단일 분자 국소화 현미경을 사용한 세포 핵의 절대 DNA 밀도 매핑

Summary

본 프로토콜은 단일 분자 국소화 현미경 데이터, 알려진 부피, 게놈 크기 및 세포 주기 단계의 보로노이 테셀레이션을 사용하여 부착 세포 핵 내의 절대 DNA 밀도를 측정하는 방법을 설명합니다.

Abstract

세포핵 내에서 침묵 유전자는 일반적으로 헤테로크로마틴이라고 하는 고밀도의 염색질 영역에 위치하는 반면, 활성 유전자는 대부분 염색질과 유크로마틴이라고 하는 염색질 간 공간 사이의 경계면에서 발견될 수 있습니다. 현재 eu- 및 heterochromatin의 특성화는 대부분 DNA 서열을 따라 히스톤 단백질의 후생유전학적 변형을 기반으로 하는 반면, 세포핵 전체의 절대 DNA 밀도와 그 기능적 의미에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 고분자로서 염색질의 특성에 대한 생화학적 데이터와 가정만을 기반으로 하는 핵 모델은 여전히 고해상도 현미경으로 생성된 이미징 데이터와 근본적으로 다릅니다. 이는 구조적으로 관련된 중요한 정보가 여전히 누락되었음을 나타냅니다. 우리는 공간적 제약이 유전자 조절에 관여할 수 있다고 믿기 때문에 Voronoi 테셀레이션을 통해 초고해상도 국소화 데이터를 실제 밀도 맵으로 변환하여 포유류 세포 핵의 절대 DNA 밀도를 측정할 수 있는 방법을 개발했습니다.

Introduction

세포 생물학의 초창기부터 유전 정보의 자리인 세포핵은 생물학자들을 매료시켜 왔습니다. 자체 개발한 세포학적 염색 방법을 적용한 후 Emil Heitz는 1928년에 세포핵¹ 내에서 다르게 강렬하게 염색된 영역을 발견했습니다. 그는 더 강하게 염색되고 밀도가 높은 영역을 "헤테로크로마틴"이라고 불렀고, 덜 강하게 염색되고 밀도가 낮은 영역을 "유크로마틴"이라고 불렀습니다. 시간이 지남에 따라 활성 유전자는 대부분 유크로마틴에 위치하는 반면, 밀도가 높은 영역은 반복적인 요소와 침묵 유전자가 풍부한 것으로 밝혀졌습니다. 헤테로크로마틴과 유크로마틴이라는 용어는 그 정의가 구조적 특성에서 분자적 특성으로 변경되었지만 오늘날까지 살아남았습니다(아래 참조). 오늘날 우리는 세포핵이 두 가지 주요 단계로 나뉘어 있다는 것을 알고 있습니다. 하나의 액체(염색질 구획)는 핵체, 접합 구획 및 핵질을 수용하고, 다른 하나는 염색체 영역과 핵소체를 포함하는 고체의 하이드로겔과 같은 염색질 도메인^{입니다 2.} 염색질 간 공간과의 경계면에서 염색질은 밀도가 낮고 전사, 복제 및 복구와 같은 유전적으로 활성 과정이 대부분 일어나는 곳입니다 ^3,4,5, 라미나에 인접한 반면, 핵소체 주변 및 중심체 근처에서 염색질은 높은 압축 수준을 나타내며 일반적으로 전사적으로 다소 비활성입니다⁶.

분자 수준에서 염색질은 뉴클레오솜(핵심 히스톤 단백질의 옥타머)을 감싸는 DNA로 구성됩니다. 히스톤은 여러 화학 그룹(메틸-, 아세틸, 인-, 비오틴), 아미노산(아르기닌) 또는 단백질(SUMO, 유비퀴^틴)을 추가하여 번역 후 변형될 수 있는 본질적으로 무질서한 꼬리 도메인을 가지고 있습니다7. 이러한 변형은 다른 단백질(예: 염색질 리모델링제, HP1, 복구 단백질, RNA)을 읽고 끌어당길 수 있으며, 따라서 서열을 직접 변경하지 않고 DNA 서열의 생리학적 상태(전사적으로 허용적/제한적)를 정의할 수 있습니다(따라서 "에피"유전적)⁷. 특정 서열에 대한 변형의 유형과 수는 세포 유형마다 크게 다를 수 있으며 가역적이며 발달, 노화 및 질병 전반에 걸쳐 변할 수 있습니다 ^8,9,10. 고도로 전사된 영역에서 더 널리 퍼진 히스톤 꼬리의 변형과 전사 활성이 거의 또는 전혀 없는 게놈 영역에서 우세한 변형이 있습니다.

예를 들어, H3K4 변형이 풍부하거나 히스톤 꼬리가 아세틸화된 고도로 전사된 영역은 일반적으로 유크로마틴으로 설명되는 반면, 억제성 히스톤 변형이 풍부한 영역(H3K9me3, H3K27me3 또는 H4K20me3)은 헤테로크로마틴으로 지칭되며, 이는 구성적 이색색질(모든 세포에서 전사적으로 비활성)(예를 들어, H4K20me3) 및 통성 이색질질(세포 유형에 따라 침묵된 염색질, 예: H3K27me3)⁶. 생화학적 및 분자 생물학적 방법은 서열 수준에서 화학적 변화를 측정하는 데 매우 적합하지만 이러한 방법을 사용하여 중간 규모의 공간 특성에 대한 진술을 하는 것은 훨씬 더 어렵습니다.

