과 비용면에서 상당한 이점을 제공합니다. 선형 DNA 단편은 상업적 제공자에 의해 합성되거나 실험실에서 PCR에 의해 증폭될 수 있다. 플라스미드 .......
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감사의 글
ACB와 JLF는 ANR SINAPUV 보조금(ANR-17-CE07-0046)의 자금 지원을 인정합니다. JLF와 JB는 ANR SynBioDiag 보조금(ANR-18-CE33-0015)의 자금 지원을 인정합니다. MSA와 JLF는 ANR iCFree 보조금(ANR-20-BiopNSE)의 자금 지원을 인정합니다. JB는 "COMPUCELL"(보조금 번호 657579)을 시작하는 ERC의 지원을 인정합니다. Centre de Biochimie Structurale은 프랑스 통합 구조 생물학 인프라 (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01)의 지원을 인정합니다. MK는 INRAe의 MICA 부서, Université Paris-Saclay, Ile-de-France (IdF) 지역의 DIM-RFSI 및 ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003)의 자금 지원을 인정합니다. 이 연구는 유럽 연구위원회 통합 상 (865973 CLB)을 통한 자금 지원으로 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2-YT Broth | Invitrogen | 22712020 | |
| 1.5 mL Safe-Lock 튜브 | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL 마이크로튜브 |
| 384웰 정사각형 바닥 마이크로플레이트 | Thermo Scientific Nunc | 142761 | |
| 3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium) | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| adhesive plate seal | Thermo Scientific Nunc | ||
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| ATP (아데노신 5'-트리포스페이트 디소듐 염 수화물) | 시그마-알드리치 | A8937 | |
| BL21 로제타2 머 | 크 밀리포어 | 71402 | |
| BL21 로제타2 &델타; recB | Addgene | 176582 | |
| BL21 Rosetta2 Δ recBCD | Addgene | 176583 | |
| cAMP (아데노신 3' 5'-사이클릭 모노포스페이트) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| 클로람페니콜 | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| CoA(코엔자임 A 수화물) | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| Corning 15mL PP 원심분리기 튜브, CentriStar 캡이 포함된 랙 포장, 멸균 | Corning | 430790 | 15mL 튜브 |
| Corning 50mL PP 원심분리기 튜브, CentriStar 캡이 있는 원뿔형 바닥, 멸균 | 코닝 | 430828 | 50mL 튜브 |
| CTP(시티딘 5'-트리포스페이트, 이나트륨염) 수화물) | Alfa Aesar | J62238 | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| DTT (DL-디티오트레이톨) | 시그마-알드리치 | D0632 | |
| 폴린산 (고체 폴린산 칼슘염) | 시그마-알드리치 | F7878 | |
| GTP (구아노신 5?-삼인산, 디소듐 솔트) | 시그마-알드리치 | 371701 | |
| 헤페스 | 시그마-알드리치 | H3375 | |
| K 인산염 이염기성 (K2HPO4) | Carl Roth | 231-834-5 | |
| K 인산 모노베이직 (H2KO4P) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| K-글루타메이트 | Alfa Aesar | A17232 | |
| Mg-글루타메이트 | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Millex-GP 주사기 필터 유닛, 0.22 &마이크로; m, 폴리 에테르 설폰 | Merck Millipore | SLGP033RB | 막 필터 0.22 µ m |
| 모나크 PCR & DNA 클린업 키트 | NEB | T1030S | PCR 및 DNA 정리 키트 |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Plasmid Miniprep Kit |
| NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate) | 시그마-알드리치 | N6522 | |
| NIST-추적 가능한 FITC 표준 | Invitrogen | F36915 | NIST-FITC |
| NucleoBond Xtra Maxi 키트 | Macherey-Nagel | 740414.1 | Plasmid Maxiprep 키트 |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| 플레이트 리더 | Biotek | Synergy HTX | |
| 정제 재조합 EGFP 단백질 | Chromotek | egfp-250 | 재조합 eGFP |
| Q5 고충실도 2X 마스터 믹스 | NEB | M0492S | DNA 중합효소 |
| Q5 고충실도 2X 마스터 믹스 | New England Biolabs | M0492L | DNA 중합효소 |
| Qubit dsDNA BR 어세이 키트 | Thermo | Q32850 | DNA 결합 염료 형광 어세 |
| RTS 아미노산 샘플러 | biotechrabbit | BR1401801 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| 멸균수 | Millipore RiOs 8 시스템의 정제수, 고압멸균으로 멸균. | ||
| 트리스 베이스 | 생명 과학 제품 싸이티바 | 17-1321-01 | |
| tRNA | Roche | 10109550001 | |
| 초음파 프로세서 Vibra cell VC-505 | SONICS | VC505 | 초음파 발생기 |
| UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate) | Acros Organics | ||
| 물, 뉴클레아제가 없는 | Thermo | R0581 | 뉴클레아제가 없는 물 |
참고문헌
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
- McSweeney, M. A., Styczynski, M. P. Effective use of linear DNA in cell-free expressi....
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재인쇄 및 허가
