Method Article

항암 응용 분야를 위한 In vitro 에서 Src Kinase 활성을 억제하는 메틸화된 나노 구조 디펩타이드의 개발 및 테스트

DOI:

10.3791/64256

⸱

November 30th, 2022

 ,  , 
1Biochemistry Department, College of Science, King Abdulaziz University, 2Independent Scholar, 3School of Health Sciences and Biomedical Engineering, Hebei University of Technology, 4School of Engineering, Saveetha University, 5Programa de Pós-graduação em Ciência e Engenharia dos Materiais, UFPI

In This Article

Retraction Notice

The article Developing and Testing Methylated Nano-Structured Dipeptides that Inhibit Src Kinase Activity In Vitro for Anti-Cancer Applications has been retracted by the journal due to authorship and reproducibility concerns.

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 제시된 프로토콜은 항암 응용 분야를 위한 무세포 및 세포 분석을 사용하여 Src kinase 효소 활성을 억제할 수 있는 디펩타이드를 설계하고 테스트하기 위한 프로토콜입니다. 여기에 제형화된 펩타이드(W-RCH3, WCH3-R CH3 및 W-R(CH3)2)는 각각 510nM, 916nM 및 1μM의 IC50 값으로 Src 키나아제를 억제했습니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 새로운 항암 치료제 개발을 목표로 메틸화 트립토판 및/또는 메틸화 아르기닌을 함유하고 Fmoc 고체상 펩타이드 합성을 사용하여 생산된 7개의 디펩타이드를 설계했습니다. Src 티로신 키나아제 효소의 과발현은 다양한 암의 발병과 관련이 있습니다. 메틸화 아르기닌(RCH3), 디메틸화 아르기닌(R(CH3)2) 및/또는 메틸화 트립토판(WCH3) 잔기와 같은 비천연 아미노산을 함유한 디펩타이드는 이전에 Src 키나아제를 억제하는 것으로 나타났습니다. 본 연구에서는 무세포 분석을 사용하여 W-RCH3, WCH3-R CH3 및 W-R(CH3)2 등 3가지 디펩타이드를 시험한 결과 각각 510nM, 916nM 및 1μM의 IC50 값(50% 억제가 발생하는 농도)을 갖는 것으로 확인되었습니다. 이러한 값은 이전 연구에서 합성된 사이클릭 펜타-에서 나노-W-R 펩타이드([W-R]5-[W-R]9)에 대해 얻은 값과 유사했습니다. 그러나, 디펩타이드의 메틸화되지 않은 버전은 Src kinase에 대해 어떠한 억제 활성도 나타내지 않았다. 이러한 모든 디펩티드(50μM)는 백혈병(CCRF-CEM), 유방 선암종(MDA-MB-231) 및 난소 선암종(SK-OV-3) 세포주를 포함한 3가지 암 세포주를 사용하여 최대 72시간까지 배양 후 세포 독성을 나타내지 않았으며, 이는 세포막을 통한 펩타이드의 투과성이 제한적임을 나타냅니다. 따라서 펩타이드 담체를 사용하거나 추가 펩타이드 기능화를 사용하는 것과 같은 항암 응용 분야를 위해 이러한 펩타이드의 투과성을 개선하기 위한 추가 연구가 필요합니다. 요약하면, 본 연구는 Src kinase 활성을 억제하는 펩타이드를 합성하고 시험할 수 있는 프로토콜을 제공하며, 이에 따라 무세포 및 세포 분석을 통해 유망한 항암 능력을 가지고 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

