Method Article

쥐 골수, 조혈 줄기 및 전구 세포, 기질 틈새 세포의 유세포 분석

DOI:

10.3791/64248

⸱

September 28th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Instituto de Investigação e Inovação em Saúde (i3S), Universidade do Porto, 2Department of Onco-Hematology, Instituto Português de Oncologia (IPO)-Porto, 3Unit of Biochemistry, Department of Biomedicine, Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, 4Porto Comprehensive Cancer Center (P.CCC)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서 우리는 쥐 골수 세포를 표현형 조혈 줄기 및 전구 세포와 함께 지지하는 틈새 내피 및 중간엽 줄기 세포로 분리 및 염색하기 위한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 내골 및 중앙 골수 영역에 위치한 세포를 풍부하게 하는 방법도 포함됩니다.

Abstract

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골수(BM)는 새로운 혈액 세포가 생성되는 과정인 조혈이 주로 발생하는 뼈 내에서 발견되는 연조직입니다. 따라서 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)뿐만 아니라 HSPC의 유지 및 조절에 기여하는 지지 기질 세포를 포함합니다. 혈액학적 및 기타 BM 장애는 조혈 세포에 직접 영향을 미치거나 BM 틈새의 변경을 통해 조혈을 방해합니다. 여기에서는 유세포 분석에 의한 쥐 BM HSPC 및 기질 틈새 집단의 표현형 분석을 통해 건강 및 악성 종양의 조혈을 연구하는 방법을 설명합니다. 우리의 방법은 내피 및 중앙 BM 분획에서 BM 세포를 풍부하게 하는 데 필요한 단계와 HSPC 조절에 관여하는 두 가지 주요 틈새 세포 유형인 내피 세포 및 중간엽 줄기 세포를 식별하기 위한 적절한 게이팅 전략을 자세히 설명합니다. 여기에서 제안된 표현형 분석은 마우스 돌연변이체, 질병 모델 및 기능적 분석과 결합되어 HSPC 구획 및 그 틈새를 특성화할 수 있습니다.

Introduction

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유세포 분석은 면역 및 조혈 세포를 특성화하고 전향적으로 분리하는 매우 중요한 방법입니다. 또한 다른 조직의 기질 및 상피 집단을 분석하는 데 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 조혈모세포(HSC)는 자가 재생 및 다능성의 고유한 특성을 가지고 있습니다. 성체 포유류에서 HSC는 주로 골수(BM)에 존재하며, 주변 미세환경이나 틈새1로부터 정지 및 생존 신호를 받습니다. HSC는 기능적 분석(functional assays)2에 따라 공식적으로 정의된다. 그럼에도 불구하고 몇몇 획기적인 논문은 HSC를 식별하기 위한 유세포 분석의 유용성을 보여주었습니다. 제한된 세포 표면 마커를 사용함으로써, HSC가 매우 풍부한 조혈 집단을 구별할 수 있다3. 따라서 유세포 분석은 줄기 세포 분야에서 핵심적인 방법입니다. 추정되는 틈새 세포 유형과 틈새 요인이 HSC에 미치는 영향을 평가하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 유세포 분석과 이미징 및 기능 분석을 결합함으로써 HSC는 혈관주위 중간엽 줄기 세포(MSC) 및 내피 세포(EC)에 의해 결정적으로 뒷받침되는 것으로 나타났습니다. BM 중간엽 줄기세포는 이질적인 그룹이며 사이토카인 기여도가 다르지만

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Protocol

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이 프로토콜에 사용된 동물은 12시간 명암 주기 및 온도 제어 환경에서 특정 병원체가 없는 조건에서 i3S 동물 시설에 수용되었습니다. 표준 설치류 차우와 물에 대한 무료 접근이 제공되었습니다. 모든 동물은 실험실 동물의 관리 및 취급에 대해 유럽 실험실 동물 과학 협회 연맹(EU Directive 2010/63/EU)에서 설명한 기준에 따라 인도적 관리를 받았습니다. 동물에 대해 수행된 실험 절차(안락사)는 i3S 동물 윤리 위원회(ref. DD_2019_15)와 Direção-Geral de Alimentação e Veterinária의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜 전반에 걸쳐 사용되는 재료에 대한 자세한 내용은 재료 표에서 찾을 수 있습니다.

1. 용액 준비 및 염색 칵테일

  1. 인산염 완충 식염수(PBS): PBS 정제 5개를 증류수 1L에 녹입니다. 실온(RT)에서 보관하십시오.
  2. PBS 2% 소 태아 혈청(FBS): PBS 500mL에 FBS 10mL를 추가합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
  3. 적혈구(RBC) 용해 완충액(1x): 450mL의 탈이온수에 10x RBC 용해 완충액 50mL를 추가합니다. 4 °C에서 보관하십....

