D-루프 포획(DLC) 및 D-루프 확장(DLE) 분석은 정량적 PCR과 함께 근접 결찰 원리를 활용하여 사카로마이세스 세레비시아에서 유도성 이중 가닥 절단 부위에서 D-루프 형성, D-루프 확장 및 생성물 형성을 정량화합니다.
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이 논문에서
요약
초록
세포주기의 S 및 G2 단계에서 발생하는 DNA 이중 가닥 절단 및 가닥 간 교차 결합을 포함한 DNA 손상은 상동 재조합 (HR)에 의해 복구 될 수 있습니다. 또한 HR은 정지 또는 붕괴 후 복제 포크 구조의 중요한 메커니즘을 나타냅니다. 이 복잡한 경로의 많은 가역적 및 비가역적 단계의 조절은 충실도를 촉진합니다. HR 중에 형성된 재조합 중간체의 물리적 분석은 다양한 핵 단백질 인자 및 그 상호 작용자에 의한 이러한 제어의 특성화를 가능하게합니다. 재조합 경로에서 특정 사건과 중간체를 분석하는 잘 확립된 방법이 있지만, 이 경로의 두 가지 중요한 단계인 D-루프 형성 및 확장의 검출은 최근까지 어려운 것으로 판명되었습니다. 여기에서는 HR 경로에서 주요 사건, 즉 DNA 이중 가닥 절단 형성, D-루프 형성, D-루프 확장 및 사카로마이세스 세레비시아에서 절단 유도 복제(BIR)를 통한 생성물 형성을 검출하는 효율적인 방법을 설명합니다. 이러한 분석은 관련 재조합 중간체 및 고감도의 생성물을 검출하며 세포 생존력과 무관합니다. D-루프, D-루프 확장 및 BIR 제품의 검출은 근접 결찰을 기반으로 합니다. 함께, 이러한 분석은 인구 수준에서 HR의 동역학을 연구하여 경로의 중요한 단계에서 HR 단백질 및 조절자의 기능을 미세하게 다룰 수 있습니다.
서론
상동 재조합(HR)은 DNA 이중 가닥 절단(DSB), 가닥 간 교차 링크 및 ssDNA 갭의 복구에 대한 고충실도 메커니즘이자 DNA 손상 내성 경로입니다. HR은 손상되지 않은 상동 말단 접합(NHEJ) 및 전이 합성과 같은 DNA 손상 복구/내성에 대한 오류가 발생하기 쉬운 경로와 다르며, 손상되지 않은 상동 이중 DNA를 기증자로 사용하여 복구 이벤트를 주형화합니다. 또한 HR 경로의 많은 주요 중간체는 가역적이므로 개별 경로 단계를 정교하게 조절할 수 있습니다. 세포 주기의 S, G2 및 M 단계 동안 HR은 2단DSB1의 수리를 위해 NHEJ와 경쟁합니다. 또한, HR은 ssDNA 갭 및 일방적 DSB를 포함한 복제 관련 DNA 손상의 복구를 위한 DNA 복제에 필수적이며, DNA병변 우회의 메커니즘으로서 2.
HR 경로의 중요한 중간은 변위 루프 또는 D 루프입니다(그림 1). 말단 절제술 후, 반응의 중심 재조합 효소 인 Rad51은 부서진 분자의 새로 절제 된 ssDNA에로드되어 나선형 필라멘트2를 형성합니다. 그런 다음 Rad51은 적절한 상동 ....
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프로토콜
1. 사전 성장, DSB 유도 및 샘플 수집
참고: Ade- 균주의 경우 모든 배지에 0.01% 아데닌을 보충하는 것이 좋습니다.
- 효모 펩톤 덱스트로스 아데닌(YPDA)(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 포도당, 2% 한천, 0.001% 아데닌)에 적절한 반수체 균주( 표 1 참조)를 제거하고 30°C에서 2일 동안 성장시킵니다.
- 단일 콜로니를 사용하여 15mL 유리 배양 튜브에 5mL의 YPDA를 접종합니다. 폭기를 위해 흔들거나 회전하여 30°C에서 포화 상태로 배양물을 성장시킵니다.
- DLC 분석: 알루미늄 호일로 싸인 50mL 원추형 튜브에 소랄렌을 용해시켜 흄 후드에서 5x 소랄렌 원액 용액(200프루프 에탄올 중 0.5mg/mL 트리옥살렌)을 연속 흔들거나 반전시키면서 실온에서 밤새 준비합니다. 증발을 방지하기 위해 투명 필름으로 나사 상단을 밀봉하십시오. 소랄렌의 적절한 용해를 보장하기 위해 7mL 원추형 튜브당 50x 소랄렌 원액을 준비하지 마십시오.
- 다음날, 5mL의 YPDA에서 하룻밤 배양물을 사용하여 적절한 크기의 플라스크에 50-100mL의 YEP-젖산염(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2....
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결과
DLC 분석
DLC 분석은 부위별 DSB가 단일 기증자로 침입하여 형성된 초기 및 확장 D-루프를 모두 감지합니다(그림 2). 소랄렌 가교결합은 D-루프 내의 헤테로듀플렉스 DNA를 통해 끊어진 가닥과 기증자를 물리적으로 연결합니다. 절단된 절단 가닥에 긴 혼성화 올리고를 사용한 제한 효소 부위 복원은 제한 효소 절단을 허용한 다음, 파손된 가닥을 근위 공여체로 연결하여 qPCR로 정량화되는 키메라 생성물을 형성합니다. 특히, DLC 신호는 소랄렌 가교결합, 하이브리드화 올리고, 중심 재조합 효소, Rad51 및 Rad51 부속 인자 Rad52 및 Rad548에 의존한다. DNA 헬리카제/토포이소머라제 Sgs1-Top3-Rmi1, Mph1 및 Srs2의 결실은 DLC 신호를 증가시킵니다.