암은 정상 세포의 비정상적인 성장으로 인해 발생하며 전 세계적으로 가장 치명적인 질병 중 하나입니다. 이러한 비정상 세포는 전이(metastasis)라는 과정을 통해 신체의 다른 기관으로 퍼집니다. 가장 흔한 형태의 암은 유방암으로, 2020년 226만 명에서 발생했습니다. 또한 2020년에는 약 180만 명이 폐암으로 사망했습니다1. 세계보건기구(WHO)에 따르면 2020년에 약 1,000만 명이 암으로 사망했습니다2. 암세포는 단백질 티로신 키나아제(PTK)와 같은 특정 효소를 과발현한다는 점에서 정상 세포와 다릅니다. 미국 국립암연구소(National Cancer Institute)는 키나아제를 다른 단백질이나 당을 인산화할 수 있는 효소로 정의한다3. 키나아제의 조절 기능에 대한 지식은 효과적인 항암제의 설계를 촉진할 수 있습니다. 예를 들어, PTK는 다른 단백질이나 당의 인산화를 촉매하고, 그 결과 ATP는 인산기의 손실에 의해 ADP로 전환됩니다. 총 80%의 종양유전자와 프로툰유전자가 PTK를 암호화합니다4. Src kinase는 Lck, Fyn, Hck, Blk, Yes 및 Yrk를 포함한 비수용체 티로신 키나아제의 계열로, 암세포, 특히 유방암에서 과발현됩니다 5,6. Src 티로신 키나아제는 유사분열, 분화, T세포 활성화 및 세포 형질전환과 관련이 있습니다. Src는 암세포 부착을 감소시키는 능력으로 인해 암세포의 침입 및 전이에 도움이 됩니다. Src kinase에는 N-말단에서 C-말단까지 지방산 도메인, Src homology 3 영역(SH3), Src 상동성 2 영역(SH2), 티로신 키나아제 도메인(SH1) 및 C-말단 조절 도메인7의 5가지 도메인이 있습니다.

figure-introduction-1
그림 1: SH3 도메인, SH2 도메인, 키나아제 도메인(SH1) 및 짧은 C-말단 조절 세그먼트를 포함한 Src 키나아제 효소의 타겟 도메인.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

kinase domain SH1은 ATP와 기질 결합을 위한 두 개의 보존 부위를 포함하기 때문에 Src kinase 억제제를 설계할 때 가장 일반적으로 표적이 됩니다(그림 1). 키나아제 도메인의 아미노산 서열이 알려진 경우, 기질은 Src 키나아제8에 대한 기질 결합을 모방하는 화합물을 설계하기 위한 표적으로 사용될 수도 있습니다. 또한 SH3 및 SH2 도메인과 같은 다른 사이트를 대상으로 사용할 수 있습니다. 다른 화학요법제에 비해 키나아제 억제제는 독성이 적고 효능이 높다9. 2021년 9월 현재 FDA10에서 승인한 키나아제 억제제로 작용하는 73개의 소분자가 있습니다. 이마티닙(Imatinib)은 티로신 키나아제(tyrosine kinase)의 활성을 선택적으로 억제하는 항암제의 한 예이다. 그러나 일부 환자는 kinase domain11에 점 돌연변이가 나타나기 때문에 약물에 내성이 있습니다. 아스트라제네카(AstraZeneca)는 티로신 키나아제의 Src 계열을 IC50 값(50% 억제가 발생하는 농도)이 2.7nM으로 억제하는 약물인 사라카티닙(Saracatinib)을 출시했으나 2상 시험에서 할인되었다12. 2020년 초 미국 FDA가 승인한 52개의 PTK 억제제 중13개는 표적 수용체 PTK가 28개, 11개는 비수용체 PTK를 차단하고, 11개는 단백질-세린/트레오닌 단백질 키나아제를 차단하고, 2개는 MEK1/2을 차단합니다 13. 종양학에 대한 연구의 관심이 높아짐에 따라 잠재적인 항암제로서 키나아제 억제제의 발견이 계속 촉진될 것입니다. 그러나 지금까지 500개의 단백질 키나아제 중 50개만이 치료 대상이 되었습니다. 따라서 가까운 장래에 약물 개발을 위해 더 많은 수의 키나아제(kinase)가 연구될 것으로 예상됩니다14. 또한, 암을 유발하는 아직 확인되지 않은 키나아제 돌연변이를 조사하기 위해 키나아제 억제제를 발견할 필요가 있습니다.