예를 들어, 게놈의 공간 모델을 재구성하기 위해 서열 영역 사이의 DNA의 근접성을 감지하고 매핑하는 Hi-C 실험의 근접 정보를 사용하여 시도가 이루어졌습니다¹¹. 그러나 고해상도 광학 및 전자 현미경 이미지와 직접 비교하면 이것이 제한된 범위에서만 가능하다는 것을 알 수 있습니다(그림 1). Hi-C¹²와 같은 방법은 간기 세포의 염색체 영역을 별도의 개체로 정확하게 감지할 수 있지만, DNA 서열 근접성만으로는 게놈의 더 먼 부분 간의 공간적 관계를 반영할 수 없기 때문에 이러한 모델은 오히려 "근시"입니다. 따라서 밀도 차이도 접촉 주파수 정보로 제대로 반영할 수 없습니다. 이것은 핵에서 게놈의 "스파게트화된" 표현으로 이어지며( 그림 1B 참조), 이는 양모와 같고 자유롭게 접근할 수 있는 루프의 공에서 발생하는 것으로 보입니다.

생화학적 정보와 생물물리학 및 구조적 데이터를 결합한 핵에 대한 통합적이고 보다 현실적인 그림을 위한 길을 닦으려면 핵 조직의 다양한 측면에 대한 데이터를 생성할 수 있는 방법을 개발해야 합니다. 최근까지 이미징 데이터에서 세포핵의 절대 DNA 밀도를 결정하는 것도 어려웠습니다. 그 이유는 기존 광학 현미경의 제한된 해상도, DNA를 특이적으로 염색하는 전자 현미경의 문제, 전자 현미경의 관찰 부피가 작기 때문입니다.

기존 형광 현미경의 해상도는 빛의 회절에 의해 제한됩니다. 점 광원의 이미지는 회절 한계로 인해 분산 되며 PSF(Point-Spread-Function )로 설명할 수 있습니다. PSF에 따르면, 점원으로 잘 근사화할 수 있는 형광단의 이미지는 원천(형광단) 주위에 특정 크기의 부피를 차지합니다¹³. 회절 제한 이미지의 치수보다 서로 훨씬 더 가깝게 위치한 많은 형광단이 동시에 여기되면 이미지화된 강도 분포가 중첩되고 단일 형광단의 위치를 확인할 수 없습니다. 형광단의 순차적 확률론적 발광(깜박임)을 통해 개별 분자를 광학적으로 분리할 수 있으므로 신호의 강도 중력 중심을 결정하여 정확한 위치를 찾을 수 있습니다.

이는 많은 기록된 이미지에서 형광단 국소화 데이터를 축적하여 샘플의 구조 정보를 재구성하는 데 사용될 수 있습니다. 이 방법은 일반적으로 단일 분자 국소화 현미경(SMLM)이라고 합니다(자세한 내용은¹⁴ 참조). 형광단이 '온 시간' 동안 방출하는 광자가 많을수록 강도 중력 중심을 더 정확하게 결정할 수 있습니다. 빔 경로의 난시 렌즈는 광학 초점면 위 또는 아래에 있는 형광단의 신호를 타원으로 변환하여 광축을 따라 위치를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 초점면 아래의 형광 신호에서 발생하는 타원의 긴 축은 초점면 위의 형광단에서 발생하는 타원의 축에 비해 90°로 회전합니다. 또한, 이러한 타원의 축 비율은 ±300 nm¹⁵ 범위 내에서 초점면에 대한 광축을 따라 분자의 위치를 결정할 수 있게 한다.

확률론적 깜박임 이벤트의 재구성에 의해 생성된 초고해상도 이미지의 품질은 라벨링 밀도와 깜박임 이벤트의 수에 크게 좌우됩니다. 후자는 형광단의 광안정성과 결국 실패하기 전의 깜박임 이벤트의 수(켜기/끄기 주기 수)에 따라 달라집니다. 핵내 DNA 분포의 초고해상도 이미지를 얻기 위해 여기에 설명된 방법을 fBALM(DNA 구조 변동 보조 결합 활성화 국소화 현미경)이라고 합니다. 이는 핵산에 일시적으로 삽입되고 DNA에 결합된 후에만 형광을 발하는 형광단을 기반으로 합니다^16,17. 인광체-디에스테르 백본의 하전된 잔기로 인해 DNA는 음전하가 높은 폴리머입니다. 살아있는 세포에서 상보적인 DNA 가닥의 안정화는 양전하를 띤 단백질(예: 히스톤)과 이온에 의한 중화가 필요합니다. pH를 낮춤으로써, 염기의 상보적 쌍의 안정성이 감소하여 삽입 염료가 안팎으로 확산될 수 있도록 한다^16,17.

삽입 형광 염료에 따라 특정 pH 범위 내에서 이 상태에 도달할 수 있습니다. YoYo-1 및 SYTOX Orange와 같은 형광 염료는 DNA에 결합할 때만 형광을 발하며, 삽입 염료(Hoechst 및 4',6-디아미디노-2-페닐인돌[DAPI]와 같이 DNA의 작은 홈에 결합하는 염료와 대조적으로)는 일반적으로 서열 독립적인 방식으로 결합하기 때문에 국소화 현미경을 통해 세포-핵 내 DNA 분포를 매핑하는 데 매우 적합합니다.

