Method Article

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에 대한 미세 전극 어레이 및 패치 클램프 기록의 기술적 응용

DOI:

10.3791/64265

⸱

August 4th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CM)는 약물 유도 심장 독성 스크리닝 및 질병 모델링을위한 유망한 시험관 내 모델로 부상했습니다. 여기에서는 hiPSC-CM의 수축성과 전기 생리학을 측정하기위한 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

Abstract

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약물 유발 심장 독성은 약물 소모 및 시장 철수의 주요 원인입니다. 따라서 적절한 전임상 심장 안전성 평가 모델을 사용하는 것은 약물 개발 과정에서 중요한 단계입니다. 현재 심장 안전성 평가는 여전히 동물 연구에 크게 의존하고 있습니다. 그러나 동물 모델은 종 특이적 차이, 특히 심장 전기생리학적 특성 측면에서 인간에 대한 열악한 번역 특이성에 시달리고 있습니다. 따라서, 전임상 심장 안전성 평가를 위한 신뢰할 수 있고, 효율적이며, 인간 기반 모델을 개발하는 것이 시급하다. 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CM)는 약물 유도 심장 독성 스크리닝 및 질병 모델링을위한 귀중한 시험 관 내 모델로 부상했습니다. hiPSC-CM은 다양한 유전적 배경과 다양한 질병 상태를 가진 개인으로부터 얻을 수 있으므로 약물 유발 심장 독성을 개별적으로 평가하는 데 이상적인 대용물입니다. 따라서 hiPSC-CM의 기능적 특성을 종합적으로 조사할 수 있는 방법론을 수립할 필요가 있다. 이 프로토콜에서는 수축성, 전계 전위, 활동 전위 및 칼슘 처리 측정을 포함하여 hiPSC-CM에서 평가할 수 있는 다양한 기능 분석에 대해 자세히 설명합니다. 전반적으로 hiPSC-CM을 전임상 심장 안전성 평가에 통합하면 약물 개발에 혁명을 일으킬 잠재력이 있습니다.

Introduction

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약물 개발은 길고 비용이 많이 드는 과정입니다. 2009년과 2018년 사이에 미국 식품의약국(FDA)에서 승인한 신약 치료에 대한 연구에 따르면 자본화된 연구 및 임상 시험의 예상 중간비용은 제품당 9억 8,500만 달러였습니다1. 약물 유발 심장 독성은 약물 소모 및 시장 철수의 주요 원인입니다2. 특히, 심장 독성은 여러 종류의 치료 약물3에서 보고됩니다. 따라서 심장 안전성 평가는 약물 개발 과정에서 중요한 구성 요소입니다. 심장 안전성 평가를위한 현재의 패러다임은 여전히 동물 모델에 크게 의존합니다. 그러나, 동물 모델의 사용으로부터의 종 차이는 인간 환자에서 약물 유도 심장 독성에 대한 부정확 한 예측의 주요 원인으로 점점 더 인식되고있다4. 예를 들어, 심장 활동 전위의 형태는 상이한 재분극 전류5로부터의 기여로 인해 인간과 마우스 사이에 실질적으로 다르다. 또한, 심장 생리학에 영향을 줄 수있는 심장 미오신 및 원형 RNA의 차등 이소 형은 종 6,7에서 잘 문서....

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Protocol

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1. 매체 및 용액 준비

  1. 50x B27 보충제 10mL 병과 RPMI 1640 배지 500mL를 혼합하여 hiPSC-CM 유지 배지를 준비합니다. 배지를 4 ° C에 보관하고 한 달 이내에 사용하십시오. 사용하기 전에 매체를 실온(RT)으로 평형화하십시오.
  2. 혈청 대체 배지 20mL와 hiPSC-CM 유지 배지 180mL(10% 희석, v/v)를 혼합하여 hiPSC-CM 파종 배지를 준비합니다. 신선하게 준비된 파종 배지가 선호되지만 4 ° C에서 2 주 이상 보관할 수 없습니다. 사용하기 전에 매체를 RT와 평형화하십시오.
  3. 4°C에서 하룻밤 동안 기저막 매트릭스 1병(10mL)을 해동하고 멸균된 1.5mL 튜브에서 기저막 매트릭스 500μL를 분취하여 세포외 매트릭스 코팅 용액을 준비합니다. 추가 사용을 위해 -20 °C에서 보관하십시오. 500μL의 기저막 매트릭스와 100mL의 얼음처럼 차가운 DMEM/F12 배지(1:200 희석, v/v)를 혼합하여 기저막 매트릭스 코팅 용액을 만듭니다.
  4. 135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.8 mMCaCl2, 5 mM 포도당 및 10 mM 헤페스를 포함하는 50 mL의 티로드 용액....