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Results

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건강한 젊은 성인 C57Bl/6 마우스에서 HSC 및 MPP의 유세포 분석 분석의 대표적인 플롯이 그림 1에 나와 있습니다. 게이팅 전략은 ISEH13에서 제안한 최신 조화 명명법을 따릅니다. 감염이나 암과 같은 섭동의 영향을 분석할 때 대조군 마우스를 정상 게이트의 기준으로 사용하는 것이 중요합니다. FMO(Fluorescence-minus-one) 제어는 게이트의 경계를 묘사하는 데 특히 유용할 수 있지만, FMO를 기반으로 게이트 한계를 맹목적으로 설정하면 표적 세포를 생략하거나 비표적 세포를 포함할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 예를 들어, CD48 세트의 강도가 낮을수록, 정지 장기 HSCs에 대한 농축이 더 높아진다17. 또한, 특정 모집단의 다른 특성은 특정 마커의 강도에 의존합니다. 예를 들어, 더 높은 CD150 수준을 발현하는 HSC는 더 골수성 편향적이다

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Discussion

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설명된 프로토콜은 간단하고 수행하기 쉽지만 특정 단계에 특별한 주의를 기울여야 합니다. 예를 들어, 플러싱된 BM을 얻을 때(단계 5.2), 뼈의 중앙 부분의 내부를 통해 PBS 2% FBS를 통과시키도록 지시된 부피 또는 횟수는 초과되어서는 안 되는데, 이는 내분비 세포 집단에 의해 플러싱된 샘플의 상당한 오염을 초래할 수 있기 때문이다.

조사자의 실행을 용이하게 하기 위해 프로토콜을 변경할 수 있습니다. 샘플 추출(섹션 2)에서 다리 및/또는 뼈는 샘플 처리 및 분석을 진행하기 전에 최대 24시간 동안 4°C의 PBS 2% FBS에 보관할 수 있습니다. 그러나 가능하면 이 시간을 최소화해야 합니다. HSCs 1차 염색 칵테일(단계 3.10) 및 2차 염색 칵테일(단계 3.11)을 사용한 인큐베이션 동안, RT에서 15분 인큐베이션이 지시되는 반면, 이것은 4°C에서 30분 인큐베이션으로 교환될 수 있다.

기질 1차 염색 칵테일.......

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Disclosures

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

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LM은 Lady Tata Memorial Trust의 보조금으로 지원되었습니다. JR은 Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; FCT 펠로우십 UI/BD/150833/2021). ML은 FCT (FCT 펠로우십 2021.04773.BD)의 박사 학위 펠로우십의 지원을 받았습니다. DD는 미국 혈액학 학회, Pablove 재단, FCT(EXPL/MED-ONC/0522/2021) 및 포르투갈 혈액학 학회의 보조금으로 지원되었습니다. i3s에 있는 TRACY 시설의 Dr. Catarina Meireles와 Emilia Cardoso의 지원에 감사드립니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 항체BioLegend116114
APC StreptavidinBioLegend405207
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) 항체BioLegend105826
APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 항체BioLegend103116
APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells 항체BioLegend116223
Biotin anti-mouse CD3ε 항체BioLegend100304
Biotin anti-mouse CD4 항체BioLegend100404
Biotin anti-mouse CD8a 항체BioLegend100704
Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) 항체BioLegend108404
Biotin 안티 마우스 TER-119 / 적혈구 세포 항체BioLegend116204
Biotin 안티 마우스 / 인간 CD11b 항체BioLegend101204
Biotin 안티 마우스 / 인간 CD45R / B220 항체BioLegend103204
Brilliant Violet 510 안티 마우스 CD150 (SLAM) 항체BioLegend115929
Calibrite 2 Color BeadsBD Biosciences
콜라겐분해효소 IVMerck Life ScienceC1889
Dispase IIMerck Life ScienceD4693
소 태아 혈청, 적격, 열 불활성화, EU 승인, 남미 원산지ThermoFisher Scientific10500064
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)ThermoFisher Scientific14175095
마우스 렙틴 R 비오틴화 항체R& D systemsBAF497
NucBlue 고정세포 시약(DAPI)ThermoFisher ScientificR37606DAPI 시약
PE 안티-마우스 엔도무신 항체ThermoFisher Scientific12-5851-82
PE 안티-마우스 Flk2 (CD135)ThermoFisher Scientific12-1351-82
PE/Cyanine7 안티-마우스 CD31 항체BioLegend102524
PE/Cyanine7 안티 마우스 CD48 항체BioLegend103424
PerCP 안티 마우스 Ly-6A/E(Sca-1) 항체BioLegend108122
인산염 완충 식염수(PBS) 정제Merck Life ScienceP4417
정제 안티 마우스 CD16/32 항체BioLegend101302
RBC 용해 완충액 10xBioLegend420302
Zombie Violet Fixable Viability DyeBioLegend423114형광 염료
349502

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).
  2. Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell.

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Flow CytometryBone Marrow CellsHematopoietic Stem CellsProgenitor CellsStromal Niche CellsEndosteal Bone MarrowCentral Bone MarrowMesenchymal Stem CellsEndothelial CellsPhenotypic Analysis

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