따라서 본 연구는 Src 계열의 억제제로 사용할 수 있는 펩타이드를 개발하고 서로 다른 키나아제 사이에서 보존 부위 역할을 하는 능력으로 인해 ATP 결합 부위를 표적으로 삼을 수 있는 펩타이드를 개발하는 것을 목표로 했습니다. 이를 위해 메틸화 트립토판 및/또는 메틸화 아르기닌을 함유하는 일련의 디펩타이드를 합성하고 Src 키나아제를 억제하는 시너지 능력을 테스트했습니다. 트립토판의 인돌 고리는 ATP의 아데닌을 모방하고 ATP 결합 부위에 결합하는 ATP와 경쟁합니다. 또한, 리간드의 메틸화된 아르기닌은 Src의 SH3 영역을 놓고 경쟁한다. 연구자들은 탈메틸화된 아르기닌을 함유하는 폴리펩티드가 SH3 도메인을 억제한다는 것을 보여주었는데, 이는 N-말단에 2-3개의 Arg 잔기 또는 리간드(15)의 C-말단에 1-2개의 Arg 잔기를 포함하는 리간드에 대한 결합 친화력을 갖는 SH3 결합 모티프(즉, PXXP)의 특정 보존 서열에 기인할 수 있음을 보여주었다. 16,17. Arg의 guanidino 그룹은 SH3 도메인18,19의 보존된 Asp-99 잔기에 결합하는 반면, Arg의 나머지 부분은 NMR 분석 및 여러 SH3 도메인19의 결정 구조에서 확인된 바와 같이 효소의 보존된 Trp-118에 결합합니다. 여기에서는 7개의 메틸화 디펩티드를 합성하고 Src 키나아제에 대한 억제 능력을 테스트하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 또한, 이러한 펩타이드가 in vitro에서 여러 암 세포주를 사멸시키는 능력을 조사했습니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 펩티드의 합성

참고: W-R의 합성이 대표적인 예로 설명됩니다(그림 2).

