단일 분자 국소화 현미경을 사용한 세포 핵의 절대 DNA 밀도 매핑

Summary

본 프로토콜은 단일 분자 국소화 현미경 데이터, 알려진 부피, 게놈 크기 및 세포 주기 단계의 보로노이 테셀레이션을 사용하여 부착 세포 핵 내의 절대 DNA 밀도를 측정하는 방법을 설명합니다.

Abstract

세포핵 내에서 침묵 유전자는 일반적으로 헤테로크로마틴이라고 하는 고밀도의 염색질 영역에 위치하는 반면, 활성 유전자는 대부분 염색질과 유크로마틴이라고 하는 염색질 간 공간 사이의 경계면에서 발견될 수 있습니다. 현재 eu- 및 heterochromatin의 특성화는 대부분 DNA 서열을 따라 히스톤 단백질의 후생유전학적 변형을 기반으로 하는 반면, 세포핵 전체의 절대 DNA 밀도와 그 기능적 의미에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 고분자로서 염색질의 특성에 대한 생화학적 데이터와 가정만을 기반으로 하는 핵 모델은 여전히 고해상도 현미경으로 생성된 이미징 데이터와 근본적으로 다릅니다. 이는 구조적으로 관련된 중요한 정보가 여전히 누락되었음을 나타냅니다. 우리는 공간적 제약이 유전자 조절에 관여할 수 있다고 믿기 때문에 Voronoi 테셀레이션을 통해 초고해상도 국소화 데이터를 실제 밀도 맵으로 변환하여 포유류 세포 핵의 절대 DNA 밀도를 측정할 수 있는 방법을 개발했습니다.

Introduction

세포 생물학의 초창기부터 유전 정보의 자리인 세포핵은 생물학자들을 매료시켜 왔습니다. 자체 개발한 세포학적 염색 방법을 적용한 후 Emil Heitz는 1928년에 세포핵¹ 내에서 다르게 강렬하게 염색된 영역을 발견했습니다. 그는 더 강하게 염색되고 밀도가 높은 영역을 "헤테로크로마틴"이라고 불렀고, 덜 강하게 염색되고 밀도가 낮은 영역을 "유크로마틴"이라고 불렀습니다. 시간이 지남에 따라 활성 유전자는 대부분 유크로마틴에 위치하는 반면, 밀도가 높은 영역은 반복적인 요소와 침묵 유전자가 풍부한 것으로 밝혀졌습니다. 헤테로크로마틴과 유크로마틴이라는 용어는 그 정의가 구조적 특성에서 분자적 특성으로 변경되었지만 오늘날까지 살아남았습니다(아래 참조). 오늘날 우리는 세포핵이 두 가지 주요 단계로 나뉘어 있다는 것을 알고 있습니다. 하나의 액체(염색질 구획)는 핵체, 접합 구획 및 핵질을 수용하고, 다른 하나는 염색체 영역과 핵소체를 포함하는 고체의 하이드로겔과 같은 염색질 도메인^{입니다 2.} 염색질 간 공간과의 경계면에서 염색질은 밀도가 낮고 전사, 복제 및 복구와 같은 유전적으로 활성 과정이....

Protocol

참고: 그림 3 은 이 섹션에 설명된 워크플로에 대한 개요를 제공합니다. 이 프로토콜에 사용되는 시약, 재료, 장비 및 소프트웨어와 관련된 자세한 내용은 재료 표 를 참조하십시오. 이 출판물에 사용된 코드는 https://github.com/irradiator/Mapping-absolute-DNA-density-in-cell-nuclei-using-SMLM-microscopy 에서 보고 다운로드할 수 있습니다.

1. 세포 배양

1. 5% CO가 보충된 가습 분위기에서 37°C에서 10% 소 태아 혈청이 보충된 DMEM에서 C3H10T1/2, HFB 및 HeLa 세포를 배양_합니다. 세포가 융합에 가까워지면 세포를 각각 1:3(C3H10T1/2, HFB) 및 1:10(HeLa)의 비율로 분할하여 계대배양합니다.
2. 측정을 수행하기 하루 전에, 기하급수적으로 성장하는 배양물의 세포를 35mm 격자 접시에 파종합니다. 관찰 접시가 형광 현미경(두께 170μm의 유리 바닥, #1.5)을 위한 우수한 광학 품질을 제공하고 세포를 명....