Voronoi 테셀레이션은 점의 위치에 따라 공간을 다른 파티션으로 세분화할 수 있는 수학적 방법입니다. 2D-Space에서 결과 타일의 크기는 점¹⁸의 밀도의 역수를 반영합니다. 국소화 현미경은 이미지를 형광단의 위치를 나타내는 점 집합으로 재구성하기 때문에 Voronoi 테셀레이션은 국소화 신호의 밀도를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다(그림 2). 따라서 DNA 특이적 염료를 형광단으로 사용하면 DNA 밀도를 측정할 수 있습니다.

DNA 함량(염기쌍 수)과 핵의 공간적 차원에 대한 선험적 지식은 상대적인 DNA 밀도를 절대 DNA 밀도로 변환할 수 있게 해줍니다. 다음 프로토콜은 매우 높은 해상도로 SMLM을 사용하여 부착 세포에서 절대 DNA 밀도의 매핑을 보여주고 이러한 밀도가 큰 변화를 겪는다는 것을 보여줍니다.

Protocol

참고: 그림 3 은 이 섹션에 설명된 워크플로에 대한 개요를 제공합니다. 이 프로토콜에 사용되는 시약, 재료, 장비 및 소프트웨어와 관련된 자세한 내용은 재료 표 를 참조하십시오. 이 출판물에 사용된 코드는 https://github.com/irradiator/Mapping-absolute-DNA-density-in-cell-nuclei-using-SMLM-microscopy 에서 보고 다운로드할 수 있습니다.

1. 세포 배양

1. 5% CO가 보충된 가습 분위기에서 37°C에서 10% 소 태아 혈청이 보충된 DMEM에서 C3H10T1/2, HFB 및 HeLa 세포를 배양_합니다. 세포가 융합에 가까워지면 세포를 각각 1:3(C3H10T1/2, HFB) 및 1:10(HeLa)의 비율로 분할하여 계대배양합니다.
2. 측정을 수행하기 하루 전에, 기하급수적으로 성장하는 배양물의 세포를 35mm 격자 접시에 파종합니다. 관찰 접시가 형광 현미경(두께 170μm의 유리 바닥, #1.5)을 위한 우수한 광학 품질을 제공하고 세포를 명확하게 찾을 수 있는 그리드를 갖추고 있는지 확인하십시오. 또한 세포가 단일 세포 현탁액에 있고 접시 표면의 전체 영역이 세포로 균일하게 덮여 있는지 확인하십시오.
   참고: 특정 세포 주기 단계에 할당된 정확한 세포를 다시 한 번 찾기 위해 각인된 그리드가 있는 접시를 사용하는 것이 좋습니다.
3. 실험에서 필요한 경우, 100nM 트리코스타틴 A(TSA)를 세포 배양 배지에 첨가하고 1.1단계에서 이전에 설명한 조건에서 세포를 배양합니다.

2. 샘플 준비

1. 측정 당일 세포를 1x DPBS로 한 번 세척한 후 1x DPBS의 4% 파라포름알데히드(PFA)에 30분 동안 고정합니다.
   참고: 재현 가능한 결과를 얻으려면 매번 새로운 PFA 용액을 준비하고 PFA 농도가 정확한지 각별히 주의하십시오.
2. 고정액을 제거한 후, 0.4% Triton X-100을 함유한 1x DPBS에서 20분 동안 투과화하기 전에 세포를 1x DPBS로 다시 2회 세척합니다.
3. 피펫으로 투과화 완충액을 제거하고 RNase 칵테일(1x DPBS에서 1:1,000 희석)으로 세포를 처리하기 전에 1x DPBS로 추가 세척 단계를 수행합니다. 세포를 가습 챔버에서 37°C에서 30분 동안 인큐베이터에 넣습니다.
4. fBALM 가능 SYTOX Orange 원액(1:10,000 희석에서 1x DPBS에서 5mM)을 희석하여 염색 용액을 준비합니다.
5. 피펫을 사용하여 RNase 완충액을 제거하고 염색 용액을 추가하기 전에 1x DPBS로 추가 세척 단계를 적용합니다. 가습 챔버에서 실온에서 세포를 5분 동안 배양합니다.
6. 피펫으로 세포에서 SYTOX Orange 염색 용액을 제거하고 1x DPBS로 세척한 다음 강광으로부터 보호된 1x DPBS에 세포를 보관합니다.

3. 세포 측정 세포 주기 결정

참고: 이 단계에서는 거꾸로 된 고함량 스크리닝 현미경이 여기에 사용되었지만 자동화된 역 광시야 형광 현미경을 사용할 수 있습니다. 전체 핵의 강도는 DNA 함량의 척도입니다. 따라서 공초점 시스템을 사용하는 경우 핀홀을 완전히 열어야 합니다. 낮은 개구수(NA) 대물렌즈는 오일 침지 대물렌즈보다 바람직합니다.

