방법 논문

대두 공생 결절에서 폴리솜 정제

DOI:

10.3791/64269

⸱

2022년 7월 1일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratorio de Bioquímica, Departamento de Biología Vegetal, Facultad de Agronomía, Universidad de la República, 2Departamento de Genómica, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, 3Department of Biology, University of Virginia, 4Departamento de Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias, Universidad de la República

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 온전한 대두 결절로부터 진핵 폴리솜 정제를 위한 방법을 기술한다. 시퀀싱 후, 유전자 발현 분석을 위한 표준 파이프라인을 사용하여 전사체 및 트랜스라톰 수준에서 차등적으로 발현된 유전자를 식별할 수 있습니다.

초록

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이 프로토콜의 목적은 대두의 진핵생물 번역(Glycine max) 공생 결절을 연구하기 위한 전략을 제공하는 것입니다. 이 논문은 RNA 시퀀싱을 사용하여 분석할 식물 유래 폴리리보솜 및 관련 mRNA를 분리하는 데 최적화된 방법을 설명합니다. 첫째, 세포질 용해물은 전체 냉동 대두 결절로부터 폴리솜 및 RNA 보존 조건에서 균질화를 통해 얻어진다. 그런 다음 저속 원심분리에 의해 용해물을 제거하고 상청액의 15%를 총 RNA(TOTAL) 분리에 사용합니다. 나머지 투명화된 용해물은 2층 슈크로스 쿠션(12% 및 33.5%)을 통한 초원심분리에 의해 폴리좀을 분리하는 데 사용됩니다. 폴리솜 관련 mRNA (PAR)는 재현탁 후 폴리솜 펠릿으로부터 정제된다. TOTAL과 PAR은 모두 RNA-seq에 대한 시퀀싱 라이브러리의 품질 표준을 충족하기 위해 고감도 모세관 전기영동으로 평가됩니다. 다운스트림 적용의 예로서, 시퀀싱 후, 유전자 발현 분석을 위한 표준 파이프라인을 사용하여 전사체 및 트랜스플라톰 수준에서 차등적으로 발현된 유전자를 수득할 수 있다. 요약하면,이 방법은 RNA-seq와 함께 공생 결절과 같은 복잡한 조직에서 진핵 mRNA의 번역 조절을 연구 할 수있게합니다.

서론

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콩 (Glycine max)과 같은 콩과 식물은 뿌리 줄기라고하는 특정 토양 박테리아와 공생 할 수 있습니다. 이 상호 주의적 관계는 식물 뿌리에 새로운 기관인 공생 결절의 형성을 유도합니다. 결절은 박테리아를 숙주하는 식물 기관이며 세포질이 박테로이드라는 특수한 형태의 뿌리 줄기로 식민지화 된 숙주 세포로 구성됩니다. 이 박테로이드는 대기 질소 (N 2)의 암모니아로의 환원을 촉매하며, 암모니아는 탄수화물 1,2에 대한 대가로 식물로 옮겨집니다.

이 질소 고정 공생은 가장 잘 연구 된 식물-미생물 공생 중 하나이지만, 다양한 비 생물 적 스트레스 조건을받는 식물이 공생 파트너와의 상호 작용을 조절하는 방법과 이것이 결절 대사에 미치는 영향과 같은 많은 측면이 더 잘 이해되어야합니다. 이러한 과정은 결절 번역체 (즉, 활발히 번역 된 메신저 RNA [mRNA]의 하위 집합)를 분석함으로써 더 잘 이해 될 수있다. 폴리리보솜 또는 폴리솜은 mRNA와 관련된 여러 리보솜의 복합체로, 일반적으로 번역3을 연구하는 데 사용됩니다. 폴리솜 프로파일링 방법은 폴리솜과 관련된 mRNA의 분석으로 구성되며 다양한생물학적 과정에서 발생하는 유전자 발현을 제어하는 전사 후 메커니즘을 연구하는 데 성공적으로 사용되었습니다4,5.

역사적으로 게놈 발현 분석은 주로 mRNA 풍부도 6,7,8,9를 결정하는 데 중점을 두었습니다. 그러나, 유전자 발현, 특히 번역10,11,12의 전사 후 조절의 상이한 단계로 인해 전사체와 단백질 수준 사이의 상관 관계가 부족하다. 더욱이, 전사체 수준에서의 변화와 트랜스 라톰13의 수준에서 발생하는 변화 사이에는 의존성이 관찰되지 않았다. 번역되는 mRNA 세트의 직접 분석을 통해 mRNA 수준 만 분석 할 때 얻은 것보다 세포 유전자 발현 (종말점이 단백질 풍부도)을보다 정확하고 완벽하게 측정 할 수 있습니다 14,15,16.

