Method Article

항암 응용 분야를 위한 In vitro 에서 Src Kinase 활성을 억제하는 메틸화된 나노 구조 디펩타이드의 개발 및 테스트

DOI:

10.3791/64256

⸱

November 30th, 2022

 ,  , 
1Biochemistry Department, College of Science, King Abdulaziz University, 2Independent Scholar, 3School of Health Sciences and Biomedical Engineering, Hebei University of Technology, 4School of Engineering, Saveetha University, 5Programa de Pós-graduação em Ciência e Engenharia dos Materiais, UFPI

In This Article

Retraction Notice

The article Developing and Testing Methylated Nano-Structured Dipeptides that Inhibit Src Kinase Activity In Vitro for Anti-Cancer Applications has been retracted by the journal due to authorship and reproducibility concerns.

Summary

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여기에 제시된 프로토콜은 항암 응용 분야를 위한 무세포 및 세포 분석을 사용하여 Src kinase 효소 활성을 억제할 수 있는 디펩타이드를 설계하고 테스트하기 위한 프로토콜입니다. 여기에 제형화된 펩타이드(W-RCH3, WCH3-R CH3 및 W-R(CH3)2)는 각각 510nM, 916nM 및 1μM의 IC50 값으로 Src 키나아제를 억제했습니다.

Abstract

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여기에서는 새로운 항암 치료제 개발을 목표로 메틸화 트립토판 및/또는 메틸화 아르기닌을 함유하고 Fmoc 고체상 펩타이드 합성을 사용하여 생산된 7개의 디펩타이드를 설계했습니다. Src 티로신 키나아제 효소의 과발현은 다양한 암의 발병과 관련이 있습니다. 메틸화 아르기닌(RCH3), 디메틸화 아르기닌(R(CH3)2) 및/또는 메틸화 트립토판(WCH3) 잔기와 같은 비천연 아미노산을 함유한 디펩타이드는 이전에 Src 키나아제를 억제하는 것으로 나타났습니다. 본 연구에서는 무세포 분석을 사용하여 W-RCH3, WCH3-R CH3 및 W-R(CH3)2 등 3가지 디펩타이드를 시험한 결과 각각 510nM, 916nM 및 1μM의 IC50 값(50% 억제가 발생하는 농도)을 갖는 것으로 확인되었습니다. 이러한 값은 이전 연구에서 합성된 사이클릭 펜타-에서 나노-W-R 펩타이드([W-R]5-[W-R]9)에 대해 얻은 값과 유사했습니다. 그러나, 디펩타이드의 메틸화되지 않은 버전은 Src kinase에 대해 어떠한 억제 활성도 나타내지 않았다. 이러한 모든 디펩티드(50μM)는 백혈병(CCRF-CEM), 유방 선암종(MDA-MB-231) 및 난소 선암종(SK-OV-3) 세포주를 포함한 3가지 암 세포주를 사용하여 최대 72시간까지 배양 후 세포 독성을 나타내지 않았으며, 이는 세포막을 통한 펩타이드의 투과성이 제한적임을 나타냅니다. 따라서 펩타이드 담체를 사용하거나 추가 펩타이드 기능화를 사용하는 것과 같은 항암 응용 분야를 위해 이러한 펩타이드의 투과성을 개선하기 위한 추가 연구가 필요합니다. 요약하면, 본 연구는 Src kinase 활성을 억제하는 펩타이드를 합성하고 시험할 수 있는 프로토콜을 제공하며, 이에 따라 무세포 및 세포 분석을 통해 유망한 항암 능력을 가지고 있습니다.

Introduction

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암은 정상 세포의 비정상적인 성장으로 인해 발생하며 전 세계적으로 가장 치명적인 질병 중 하나입니다. 이러한 비정상 세포는 전이(metastasis)라는 과정을 통해 신체의 다른 기관으로 퍼집니다. 가장 흔한 형태의 암은 유방암으로, 2020년 226만 명에서 발생했습니다. 또한 2020년에는 약 180만 명이 폐암으로 사망했습니다1. 세계보건기구(WHO)에 따르면 2020년에 약 1,000만 명이 암으로 사망했습니다2. 암세포는 단백질 티로신 키나아제(PTK)와 같은 특정 효소를 과발현한다는 점에서 정상 세포와 다릅니다. 미국 국립암연구소(National Cancer Institute)는 키나아제를 다른 단백질이나 당을 인산화할 수 있는 효소로 정의한다3. 키나아제의 조절 기능에 대한 지식은 효과적인 항암제의 설계를 촉진할 수 있습니다. 예를 들어, PTK는 다른 단백질이나 당의 인산화를 촉매하고, 그 결과 ATP는 인산기의 손실에 의해 ADP로 전환됩니다. 총 80%의 종양유전자와 프로툰유전자가 PTK를 암호화합니다4. Src kinase는 Lck, Fyn, Hck, Blk, Yes 및 Yrk를 포함한 비수용체 티로신 ....

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Protocol

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1. 펩티드의 합성

참고: W-R의 합성이 대표적인 예로 설명됩니다(그림 2).