1. 세포가 있는 접시를 전동 스테이지와 소프트웨어가 장착된 역형광 현미경에 놓아 자동으로 기록된 이미지를 함께 연결하여 샘플의 넓은 영역을 재구성할 수 있습니다.
2. 세포 주기 결정을 위한 이미지 획득이 합리적인 시간 내에 수행될 수 있도록 시야당 충분한 세포(총 최소 900개의 단일 핵[자세한 내용은 Roukos et ^al.19 참조])를 기록할 수 있는 대물 렌즈를 선택하십시오. 중심과 경계 사이의 강도 차이가 크지 않은 렌즈를 사용하십시오. 이러한 렌즈를 사용할 수 없는 경우 이미지에 플랫 필드 보정을 적용합니다(7단계 참조). 이 프로토콜을 따르려면 초점 심도 = 8μm인 20x NA 0.4 에어 렌즈가 장착된 광시야 형광 현미경을 사용하십시오.
3. 이미지 획득 중에 사용된 형광단에 적합한 필터를 사용하여 접시의 중앙 영역을 덮습니다. 투과광 모드에서 명시야 이미지를 촬영합니다.
   참고: 명시야 이미지는 4.6단계에서 그리드의 셀 재배치에 중요합니다.
4. 세포가 있는 접시를 4.4단계까지 4°C의 냉장고에 넣습니다.
5. 기록된 단일 이미지를 함께 타일링하여 단일 이미지에서 스캔한 영역을 재구성합니다.
6. 형광 DNA 염색의 이미지 데이터를 오픈 소스 소프트웨어 CellProfiler4.2.1²⁰을 실행하는 컴퓨터로 전송합니다.
7. 형광 이미지의 평면 보정이 필요한 경우 기록된 사진에서 사용된 현미경의 참조 이미지를 생성합니다. Illumination Correction.cpproj 파이프라인( 보충 파일 1로 포함)을 엽니다. 파이프라인이 화면에 다른 단계를 클릭할 수 있는 시퀀스로 나타나는지 확인합니다. 파이프라인의 첫 번째 단계 이미지 에 있는 지정된 필드로 이미지를 끌어다 놓습니다.
   참고: 창 하단에 있는 필터 옵션을 사용하여 나열된 파일에서 이미지가 아닌 모든 데이터를 제외해야 합니다.
8. 조명 보정 파이프라인의 마지막 단계에서 이미지 저장 을 클릭하여 참조 이미지가 저장될 위치를 정의한 다음 이미지 분석 버튼을 클릭합니다.
9. 파이프라인 CellCycleAnalysis.cpproj ( 추가 파일 2로 포함)를 엽니다. 참조 이미지(3.8단계)를 포함하여 3.3단계(예로 그림 4A 참조)에 기록된 이미지를 파이프라인의 첫 번째 단계 이미지 의 지정된 필드로 끌어다 놓습니다.
   참고: 창 하단에 있는 필터 옵션을 사용하여 나열된 파일에서 이미지가 아닌 모든 데이터를 제외해야 합니다.
10. 파이프라인의 CorrectIlluminationApply 단계에서 Select the Illumination 함수를 선택하여 드롭다운 메뉴에서 참조 이미지를 선택합니다.
11. 세포 주기 분석 파이프라인의 마지막 단계에서 3.7단계에서 참조 이미지가 저장된 위치를 정의하고 이미지 분석 버튼을 클릭하여 3.3단계에서 기록된 이미지 내에서 모든 핵의 통합 형광 강도를 대량으로 측정하기 시작합니다.
    참고: CellProfiler4.2.1은 CSV 형식의 측정된 각 핵(이미지, ObjectID, 통합 형광 강도, 이미지 좌표)의 데이터가 포함된 텍스트 파일 "CellCycleAnalysis_Nuclei.txt"를 생성합니다.
12. 파이프라인의 DisplayHistogram 요소가 활성으로 선택되어 있는지 확인합니다.
13. G₁ 및 G₂에 대한 히스토그램의 통합 형광 강도(예로 그림 4B 참조) 피크에 주목하고 주변 간격을 파이프라인의 FilteredObjects 요소에 입력합니다. 확인란을 클릭하여 파이프라인 요소를 활성화합니다.
14. 해당 DisplayDataOnImage 파이프라인 요소를 활성화하여 G₁ 또는 G₂ 단계의 셀을 강조 표시하는 이미지를 생성하고 파이프라인을 다시 실행합니다(예로 그림 4C 참조).
15. 관찰 챔버의 표시된 영역에서 생성된 이미지에서 원하는 세포 주기 단계를 나타내는 최대 5개의 세포를 선택하고 SMLM 현미경에서 세포를 재배치해 보십시오.
    참고: 게놈 크기를 알 수 없는 2개의 세포주가 여기에 사용되기 때문에, 게놈 크기는 인간 섬유아세포 세포주의 G₁ 피크를 HeLa 및 C3H10T1/2 세포의 G₁ 피크와 비교하여 결정되었다. 히스토그램 및 게놈 크기 간의 비례 관계는 보충 그림 S1에서 볼 수 있습니다.

4. SMLM-f발름

참고: 이러한 결합된 생화학 반응에서 산소의 순합은 0이지만 제한된 산소 농도는 D-글루코노-1,5-락톤의 생성을 늦출 수 있으므로 밀봉되지 않은 접시에서 반응을 수행하는 것이 좋습니다. D-글루코노-1,5-락톤의 농도가 증가하면 pH가 점차 낮아지는데, 이는 pH를 즉시 낮추면 시편의 미세 구조가 변경되기 때문에 필요합니다.