  1. Mandal et al20에서 사용한 절차에 따라 H-Arg(Pbf)-2-chlorotriryl resin 566mg(0.3mmol)의 무게를 측정하고 펩타이드 합성 용기(재료 표 참조)에 추가합니다. 잘 정립된 고체상 펩타이드 합성(SPPS) 전략을 사용하여 펩타이드 합성을 수행합니다21.
    참고: 비천연 아미노산을 함유한 메틸화 또는 디메틸화 디펩타이드는 링크 아미드 수지(0.3mmol/g의 적재 용량)에 조립되었고, 천연 아미노산을 함유한 디펩타이드는 H-Arg(Pbf)-2-chlorotriryl 수지(0.3mmol/g의 적재 용량)와 같이 첫 번째 아미노산이 부착된 수지에 조립되었습니다. 중요한 것은 링크 아미드 수지가 C 단자 NH2로 덮인 펩타이드를 생성한다는 것입니다.
  2. 펩타이드 용기와 연결된 질소 가스 압력 하에서 N,N-디메틸포름아미드(DMF) 5mL에서 건조 수지를 1시간 동안 팽창시킵니다.
    알림: 흄 후드에서 전체 합성 과정을 수행하십시오. 고글, 장갑, 실험복은 실험 내내 착용해야 합니다. 타이머는 화학 시약 추가 단계 사이를 추적하기 위해 필수적입니다.
  3. 합성 공정 전반에 걸쳐 펩타이드 합성 용기와 연결된 질소 가스 압력을 사용하여 과도한 DMF를 제거합니다.
  4. Fmoc-trp(Boc)-OH(0.9mmol) 473.9mg과 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate(HBTU)(0.9mmol) 341mg을 커플링 시약으로 칭량합니다. 분말을 시험관에 넣고 5mL의 건조 DMF에 용해시킵니다.
  5. 활성화제인 N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA) 313.4μL(1.8mmol)을 시험관에 넣고(1.4단계) 튜브를 흔들어 혼합한다.
  6. 시험관의 내용물을 수지에 넣고 실온에서 질소 가스 하에서 1시간 동안 반응을 진행시킵니다. 그런 다음 질소 가스 압력을 사용하여 여분의 DMF를 배출하고 DMF로 수지를 3x 세척합니다.
  7. 질소 가스 하에서 20분 동안 DMF(v/v)에서 20% 피페리딘 5mL를 사용하여 N-말단 Fmoc를 보호합니다. DMF(3 x 5mL)로 수지를 3x 세척합니다.
  8. 디클로로메탄(DCM) 5mL를 첨가하여 수지를 건조시키고 질소 가스 하에서 5분 동안 유지한 후 질소 가스 압력으로 DCM을 배수합니다. 질소 가스 하에서 5mL의 메탄올을 5분 동안 첨가하여 수지의 건조도를 높입니다.
  9. 갓 준비한 TFA/티오아니솔/디티오트레이톨/아니솔(90:3:5:2 v/v/w/v)의 분열 칵테일 10mL를 2.5시간 동안 추가하여 모든 곁사슬을 보호하고 수지에서 디펩타이드를 절단합니다.
    주의: 분열 칵테일은 TFA가 산성이고 위험하므로 유리 측정 실린더에 추가해야 합니다. 사용할 때 주의하십시오.
  10. 2.5시간 후, 질소 압력을 사용하여 펩타이드 용기에서 반응 용액을 둥근 바닥 플라스크로 배출합니다. 250mL의 차가운 디에틸 에테르(Et2O)를 조 펩타이드가 들어 있는 둥근 바닥 플라스크에 첨가하여 펩타이드를 침전시킵니다.
  11. 물과 연결된 한쪽 팔이 있는 원뿔형 깔때기에서 여과지를 사용하여 침전된 펩타이드를 여과하고(수압으로 인해 여과가 발생하도록) 침전물(펩티드)을 수집하여 에테르를 완전히 제거합니다. 조잡한 펩티드는 10분 이내에 침전됩니다.
  12. 그래디언트 시스템을 사용하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 컬럼( 재료 표 참조)에서 미처리 펩타이드를 정제합니다. 0.1% TFA를 함유한 물에 0.1% TFA를 함유한 0%-100% 아세토니트릴의 그래디언트를 1mL/분의 유속으로 30-60분 동안 사용합니다.

figure-protocol-1
그림 2: W-R의 고체상 펩타이드 합성. 약어 : HBTU = 2- (1H- 벤조 트리아 졸 -1- 일) -1,1,3,3- 테트라 메틸 우로늄 육 플루오로 포스페이트; DIPEA = N, N- 디 이소 프로필 에틸 아민; TFA = 트리플루오로아세트산; DMF = 디메틸 포름 아미드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 합성된 펩티드의 세포 독성 측정

