단일 분자 확산 및 폴리머가 밀집된 지질 막에서의 조립

요약

여기에서는 단일 분자 전반사 형광(smTIRF) 현미경을 사용하여 인공 군집 지질 막에서 단일 분자의 결합, 이동성 및 조립을 수행하고 분석하는 프로토콜이 제시됩니다.

초록

세포막은 생체 분자 반응 및 신호 전달을 위해 매우 밀집된 환경입니다. 그러나 지질과 단백질 상호 작용을 조사하는 대부분의 시험관 내 실험은 네이키드 이중층 막을 사용합니다. 이러한 시스템은 막-포매된 단백질 및 글리칸에 의한 군집의 복잡성이 부족하고 세포막 표면에서 발생하는 관련 부피 효과를 배제합니다. 또한, 지질 이중층이 형성되는 음전하를 띤 유리 표면은 막 횡단 생체 분자의 자유 확산을 방지합니다. 여기에서, 우리는 붐비는 지질 막에 대한 모방으로서 잘 특성화 된 중합체 - 지질 막을 제시한다. 이 프로토콜은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 공액 지질을 크라우더를 지지된 지질 이중층(SLB)에 통합하기 위한 일반화된 접근 방식으로 활용합니다. 먼저, 단일 분자 실험을 수행하기 위한 현미경 슬라이드 및 커버슬립의 세척 절차가 제시된다. 다음으로, PEG-SLB를 특성화하고 단일 분자 추적 및 광퇴색을 사용하여 생체 분자의 결합, 확산 및 조립의 단일 분자 실험을 수행하는 방법에 대해 논의합니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 단일 분자 광퇴색 분석을 통해 붐비는 지질막에서 박테리아 기공 형성 독소 Cytolysin A(ClyA)의 나노기공 어셈블리를 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 예제 데이터셋이 포함된 MATLAB 코드도 포함되어 입자 추적, 확산 거동 추출, 소단위 계수와 같은 일반적인 분석을 수행할 수 있습니다.

서론

세포막은 매우 밀집되어 있고 복잡한 시스템입니다¹. 분자 군집은 단백질 및 지질 ^2,3,4와 같은 막 결합 개체의 확산에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 유사하게, 수용체 이량체화 또는 막 복합체의 올리고머화와 같은 지질막에 대한 이분자 반응은 군집 ^5,6,7의 영향을 받습니다. 크라우더의 특성, 구성 및 농도는^{여러 가지 방법으로} 막 결합, 확산성 및 단백질-단백질 상호작용을 제어할 수 있습니다^8,9. 세포막의 막 밀집을 제어하고 임베디드 생체 분자에 미치는 영향을 해석하는 것이 어렵 기 때문에 연구자들은 대체 시험관 내 시스템¹⁰을 구축하려고 시도했습니다.

인공 군집 막에 대한 대중적인 접근법은 이중층 막....

프로토콜

1. 단일 분자 실험을 위한 슬라이드 및 커버슬립 청소

1. 이미징 챔버를 조립하기 전에 커버슬립과 슬라이드를 모두 청소하고 준비하십시오. 다이아몬드 코팅 드릴 비트(직경 0.5-1mm)가 있는 드릴링 머신을 사용하여 유리 슬라이드에 여러 쌍의 구멍을 뚫습니다. 아크릴 시트를 사용하는 경우 그림 1과 같이 레이저 커터를 사용하여 정밀한 구멍 (0.5mm)을 만듭니다.
   참고: 각 구멍 쌍은 개별 미세유체 챔버의 흐름 교환을 위한 입구 및 출구 역할을 합니다. 아크릴 슬라이드의 구멍에 대한 대표적인 CAD 파일은 보충 코딩 파일 1에서 사용할 수 있습니다. 유리 슬라이드에 뚫린 구멍은 일반적으로 드릴 비트 크기보다 1.5x-2x 더 커집니다.
2. 슬라이드와 커버 슬립을 세제로 청소하십시오. 탈 이온수로 철저히 헹굽니다. 슬라이드와 커버 슬립을 별도의 슬라이드 염색 (Coplin) 병에 물로 넣고 30 분 동안 목욕 초음파 처리기에서 초음파 처리합니다. 모든 초음파 처리 단계에 대해 70W 전원 설정을 사용하십시오.
3. 물을 제거하고 유리 슬라이드와 커버 슬립이 들어있는 Coplin 병에 아세톤을 가장자리까지 채 웁니다 (병 부피에 따라 ....