1. 포도당 900μL(1x DPBS에서 포도당 1g/mL), 포도당 산화효소 50μL(1x DPBS에서 0.5mg/mL) 및 카탈라아제 50μL(1x DPBS에서 40μg/mL).
2. 피펫을 사용하여 샘플에서 1x DPBS를 제거하고 세포가 들어 있는 접시에 이미징 완충액 1mL를 추가합니다.
3. 접시를 SMLM 지원 현미경의 스테이지에 장착합니다. 높은 NA 대물 렌즈와 높은 광학 배율을 사용하십시오.
4. 접시의 좌표계를 사용하여 선택한 핵 중 하나(3.15단계에서)를 찾아 카메라의 시야에 중앙에 배치합니다.
   참고: 효소 반응은 fBALM 방법에 대한 올바른 pH에 도달하고 적절한 깜박임을 용이하게 할 때까지 ~60-180분이 걸립니다. 온도 변화로 인해 축 방향 드리프트가 발생할 수 있으므로 샘플이 기기의 온도에 적응할 수 있는 충분한 시간을 제공하기 위해 가능한 한 빨리 관찰 접시를 장착하는 것이 좋습니다. SMLM 현미경이 있는 방의 온도가 측정 내내 안정적인지 확인하십시오.
5. 현미경의 z-드라이브로 초점을 변경하고 상한과 하한의 위치를 기록하여 핵의 높이를 결정합니다.
6. 다른 시점에서 레이저 출력을 높여 fBALM 프로세스에서 생성되는 적절한 깜박임을 확인합니다. 샘플이 적절한 확률론적 깜박임을 보여주면 초분해능 SMLM의 재구성에 필요한 이미지 시리즈 획득을 시작합니다.
   참고: fBALM에 사용되는 현미경에는 사용된 형광단을 여기시키는 데 적합하고 프레임당 충분한 광자 수를 보장할 수 있을 만큼 충분히 높은 광자 밀도를 생성할 수 있는 여기 레이저가 장착되어 있어야 합니다. 다른 모든 실험보다 먼저 파일럿 실험에서 이를 테스트합니다.
7. fBALM 프로세스의 적절한 깜박임이 보장되면 50ms의 노출 시간을 사용하여 이미지 시리즈 획득을 시작하여 ~20fps의 프레임 속도를 얻습니다.
8. 200nm 스텝 간격과 광 광학 섹션당 500프레임으로 핵(중간 섹션 주변)을 통해 z-스택을 사용합니다. 중간 섹션으로 돌아가서 50,000프레임의 이미지 시리즈를 가져와 높은 위치 파악 정밀도로 구조적 세부 사항을 잘 재구성할 수 있는 충분한 깜박임 이벤트를 수집합니다(~45분 소요).
   참고: z-스택은 전체 핵에 대한 DNA 신호의 중간 부분 비율을 결정하는 데 중요합니다. 유효 픽셀 크기가 SMLM²² 에 적합하고 카메라의 신호가 센서를 포화시키지 않는지 확인하십시오.
9. 다음 요구 사항이 충족되는지 확인합니다.
   1. 16비트 이미지의 수와 크기에 따라 이미지 스택의 파일 크기가 상당히 커질 수 있으므로 수집 컴퓨터에 충분한 디스크 공간이 있는지 확인하십시오.
   2. 수집 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터가 큰 파일 크기(>4GB)를 처리할 수 있는 중고 저장 장치의 파일 시스템을 처리할 수 있는지, 저장 장치에 이미지 데이터를 직접 기록할 때 실시간으로 파일을 쓸 수 있을 만큼 저장 장치로의 전송 속도가 충분히 높은지 확인하십시오.
   3. 이미지 획득 후 데이터를 저장할 때 컴퓨터에 충분한 RAM(예: 64GB)이 장착되어 있는지 확인하십시오.

5. SMLM 현미경의 z-보정을 위한 형광 구슬이 있는 접시 준비 및 기록

참고: 현미경의 난시 렌즈를 적절하게 축 방향으로 보정하여 광축을 따라 올바른 위치를 할당하려면 형광 100nm 비드의 z-스택을 기록하는 것을 고려해야 합니다.

1. 1x DPBS에서 비드를 1:10,000으로 희석하고 SMLM 측정에 사용된 것과 동일한 유형의 접시에 100nm 비드를 시드합니다.
   알림: #1.5 커버슬립과 같은 최고의 광학 품질 및 사양만 사용하십시오.
2. 교정 접시를 현미경에 장착합니다. 비드의 초점면을 통해 이미지 스택을 기록합니다(총 ~1.5μm, 여기에 사용된 10nm 단계)¹⁵.
3. 데이터를 데이터 분석 컴퓨터로 전송합니다.
   알림: 교정 슬라이드를 장기간 보관하거나 사용하지 마십시오.

6. SMLM 데이터 처리

참고: ImageJ²³ 플러그인 "ThunderSTORM"²⁴ 는 현지화 등록에 사용되었다(예를 들어, 이미지 스택의 깜박이는 스팟을 현지화 좌표, 프레임 번호 등을 포함하는 목록으로 변환). ImageJ 또는 Fiji²⁵ 는 모든 주요 데스크톱 운영 체제(Linux/Windows/macOS)에서 실행되며 무료로 다운로드하여 사용할 수 있습니다.