  1. SK-OV-3 세포의 2,000 세포/웰, MDA-MB-231 세포의 5,000 세포/웰 또는 CCRF-CEM 세포의 5 × 106 세포/웰(총 부피 100 μL/well)을 96-웰 마이크로플레이트에 플레이트화합니다. 75%-80% 농도에 도달할 때까지 37°C에서 5% CO2, 95% 공기의 가습 분위기에서 세포를 배양합니다.
    참고: RPMI-16 배지는 MDA-MB-231 및 SK-OV-3 세포주 모두에 대한 CCRF-CEM 세포 및 Eagle의 최소 필수 배지(EMEM)를 배양하는 데 사용됩니다. 두 배지 모두 10% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(0.9% NaCl에 페니실린 10,000단위/mL 및 스트렙토마이신 10mg/mL)이 보충되어 있습니다. 실험을 시작하기 전에 모든 배지와 보충제를 37°C 수조에 30분 동안 넣습니다. 실험은 생물 안전 후드를 착용하고 장갑과 실험복을 착용하고 수행해야 합니다.
  2. 피펫을 사용하여 배지를 흡입하고 양성 대조군으로 사용된 50μM 펩타이드 또는 10μM 독소루비신(Dox) 100μL를 96웰 플레이트에 플레이트된 세 가지 유형의 암세포를 포함하는 웰에 3회 첨가합니다. 플레이트를 72 시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다 (2.1 단계에서 언급 한 것과 동일한 조건에서).
  3. 72시간 후 20μL의 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium(MTS)을 96-well plate에 추가합니다. 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸고 가습 분위기에서 37 ° C에서 1-4 시간 동안 플레이트를 배양합니다.
    참고: MTS는 살아있는 세포만 MTS 테트라졸륨을 490nm에서 측정할 수 있는 유색 포르마잔 염료로 변환하기 때문에 살아있는 세포(처리되지 않았거나 펩타이드로 처리됨)를 시각화하는 데 사용되는 염료입니다.
  4. 마이크로플레이트 리더에서 490nm(A490)에서 포르마잔 제품의 흡광도를 측정합니다( 재료 표 참조). MTS와 혼합된 매체를 실험용 블랭크로 포함합니다. 물만 사용하고(펩타이드는 수용성이므로) 0.1N HCl(WCH3 는 용해를 위해 HCl이 필요함)을 음성 대조군으로 사용합니다.
  5. 스프레드시트 프로그램을 사용하여 다음 방정식(Eq 1)을 사용하여 세포 생존율을 측정합니다( Table of Materials(재료 표 참조). 이 절차는 Mandal et al20에서 사용한 것과 동일합니다.
    figure-protocol-2식(1)

3. c-Src 키나아제 활성 분석

참고: Src kinase 활성 분석은 Chhikara et al.22의 절차에 따라 상용 분석 키트(재료 표 참조)를 사용하여 삼중으로 수행되었습니다. WCH3 및 RCH3 단독으로 사용하여 메틸화 아미노산 단독이 키나아제에 미치는 영향과 다른 메틸화 또는 비메틸화 아미노산과 효과를 비교합니다.

  1. 384웰 저용량 검은색 비결합 표면 둥근 바닥 마이크로플레이트에서 분석 키트의 일부인 키나아제 완충액의 0.7nM His6-Src 키나아제 도메인을 포함하는 반응 칵테일 2.5μL를 10% DMSO(목표 농도의 4배)에 용해된 미리 희석된 펩타이드 2.5μL에 추가합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 마이크로플레이트 셰이커(5rpm)를 사용하여 실온에서 10분 동안 배양합니다.
    참고: 반응 칵테일은 키나아제 완충액(200mM HEPES, pH 7.5), MgCl2 (16mM), DMSO(4%), EGTA(8mM), 2-메르캅토에탄올(43mM) 및 Brij-35(0.04%)로 구성됩니다. 이 실험의 키나아제 반응의 최적 기질은 (AEEEIYGEFEAKKKK)입니다.
  2. 5 μL의 ATP/substrate(40 μM/600 μM) cocktail을 플레이트에 추가하고 실온의 microplate shaker에서 30분 동안 배양합니다.
  3. 한편, 8nM의 ADP 추적자와 10μg/mL의 염료 접합 ADP2 항체( 재료 표 참조)를 포함하는 1x ADP 검출 혼합물을 정지에 준비하고 키트에서 버퍼 B(1x)를 검출합니다. 1x ADP 검출 혼합물 10μL를 첨가하여 키나아제 반응(단계 3.2)을 중지하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
  4. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 580nm에서 여기, 630nm에서 방출, 10nm 대역 폭으로 형광 강도를 측정합니다. 기기에서 상대 형광 단위(RFU)를 구하여 Eq(2)에 따라 효소 억제의 백분율을 구합니다.
    figure-protocol-3식(2)
  5. 회사 웹 사이트에 나열된 IC50 값을 계산하십시오23.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W-RCH3, WCH3-R CH3, W-R(CH3)2, WCH3-R, WCH3-R(CH3)2 및 대조군 W-R 펩티드는 각각 95%, 98.7%, 99%, 100%, 100% 및 99.5% 순도를 가진 Fmoc 고체상 펩타이드 합성(그림 3)을 사용하여 합성했습니다. 이러한 디펩타이드의 화학 구조는 ESI-MS를 사용하여 확인되었습니다. 이들 디펩타이드의 m/z 값은 각각 374.1624, 388.1949, 388.1794, 374.1815, 402.2022, 361.1457이었다.