결과

PEG화된 막에서 ClyA 단백질의 결합 모니터링
단계 4.5 후, 결합 동역학은 시간 경과에 따라 막 표면에 결합하는 입자의 수를 플로팅하여 추정됩니다 (비디오 1). ClyA 단백질이 5mol% PEG2000 지질로 막에 결합하면 입자 밀도가 증가하고 포화 상태에 도달합니다(그림 5). 결합 된 입자 (청록색 원)에 맞는 지수 붕괴는 막 결합에 대한 시간 상수 (τ_b)를 제공합니다 (특히이 경우 초기 시점 [빨간색 원]은 적합하지 않음).

붐비는 막에서 DNA 추적자의 이동성
우리는 일반적으로 DNA 추적자(토코페롤로 막에 고정된 DNA), 친유성 추적자 염료(예: DiI) 또는 막 단백질(예: ClyA)을 사용하여 PEG 매개 군집 하에서 막을 특성화합니다. 표지된 추적 분자(25–100 pM)의 측면.......

토론

여기에서는 막에 내장된 생체 분자에 대해 혼잡한 환경을 나타내는 지지된 지질 이중층(SLB)에 대한 단일 분자 실험을 시연합니다. 혼잡 한 환경은 배제 된 부피 효과를 생성하여 생체 분자 반응 1,2,39,40의 향상으로 이어집니다. 폴리머가 주로 이중층 외부의 부피를 차지하는 PEG- 지질 시스템의 경우,이 효과는 특히 큰 엑토 도메인을 갖는 분자 종에서 두드러진다. 따라서, 친 유성 염료에 비해, 수용체, 당 단백질 및 당지질과 같은 막에 내장 된 큰 친수성 분자의 확산이 현저히 감소 될 수있다. 토코페롤을 통해 막에 고정된 형광 추적자 DNA를 사용하여(그림 5), 우리는 이러한 군집 효과를 식별할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2.5ml 주사기	HMD Healthcare	Dispo Van, 2.5ml 투베르큘린	플라스틱 주사기
아세톤	Finar Chemicals	10020LL025
아크릴 시트			2mm 두께
의 아크릴 시트	BigiMall		2mm, 투명
목욕 초음파 발생기	Branson	CPX-1800
염화칼슘
클로로포름	시그마	528730	HPLC 등급
콜레스테롤	Avanti	700100
코플린 항아리	Duran Wheaton Kimble	S6016	유리 커버 커버 슬립이있는 8 슬라이드 항아리
	VWR	631-1574	24 mm X 50 mm
Cy3-DNA 스트랜드 IDT			GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT GGTGTGGTTGG-Cy3
시아닌 염료 (Cy3)	Cytiva 생명 과학	PA23001
DiI	Invitrogen	D3911	Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate) ('DiI'; DiIC18(3)))DNA
커넥터 가닥 1	시그마 Aldrich		GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC T
DNA 커넥터 가닥 2	시그마 Aldrich		CGGACGCAATAGCAGCTCACAG TCGGTCACAT
DNA 토코페롤 가닥	생체체		Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000	Avanti	880130	1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)
양면 테이프	3M	LF93010LE
드릴 비트(다이아몬드 코팅)			0.5 - 1mm
드릴링 머신	Dremel	220	워크스테이션
EMCCD	Andor	DU-897U-CS0-#BV
형광 비드	Invitrogen	F10720
유리 슬라이드	블루 스타		마이크로 슬라이드, PIC-1
유리 바이알	시그마	854190
과산화수소	Lobachemie	00182	30% 용액, AR 등급
Labolene	Thermo-Fischer Scientific		세제
레이저 532nm	코히어런트	사파이어
레이저 커터	범용 레이저 시스템	ILS12.75
리사민 로다민 도프	Avanti	810150	1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(리사민 로다민 B 설포닐) (암모늄 염)
메탄올	Finar Chemicals	30932LL025
현미경	Olympus	IX81
인산염 완충액 식염수(PBS)			1X
플라즈마 클리너	Harrick Plasma Inc	PDC-002
POPC	Avanti	850457	1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine
프로그래밍 가능한 주사기 펌프	New Era 펌프 시스템	NE1010	고압 주사기 펌프
PTFE Caps	Sigma	27141
PTFE 튜빙	Cole-Parmer	WW-06417-21	Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD
황산	SD 정밀 화학 98		%, AR 등급
TIRF 대물렌즈	올림푸스	UPLAPO100XOHR
진공 데시케이터	Tarsons
Vortex Mixer	Tarsons