1. FijI에서 ThunderSTORM을 사용하려면 HELP | 업데이트 | 업데이트 사이트 관리, Hohlbein Lab의 확인란을 선택한 다음 피지를 다시 시작합니다. 프로그램이 충분한 메모리에 액세스할 수 있는지 확인하십시오.
   참고: 이미지 데이터는 ImageJ/Fiji에서 읽을 수 있는 파일 형식이어야 합니다. 표준 상용 시스템에서 데이터를 기록할 때 ImageJ용 Bio-Formats 플러그인(피지와 함께 자동으로 제공됨)을 사용하여 데이터를 직접 엽니다. 이 경우 MATLAB 스크립트 h52tif.m(프로토콜 시작 부분에 언급된 GitHub 페이지에 제공됨)을 사용하여 사용자 지정 설정에 의해 기록된 기록된 데이터를 hdf5 형식에서 TIFF 형식으로 변환했습니다.
   1. 사용된 시스템에서 사용 가능한 메모리 양과 기록할 프레임 수에 따라 메모리 부족을 방지하기 위해 데이터를 여러 하위 스택으로 분할합니다.
      참고: 다음에서는 결과 섹션에 표시된 데이터를 추출하는 데 사용된 설정이 사용됩니다. ThunderSTORM 설정에 대한 자세한 설명은 온라인에서 찾을 수 있는 ThunderSTORM 튜토리얼을 참조하세요.
2. 원하는 녹화 조건에 따라 ThunderSTORM 설정을 조정하여 깜박이는 신호 감지 설정을 최적화합니다. ThunderSTORM | 분석을 실행하고 카메라 설정을 선택한 다음 이미지 데이터의 올바른 픽셀 크기 , A/D 수, 사용된 카메라의 양자 효율 , 기본 수준 및 EM 게인 (이 설정의 경우 픽셀 크기: 65nm, A/D 수: 0.64, 양자 효율: 0.8)을 입력합니다.
3. 다음으로, 깜박이는 신호를 피팅하여 현지화 좌표를 결정하는 알고리즘을 선택합니다. 이미지 필터링 섹션에서 웨이블릿 필터(B-스플라인)를 B-스플라인 차수 3 및 B-스플라인 배율 2.0으로 사용합니다. 다른 설정의 경우 분자의 근사적 현지화 방법을 로컬 최대값으로, 피크 강도 임계값을 2*std(Wave.F1)로, 연결성을 8-neighborhood로 설정합니다. 분자의 하위 픽셀 국소화 섹션에서 PSF: 통합 가우시안, 피팅 반경[px]: 3, 피팅 방법: 최대 우도 및 초기 시그마[px]: 1.6을 선택합니다.
4. 플러그인을 실행하여 감지된 각 현지화 및 해당 속성에 대한 항목이 포함된 테이블을 만듭니다. 테이블을 하드 드라이브에 저장합니다.
5. 여러 이미지 스택을 분석해야 하거나 이미지 스택을 여러 스택으로 분할해야 하는 경우(예: 대규모 데이터 세트를 분석하거나 데이터 분석 컴퓨터에서 사용할 수 있는 메모리가 많지 않은 경우) 매크로를 실행하여 현지화 감지를 자동화합니다.
6. 수집 데이터를 여러 이미지 스택으로 분할해야 하는 경우 파일을 차례로 가져와 ThunderSTORM에서 현지화 테이블을 연결합니다. 가져오기 메뉴의 현재 테이블에 추가 옵션이 활성화되어 있고 테이블의 현지화를 덮어쓰지 않도록 올바른 시작 번호가 사용되었는지 확인합니다.
7. 전체 현지화 테이블이 생성되면 결과 테이블의 위치에서 이미지를 재구성하여 결과를 확인합니다. ThunderSTORM 결과 창에서 시각화 버튼을 누르고 재구성된 이미지(예: 현지화의 히스토그램)가 나타날 때까지 기다립니다.
8. 재구성된 사진에 측면 드리프트 및 기타 이미징 아티팩트와 같은 문제가 있는지 확인합니다. 데이터 스택의 합계된 하위 섹션(여기에 사용됨)의 상호 상관 관계를 결정하거나 샘플에서 기준 마커를 사용하여 드리프트 하위 메뉴에서 드리프트를 측정하고 수정합니다. >> 메뉴를 누른 후 5개의 빈 과 배율 (이 프로토콜에서는 6.5 )을 입력합니다. x-드리프트와 y-드리프트를 보여주는 창이 나타날 때까지 기다립니다.
   참고: 기록 후 첫 번째 이미지는 여전히 강한 배경 형광으로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다(형광단을 어두운 상태로 가져오는 동안). 따라서 분석에서 처음 수백 개의 이미지를 제외해야 할 수 있습니다(예: ThunderSTORM 기본 창의 필터 필드에 "프레임 >500" 입력).
9. 여러 연속 프레임에서 볼 수 있는 신호를 과도하게 계산하지 않으려면 평균 위치 파악 정밀도(여기서는 20nm ), 1개의 어두운 프레임 및 0개의 최대 프레임 (분자의 최대 온 시간에 대한 제한 없음)을 고려하는 반경을 사용하여 위치 파악 데이터에 병합을 적용합니다.
10. 얇은 광 광학 초박형 단면만 분석해야 하는 경우 데이터 세트에서 초점면 위와 아래의 모든 국소화를 제외합니다. 먼저 결과 테이블이 포함된 창에서 히스토그램 플롯 을 눌러 가장 많은 현지화가 포함된 z의 점을 찾은 다음 필터링 명령을 사용하여 이 점 위와 아래 50nm 의 현지화를 버립니다.
    z > "히스토그램 피크" - 50 & z < "히스토그램 피크" + 50
11. 기록된 섹션에서 DNA의 비율을 결정하기 위해 4.7.1단계에서 기록된 이미지 스택의 각 평면(두께 200nm, 각 측면에 100nm)의 국소화를 결정합니다. 플러그인 | 썬더스톰 | 가져오기/내보내기 | 결과를 가져오고 기록된 각 슬라이스를 200nm로 필터링합니다. 이를 위해 필터 필드에 입력한 후 적용을 클릭합니다.
    z > -100 &; z < 100
12. 시각화를 클릭하고 히스토그램 옵션을 선택하여 각 슬라이스의 이미지를 생성합니다. 결과 이미지를 TIFF 형식의 폴더에 저장합니다. 열려 있는 모든 이미지를 닫습니다. 모든 이미지 평면에 대해 이 작업을 반복합니다.
13. 모든 슬라이스를 열고 Image | 스택 | 이미지를 쌓을 수 있습니다. 이미지 | 스택 | Z-Project를 클릭하고 합계 옵션을 선택합니다. ImageJ에서 ROI 관리자를 엽니다(분석 | 도구 | ROI-관리자); 그런 다음 ImageJ 기본 창의 ImageJ 도구 모음에서 다각형 선택 도구를 선택하고 핵의 윤곽을 그립니다. ROI-Manager에서 추가를 클릭합니다.
    1. 분석 | 측정값을 설정하고 통합 밀도를 선택합니다. 분석 | 측정. ThunderSTORM에서 위에서 설명한 대로 중심 평면의 결과 테이블을 열고 필터 필드에서 다음 명령을 사용하여 두께 100nm로 필터링합니다.
       z > -50 &; z < 50
14. 위에서 설명한 대로 필터링된 현지화의 히스토그램을 생성하고, ROI 관리자에서 정의된 ROI를 선택하여 활성화하고, 분석 | 측정.
15. 측정된 통합 밀도(절대 DNA 밀도를 계산하기 위해 단계 8.2에 필요한 변환 계수)를 나누어 총 국소화 수에 대한 100nm 두께의 중간 섹션의 국소화 비율을 결정합니다.
    참고: DNA 함량은 국소화 횟수에 비례합니다. 따라서 이미지화된 초고해상도 이미지(중간 섹션)에서 DNA의 비율을 추정하려면 전체 핵의 부피에 걸친 총 국소화 수를 결정하고 관심 섹션의 총 국소화 수를 결정하는 것으로 충분합니다. 이는 현지화의 2D 히스토그램을 생성하여 수행할 수 있습니다.