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Src 키나아제의 억제와 그에 따른 암세포의 사멸을 위해 여기에서 제조 및 테스트된 펩타이드는 비천연 아미노산인 메틸화 트립토판 및/또는 메틸화 아르기닌을 함유하고 있습니다. 디 에틸 에테르를 첨가 할 때 백색 침전물의 형성은 이러한 펩티드의 합성에서 중요한 단계입니다. 그러나 모든 합성 펩티드가 침전물을 형성할 수 있는 것은 아닙니다. 따라서 침전물이 형성되지 않은 경우에도 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)을 사용하여 원하는 질량을 측정하여 성공적인 펩타이드 합성을 확인할 수 있습니다. 펩타이드 질량은 펩티드의 1H-NMR 스펙트럼을 예측하기 위해 추가로 사용될 수 있습니다. 비천연 아미노산은 천연 아미노산보다 프로테아제에 의한 단백질 분해 분해에 더 안정적이고 저항성이 있는 것으로 알려져 있으며(25), 따라서 Src 키나아제 활성을 더 잘 억제할 수 있다. 또한, 메틸화 알라닌(즉, α-아미...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 내용이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

보조금 번호로 이 프로젝트에 자금을 지원한 사우디아라비아 제다에 있는 King Abdulaziz University(KAU)의 과학 연구 학장(DSR)에게 감사드립니다. (G:031-130-1443).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-DithiothreitolSigma-Aldrich10708984001펩타이드 합성
고체상 합성을 위한 Aldrich fritted 필터 깔때기Sigma-AldrichZ283304펩타이드 합성 용기
Alexa594 TracerBell Brook Labs, Madison, WI3013
AnisoleSigma-Aldrich8014520500
CellTiter 96 A대형 제품  해결책  세포 증식 분석 시약 PromegaG3582세포 증식 분석(MTS 시약)
디클로로메탄, 99.9%, 엑스트라 드라이피셔시AC326850025
Fmoc-ADMA(Pbf)-OH시그마-알드리치8521070001
Fmoc-Arg(Me,Pbf)-OH시그마-알드리치8521050001
Fmoc-Arg(Pbf)-OH시그마-알드리치8520670025
Fmoc-Trp(Boc)- OHSigma-Aldrich47561-25G-F
HPLC C18 컬럼 시마즈  (RP-HPLC 시스템)물/아세토니트릴 그라디언
IRDye QC-1 담금화제Bell Brook Labs, Madison, WI3013
마이크로플레이트 리더 SpectraMax M2e분자 장치
Microsoft ExcelMicrosoft스프레드시트 소프트웨어
N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA)시그마-알드리치496219
N,N-디메틸포름아미드, 무수, 99.8%FishersciAA43997M1
Piperidine 20%Sigma-Aldrich80645
링크 아미드 수지(100-200 메쉬)Sigma-Aldrich8550010025
ThioanisoleSigma-Aldrich92358
Transcreener ADP2 FI AssayBell Brook Labs, Madison, WI3013c-Src kinase activity assay kit
트

References

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