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Results

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이 프로토콜은 hiPSC-CM의 수축 운동, 전계자전위, 활동전위 및Ca 2+ 과도 상태를 측정하는 방법을 설명합니다. 효소 소화, 세포 파종, 유지 및 기능 분석 전도를 포함하는 개략도가 그림 1에 나와 있습니다. hiPSC-CM 단층의 형성은 수축 운동 측정에 필요합니다(그림 2B). hiPSC-CM의 수축-이완 운동의 대표적인 흔적이 그림 2C에 나와 있습니다. 분석기 소프트웨어를 사용하면 기본 설정을 사용하여 수축 시작, 수축 피크, 수축 종료, 이완 피크 및 이완 종료를 감지하여 자동화된 방식으로 수축-완화 동작 추적을 분석할 수 있습니다(그림 2D). 수축 및 이완 피크의 속도는 hiPSC-CM의 수축 및 이완 능력을 평가하는 데 사용됩니다. 또한, 수축 및 이완 변형 거리도 얻을 수있다.......

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Discussion

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인간 iPSC 기술은 질병 모델링 및 약물 스크리닝을 위한 강력한 플랫폼으로 부상했습니다. 여기에서는 hiPSC-CM 수축성, 전계자전위, 활동전위 및Ca2+ 과도 상태를 측정하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 hiPSC-CM 수축성 및 전기 생리학의 포괄적인 특성화를 제공합니다. 이러한 기능적 분석은 우리 그룹 12,13,18,24,25,26,27의 여러 간행물에 적용되었습니다.

양호한 박동 조건에 있는 hiPSC-CM을 사용하.......

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Disclosures

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J.C.W.는 Greenstone Biosciences의 공동 설립자이지만 여기에 제시된 작업이 완전히 독립적이기 때문에 경쟁 이익이 없습니다. 다른 저자들은 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

Acknowledgements

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원고를 교정해 주신 Blake Wu에게 감사드립니다. 이 작업은 국립 보건원 (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 및 NASA NNX16A069A (JCW) 및 AHA 박사후 연구원 872244 (GMP)의 지원을 받았습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
20mm 마이크로 웰 #1.5 커버 유리가 있는 35mm 유리 바닥 접시CellvisD35-20-1.5-N패치 클램프
50x B27 보충제Life Technologies17504-044hiPSC-CM 배양 배지
6웰 배양 플레이트E & K ScientificEK-27160hiPSC-CM 배양
96웰 플랫 클리어 바텀 블랙 폴리스티렌 TC 처리 마이크로플레이트Corning3603수축 모션 측정
AccutaseSigma-AldrichA6964효소 해리
Axion의 Integrated Studio(AxIS)Axion Biosystems네비게이터 소프트웨어
붕규산 유리 모세관Harvard ApparatusBF 100-50-10,패치 클램프
CaCl2 1 M in H2OSigma-Aldrich21115Tyrode ' s 솔루션
세포 계수 챔버 슬라이드ThermoFisher ScientificC10228세포 계수
CytoView 48웰 MEA 플레이트Axion BiosystemsM768-tMEA-48BMEA
DMEM/F12Gibco/Life Technologies12634028외 매트릭스 매체
DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음Fisher Scientific14-190-250
EGTASigma-AldrichE3889세포 내 피펫 솔루션
EPC 10 USB  패치 클램프 증폭기Warner Instruments89-5000패치 클램프
Fura-2, AM, 셀 퍼meantThermoFisher ScientificF1221Ca2+ 과도 측정
포도Sigma-AldrichG8270Tyrode' s 솔루션
HEPES시그마-알드리치H3375티로드' s 솔루션
hiPSCStanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank
KClSigma-Aldrich529552Tyrode ' s 솔루션
KnockOut 세럼 교체용ThermoFisher Scientific10828-028hiPSC-CM 시딩 매체
KOH 8  MSigma-AldrichP4494세포 내 피펫 솔루션
Lambda DG 4Sutter Instrument CompanyCa2+ 과도 측정; 초고속 파장 스위칭 광원
Luna-FL 자동 형광 세포 카운터WISBIOMEDLB-L20001세포 계수
기 Maestro Pro  MEA 시스템Axion BiosystemsMEA
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane MatrixCorning356231세포외 매트릭스
배지 MgATPSigma-AldrichA9187세포내 피펫 솔루션
MgCl2Sigma-AldrichM8266Tyrode' s 솔루션
NaClSigma-AldrichS9888Tyrode' s 용액
NaOH 10  M시그마-알드리치72068티로드 s 솔루션
NIS Elements AR
Pluronic F-127 (DMSO의 20% 용액)ThermoFisher ScientificP3000MPCa2+ 과도 측정
RPMI 1640 mediumLife Technologies11875-119hiPSC-CM 배양 배지
Sony SI8000 Cell Motion Imaging SystemSony BiotechnologyContraction motion measurement
Sutter Micropipette 풀러Sutter InstrumentsP-97패치 클램프
Trypan 블루 스테인Life TechnologiesT10282세포 계수
세포 당

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
  2. Pang, L., et al.

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