7. SMLM 현미경의 Z 교정

1. 피지의 섹션 5에 기록된 이미지 스택을 엽니다.
2. ThunderSTORM 플러그인 메뉴에서 3D 보정 하위 메뉴 | 원통형 렌즈 보정.
3. 보정 데이터를 기록하는 데 사용되는 스텝 크기 (10nm)를 입력하고 보정에 사용할 이미지 스택의 영역 을 정의합니다.
4. 캘리브레이션 파일을 저장할 위치를 지정합니다.
5. 분자의 하위 픽셀 국소화 패널에서 PSF: 타원 가우시안(3D 난시)을 선택하고 섹션 5에서 만든 캘리브레이션 파일의 파일 경로를 조정하여 분석 실행 대화 상자 창의 캘리브레이션 데이터를 사용합니다.

8. 보로노이 테셀레이션

참고: 현지화 테이블이 생성되고 손질되면 이미지 분석의 마지막 단계인 Voronoi 테셀레이션으로 진행합니다. 이 단계에서는 MATLAB 2021을 사용합니다. MATLAB 스크립트는 "Localization Analyzer for Nanoscale Distributions"(LAND) 소프트웨어 패키지의 일부이며 재료 표의 링크에서 다운로드할 수 있습니다. 데이터 기록 및 현지화 테이블 생성과 유사하게 메모리와 처리 능력을 잘 갖춘 시스템을 사용하는 것이 중요합니다. 이 출판물의 이미지를 생성하는 데 사용된 시스템에는 128GB RAM과 9코어 Intel i9 CPU가 장착되어 있습니다.