  1. Mandal et al20에서 사용한 절차에 따라 H-Arg(Pbf)-2-chlorotriryl resin 566mg(0.3mmol)의 무게를 측정하고 펩타이드 합성 용기(재료 표 참조)에 추가합니다. 잘 정립된 고체상 펩타이드 합성(SPPS) 전략을 사용하여 펩타이드 합성을 수행합니다21.
    참고: 비천연 아미노산을 함유한 메틸화 또는 디메틸화 디펩타이드는 링크 아미드 수지(0.3mmol/g의 적재 용량)에 조립되었고, 천연 아미노산을 함유한 디펩타이드는 H-Arg(Pbf)-2-chlorotriryl 수지(0.3mmol/g의 적재 용량)와 같이 첫 번째 아미노산이 부착된 수지에 조립되었습니다. 중요한 것은 링크 아미드 수지가 C 단자 NH2로 덮인 펩타이드를 생성한다는 것입니다.
  2. 펩타이드 용기와 연결된 질소 가스 압력 하에서 N,N-디메틸포름아미드(DMF) 5mL에서 건조 수지를 1시간 동안 팽창시킵니다....

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Results

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W-RCH3, WCH3-R CH3, W-R(CH3)2, WCH3-R, WCH3-R(CH3)2 및 대조군 W-R 펩티드는 각각 95%, 98.7%, 99%, 100%, 100% 및 99.5% 순도를 가진 Fmoc 고체상 펩타이드 합성(그림 3)을 사용하여 합성했습니다. 이러한 디펩타이드의 화학 구조는 ESI-MS를 사용하여 확인되었습니다. 이들 디펩타이드의 m/z 값은 각각 374.1624, 388.1949, 388.1794, 374.1815, 402.2022, 361.1457이었다.

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Discussion

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Src 키나아제의 억제와 그에 따른 암세포의 사멸을 위해 여기에서 제조 및 테스트된 펩타이드는 비천연 아미노산인 메틸화 트립토판 및/또는 메틸화 아르기닌을 함유하고 있습니다. 디 에틸 에테르를 첨가 할 때 백색 침전물의 형성은 이러한 펩티드의 합성에서 중요한 단계입니다. 그러나 모든 합성 펩티드가 침전물을 형성할 수 있는 것은 아닙니다. 따라서 침전물이 형성되지 않은 경우에도 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)을 사용하여 원하는 질량을 측정하여 성공적인 펩타이드 합성을 확인할 수 있습니다. 펩타이드 질량은 펩티드의 1H-NMR 스펙트럼을 예측하기 위해 추가로 사용될 수 있습니다. 비천연 아미노산은 천연 아미노산보다 프로테아제에 의한 단백질 분해 분해에 더 안정적이고 저항성이 있는 것으로 알려져 있으며(25), 따라서 Src 키나아제 활성을 더 잘 억제할 수 있다. 또한, 메틸화 알라닌(즉, α-아미.......

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Disclosures

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저자는 공개할 내용이 없습니다.

Acknowledgements

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보조금 번호로 이 프로젝트에 자금을 지원한 사우디아라비아 제다에 있는 King Abdulaziz University(KAU)의 과학 연구 학장(DSR)에게 감사드립니다. (G:031-130-1443).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-DithiothreitolSigma-Aldrich10708984001펩타이드 합성
고체상 합성을 위한 Aldrich fritted 필터 깔때기Sigma-AldrichZ283304펩타이드 합성 용기
Alexa594 TracerBell Brook Labs, Madison, WI3013
AnisoleSigma-Aldrich8014520500
CellTiter 96 A대형 제품  해결책  세포 증식 분석 시약 PromegaG3582세포 증식 분석(MTS 시약)
디클로로메탄, 99.9%, 엑스트라 드라이피셔시AC326850025
Fmoc-ADMA(Pbf)-OH시그마-알드리치8521070001
Fmoc-Arg(Me,Pbf)-OH시그마-알드리치8521050001
Fmoc-Arg(Pbf)-OH시그마-알드리치8520670025
Fmoc-Trp(Boc)- OHSigma-Aldrich47561-25G-F
HPLC C18 컬럼 시마즈  (RP-HPLC 시스템)물/아세토니트릴 그라디언
IRDye QC-1 담금화제Bell Brook Labs, Madison, WI3013
마이크로플레이트 리더 SpectraMax M2e분자 장치
Microsoft ExcelMicrosoft스프레드시트 소프트웨어
N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA)시그마-알드리치496219
N,N-디메틸포름아미드, 무수, 99.8%FishersciAA43997M1
Piperidine 20%Sigma-Aldrich80645
링크 아미드 수지(100-200 메쉬)Sigma-Aldrich8550010025
ThioanisoleSigma-Aldrich92358
Transcreener ADP2 FI AssayBell Brook Labs, Madison, WI3013c-Src kinase activity assay kit
트

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Cancer. World Health Organization. , Available from:

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Src Kinase InhibitionMethylated DipeptidesSolid Phase Peptide SynthesisAnti Cancer PeptidesTyrosine Kinase ActivityAcellular AssaysPeptide PermeabilityCancer Cell LinesPeptide FunctionalizationIC50 Measurement