도 3<.......
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토론
제시된 분석은 근접 결찰 및 qPCR을 사용하여 초기 및 확장 D-루프(DLC 분석), D-루프 확장(DLE 분석) 및 BIR 생성물 형성(혼성화 올리고뉴클레오티드가 없는 DLE 분석)의 검출을 허용합니다. DSB로부터 멀리 떨어진 부위에 대한 Rad51의 ChIP-qPCR은 이전에 Rad51 매개 상동성 검색 및 D 루프 형성을 위한 프록시로서 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 ChIP-qPCR 신호는 Rad51-관련 인자 Rad54뿐만 아니라 중단 부위와 잠재적 공여체 사이의 서열 상동성과 무관하며, 따라서, D-루프 중간체10,11보다는 Rad51-ssDNA 필라멘트와 dsDNA 사이의 일시적인 연관성을 나타낼 가능성이 더 높다. 대조적으로, DLC 신호는 DSB 형성, Rad51, Rad52, Rad54, 및 DSB와검정된 공여자 부위 사이의 공유 서열 상동성에 의존한다 8. .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
Heyer 실험실에서의 연구는 W.-D.H.에 GM58015 및 GM137751 보조금으로 지원됩니다. Piazza 실험실의 연구는 유럽 연구위원회 (ERC-StG 3D-loop, 그랜드 컨디먼트 851006)의 지원을받습니다. D.R.은 T32CA108459와 A.P. Giannini Foundation의 지원을 받습니다. DLC/DLE 분석 결과를 공유하고 이 프로토콜에 자세히 설명된 분석의 변경 사항을 추가로 검증해 주신 Shih-Hsun Hung(Heyer Lab)에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| <강한>1. 사전 성장, DSB 유도 및 시료 채취 | |||
| Equipment | |||
| 15 및 50 mL conical tube | |||
| 15 mL glass culture tube | |||
| 250 mL, 500 mL 또는 1 L 플라스크 | |||
| 60 mm x 15 mm, 바닥이 평평한 | 제안 사항: Corning, 카탈로그 번호 430166 또는 Genesee Scientific, 카탈로그 번호 32-150G | ||
| 15 및 50mL 코니컬 튜브 어댑터가 | |||
| 벤치탑 오비탈 쉐이커 또는 튜브 회전자/리볼버 | |||
| UV 가교제 또는 라이트 박스 | 제안: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) 또는 Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, 카탈로그 번호 | ||
| 611110831Materials | |||
| 60% w/w sodium DL-lactate syrup | Sigma-Aldrich | L1375 | 배지 준비용 |
| Agar | Fisher | BP1423500 | 배지 준비용 |
| Bacto peptone | BD Difco | 211840 | 배지 준비용 |
| Bacto 효모 추출물 | BD Difco | 212750 | 미디어 준비용 |
| D-(+)-포도 | BD Difco | 0155-17-4 | 미디어 준비용 |
| Trioxsalen | Sigma-Aldrich | T6137 | psoralen 가교 |
| 용2. 스페로플라스팅, 용해 및 제한 효소 부위 복원 | |||
| 소모품 | |||
| 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브 | |||
| 건식 수조 | |||
| 액체 질소 또는 드라이 아이스/에탄올 | |||
| 냉장 마이크로 원심분리기 또는 마이크로 원심분리기 | |||
| Materials | |||
| 10X 제한 효소(CutSmart) 완충액(500mM 칼륨 아세테이트, 200mM Tris-acetate, 100mM 마그네슘 아세테이트, 1mg/mL BSA, pH 7.8-8.0) | |||
| Zymolyase 100T | US Biological | Z1004 | 스페로플라스팅 |
| 용3. 제한 효소 분해 및 분자 내 결찰 | |||
| Supplies | |||
| Water bath | |||
| Materials | |||
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101 | DLC 분석 HindIII-HF용 제한 효소 분해 |
| New England Biolabs | R3104 | DLE 분석용 제한 효소 분해 효소 T4 | |
| DNA 리가제 | New England Biolabs | M0202 | 분자 내 결찰 |
| <강력한>4. DNA 정제 | |||
| Supplies | |||
| 1.5 및 2mL 마이크로 원심분리기 튜브 | |||
| Materials | |||
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol(P/C/IA) at 25:24:1 | Sigma-Aldrich | P2069 | DNA 정제 |
| <강한>5. Psoralen cross-link reversal | |||
| Supplies | |||
| Thermocycler/PCR machine | |||
| 6. qPCR | |||
| Supplies | |||
| Lightcycler 480 | Roche | 5015278001 | 저자가 사용한 qPCR 기계 |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR 기계 |
| Materials | |||
| LightCycler 480 96-웰 플레이트, | 4729692001 | qPCR | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix | BioRad | 1725271 | qPCR 키트, 저자가 사용한 |
| ybr Green I Master Mix | 저자 | 사용한 Roche 4707516001 qPCR 키트 |
참고문헌
- Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45 (1), 247-271 (2011).
- Heyer, W. -D. Regulation of recombination and genomic maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology....
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재인쇄 및 허가