1. 현지화 테이블을 MATLAB 행렬로 변환하고 ".mat" 형식으로 저장하는 MATLAB 스크립트 "TS2Orte.m"을 실행하여 ThunderSTORM 현지화 테이블을 .csv 형식에서 Orte 형식으로 변환합니다.
2. 데이터가 올바른 형식이 되면 Voronoi 테셀레이션 및 DNA 밀도 계산을 위한 준비를 시작합니다. 핵의 염기쌍 수를 부피에 대한 이미지화된 섹션의 상대적 국소화 수로 나누어 변환 계수를 계산합니다(6.15단계 참조). LAND-Voronoi 폴더로 이동하여 /coreAlgorithm 하위 폴더에서 voronoiCluster.m 파일을 열고 13행의 절대 밀도 계산에 대한 변환 계수를 조정합니다.
   참고: G₁ HeLa 핵의 예는 그림 5를 참조하십시오. 265의 변환 계수가 측정되었습니다.
3. 분석 "VonoRoi.m"을 시작하는 스크립트를 편집합니다. Orte 현지화 데이터의 파일 경로와 결과 파일의 출력 폴더를 조정합니다. 좌표 리스트에서 테셀레이션을 수행해야 하는 영역을 정의하는 좌표를 지정합니다. Voronoi 테셀레이션은 계산하는 데 시간이 오래 걸릴 수 있으므로(사용된 머신의 사양에 따라 다름) 동일한 입력 데이터 세트 내에서 계산할 여러 영역을 정의합니다.
4. 스크립트를 실행한 후 면적 분포의 히스토그램을 보여주는 그래프가 포함된 다른 파일과 출력 폴더에서 계산된 모든 단일 Voronoi 세포의 밀도가 포함된 "densities.mat" 파일과 함께 절대 DNA 밀도를 보여주는 이미지를 찾습니다.

Results

그림 5에 표시된 HeLa 핵은 섹션 3의 CellProfiler4.2.1에 의해 생성된 표에서 G₁ 상의 핵을 나타내는 그림 5에 표시된 히스토그램의 첫 번째 피크에 가까운 통합 형광 강도를 갖도록 선택되었습니다. 작은 크기와 뚜렷한 내부 구조를 감안할 때 유사분열 후 염색질을 탈응축하는 과정에 있는 초기 G₁ 핵일 가능성이 높습니다. G₁에 있다는 것은 계산을 위해 3N(~9 × 10⁹ bp)의 DNA 함량을 가정할 수 있음을 의미합니다(보충 그림 S1 참조). 50,000개의 프레임으로 구성된 fBALM 측정은 100nm 두께의 광학 중간 부분 내에서 2.68 ×^{10 6}개의 국소화가 감지되었습니다(

Discussion

이 기사에서는 SMLM을 사용하여 포유류 세포 핵의 절대 DNA 밀도를 측정하는 방법을 간략하게 설명합니다. 또한 배양 세포의 세포 주기 단계를 결정하는 방법과 이 정보를 사용하여 경광학 초박형에 존재하는 DNA의 양을 추정하는 방법을 시연했습니다. 또한 fBALM SMLM 현미경을 위한 부착 세포의 준비와 세포 핵에서 게놈 DNA의 초분해능 현미경 이미지를 생성하기 위해 SMLM 데이터를 처리하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 마지막으로, 프로토콜은 SMLM 데이터의 Voronoi 테셀레이션이 세포 핵 내의 절대 DNA 밀도를 계산하기 위해 이미지화된 광-광학 섹션의 DNA 추정치와 결합될 수 있는 방법을 보여줍니다.

국소화 현미경은 최근 핵 구조에 대한 연구를 위한 강력한 도구로 인기를 얻고 있으며 최근 흥미로운 질문, 즉 게놈의 접근성 및 클러스터 경향에 대한 코히신 및 BRD2의 영향

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<강>세포 배양
µ-디쉬 35mm, 하이 그리드-500 유리 바닥	이비디	81168
C3H 10T1/2	IMB (니어스 연구실)
DMEM	서모피셔	12320032
dPBS	서모피셔	14190144
FBS	라이프 테크놀로지	16000-044
헬러	현미경 코어 시설(IMB)
HFB	IMB (쿠벤 연구소)
L-글루타민	시그마-올드리치	G7513
HFB에 대한 비필수 아미노산과 비타민
피루브산나트륨	S8636
<강>샘플 준비
카탈라제	머 크	2593710
포도당	서모피셔	241922500
포도당 산화효소	머 크	49180
파라포름알데히드	시그마-올드리치	158127
RNase 칵테일	서모피셔	AM2286
시톡스 오렌지	서모피셔	S11368
테트라스펙 형광 미세구 샘플러 키트	서모피셔	T7284
트리톤 X-100	서모피셔	327372500
Software
바이오포맷	OpenMicroscopy.org		오픈 소스 소프트웨어 https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/
셀프로파일러 v4.2.1	CellProfiler.org		오픈 소스 소프트웨어 https://cellprofiler.org
피지	nih.gov		오픈 소스 소프트웨어 https://imagej.net/software/fiji/?Downloads
땅	nih.gov		오픈 소스 소프트웨어 https://github.com/Jan-NM/LAND
매트랩 2021	수학 저작		상업용 소프트웨어 - "이미지 처리 도구 상자"가 필요하다
R 4권.. 0.3	r-project.org		오픈 소스 소프트웨어 https://www.r-project.org
썬더스톰 v1.3			오픈 소스 소프트웨어 https://zitmen.github.io/thunderstorm/
<스트롱>현미경:
AF 7000	라이카
라이카 GSD	라이카
SMLM 현미경	크레머 연구소		Dr. S-Y가 맞춤 제작했습니다. 첸