Results

그림 5에 표시된 HeLa 핵은 섹션 3의 CellProfiler4.2.1에 의해 생성된 표에서 G₁ 상의 핵을 나타내는 그림 5에 표시된 히스토그램의 첫 번째 피크에 가까운 통합 형광 강도를 갖도록 선택되었습니다. 작은 크기와 뚜렷한 내부 구조를 감안할 때 유사분열 후 염색질을 탈응축하는 과정에 있는 초기 G₁ 핵일 가능성이 높습니다. G₁에 있다는 것은 계산을 위해 3N(~9 × 10⁹ bp)의 DNA 함량을 가정할 수 있음을 의미합니다(보충 그림 S1 참조). 50,000개의 프레임으로 구성된 fBALM 측정은 100nm 두께의 광학 중간 부분 내에서 2.68 ×^{10 6}개의 국소화가 감지되었습니다(

Discussion

이 기사에서는 SMLM을 사용하여 포유류 세포 핵의 절대 DNA 밀도를 측정하는 방법을 간략하게 설명합니다. 또한 배양 세포의 세포 주기 단계를 결정하는 방법과 이 정보를 사용하여 경광학 초박형에 존재하는 DNA의 양을 추정하는 방법을 시연했습니다. 또한 fBALM SMLM 현미경을 위한 부착 세포의 준비와 세포 핵에서 게놈 DNA의 초분해능 현미경 이미지를 생성하기 위해 SMLM 데이터를 처리하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 마지막으로, 프로토콜은 SMLM 데이터의 Voronoi 테셀레이션이 세포 핵 내의 절대 DNA 밀도를 계산하기 위해 이미지화된 광-광학 섹션의 DNA 추정치와 결합될 수 있는 방법을 보여줍니다.

국소화 현미경은 최근 핵 구조에 대한 연구를 위한 강력한 도구로 인기를 얻고 있으며 최근 흥미로운 질문, 즉 게놈의 접근성 및 클러스터 경향에 대한 코히신 및 BRD2의 영향

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<강>세포 배양
µ-디쉬 35mm, 하이 그리드-500 유리 바닥	이비디	81168
C3H 10T1/2	IMB (니어스 연구실)
DMEM	서모피셔	12320032
dPBS	서모피셔	14190144
FBS	라이프 테크놀로지	16000-044
헬러	현미경 코어 시설(IMB)
HFB	IMB (쿠벤 연구소)
L-글루타민	시그마-올드리치	G7513
HFB에 대한 비필수 아미노산과 비타민
피루브산나트륨	S8636
<강>샘플 준비
카탈라제	머 크	2593710
포도당	서모피셔	241922500
포도당 산화효소	머 크	49180
파라포름알데히드	시그마-올드리치	158127
RNase 칵테일	서모피셔	AM2286
시톡스 오렌지	서모피셔	S11368
테트라스펙 형광 미세구 샘플러 키트	서모피셔	T7284
트리톤 X-100	서모피셔	327372500
Software
바이오포맷	OpenMicroscopy.org		오픈 소스 소프트웨어 https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/
셀프로파일러 v4.2.1	CellProfiler.org		오픈 소스 소프트웨어 https://cellprofiler.org
피지	nih.gov		오픈 소스 소프트웨어 https://imagej.net/software/fiji/?Downloads
땅	nih.gov		오픈 소스 소프트웨어 https://github.com/Jan-NM/LAND
매트랩 2021	수학 저작		상업용 소프트웨어 - "이미지 처리 도구 상자"가 필요하다
R 4권.. 0.3	r-project.org		오픈 소스 소프트웨어 https://www.r-project.org
썬더스톰 v1.3			오픈 소스 소프트웨어 https://zitmen.github.io/thunderstorm/
<스트롱>현미경:
AF 7000	라이카
라이카 GSD	라이카
SMLM 현미경	크레머 연구소		Dr. S-Y가 맞춤 제작했습니다. 첸