이 프로토콜은 식물 유래 폴리솜이 2층 자당 쿠션을 통한 차등 원심분리를 통해 온전한 대두 결절에서 정제되는 방법을 설명합니다(그림 1). 그러나 박테로이드 유래 리보솜도 결절에 존재하기 때문에 진핵 생물이 주요 분획 (90 % -95 %)을 나타내더라도 리보솜과 RNA 종의 혼합이 정제됩니다. 후속 RNA 분리, 정량화 및 품질 관리도 설명합니다(그림 1). 이 프로토콜은 RNA-seq와 함께 공생 결절과 같은 복잡한 조직에서 진핵 mRNA의 번역 조절에 대한 실험 결과를 제공해야합니다.

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그림 1: 공생 결절로부터 진핵 폴리솜 정제를 위해 제안된 방법론의 개략적인 개요. 이 계획은 (1) 식물 성장 및 (2) 결절 수확에서 (3) 세포질 추출물의 준비, (3) TOTAL 샘플 및 (4) PAR 샘플 획득, (5) RNA 추출 및 품질 관리에 이르기까지 프로토콜에서 따르는 단계에 대한 개요를 제공합니다. 약어: PEB = 폴리솜 추출 완충액; RB = 재현탁 완충액; 합계 = 총 RNA; PAR = 폴리솜 관련 mRNA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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프로토콜

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1. 식물 생장 및 뿌리 줄기 접종

  1. 필요한 결절을 생성하려면 통제 된 조건에서 성장 챔버에서 선택한 기질에 선택한 대두 종자를 뿌립니다.
    참고 :이 프로토콜에서 씨앗은 모래 : 질석 (1 : 1)의 혼합물로 채워진 0.5L 플라스틱 병에 뿌려졌습니다. 성장 챔버는 각각 28°C/20°C의 주야간 사이클 온도 및 각각 16h/8h의 명암/어둠 광주기로 설정되었습니다. 광합성 활성 방사선 강도는 620 μmol·m−2·s−1이었다.
  2. 액체 효모 추출물 만니톨 (YEM) 배지를 미리 준비하십시오 ( 재료 표 참조). 매체를 오토 클레이브하십시오.
  3. 종자 파종 당일에 100mL의 YEM이 들어있는 플라스크 1 개에 Bradyrhizobium elkanii U1302 균주를 접종합니다. 플라스크를 28°C에서 100 rpm의 오비탈 쉐이커 상에서 인큐베이션한다.
    1. 뿌리 줄기를 2 일 동안 자라게하고 묘목에 2mL의 배양 물을 접종하십시오.

2. 물 부족 처리 (선택 사항)

참고: 이 프로토콜은 콩 식물의 물 부족 처리를 간략하게 설명합니다. 이 부분은 당면한 실험 질문에 따라 완전히 변경되거나 생략 될 수 있습니다.

  1. 물 제한없이 19 일 (V2-3 발달 단계) 동안 콩 묘목을 재배하십시오. 기판을 0.5 mMKNO3로 보충된 B&D-배지17로 현장 용량으로 유지한다.
  2. 20 일째에 급수를 철회하십시오.
    참고: 여기에서 수분 함량은 성장 및 물 부족 기간 동안 중량 측정(물 중량 함량)으로 매일 측정되었습니다.
  3. 20 일부터 물 부족 기간이 끝날 때까지 제조업체의 지시에 따라 ( 재료 표 참조) 기공 측정기를 사용하여 축 방향 잎 표면에서 매일 3 회 기공 전도도를 측정하십시오.
    참고 : 물 부족 기간의 끝은 기공 전도도 값이 파종 20 일째에 얻은 값의 약 50 % 일 때 각 식물에 대해 개별적으로 결정되었습니다.

3. 결절 수확

  1. 깨끗한 용기에 액체 질소를 수집하고 15mL 튜브에 라벨을 붙입니다 (각 식물에 하나씩).
    주의 : 냉동 장갑, 안면 보호대 및 보안경을 착용하고 액체 질소를 취급하십시오.
  2. 각 플랜트를 개별적으로 검색합니다. 공중 부분을 잘라내어 폐기하십시오. 뿌리를 물로 철저히 씻어 남아있는 기질을 제거하십시오.
  3. 뿌리에서 각 결절을 분리하고 미리 냉각 된 15mL 튜브에 모으십시오. 튜브를 스냅 동결하고 -80 ° C에서 보관하십시오.

4. 세포질 추출물의 제조

참고: 이 프로토콜의 최종 목표는 고품질 총 RNA(TOTAL) 및 폴리솜 관련 RNA(PAR)를 얻는 것입니다. 따라서 RNA 분해를 방지하는 조건에서 작업하고 항상 샘플을 4 ° C로 유지하고 RNase가없는 실험실 장비 및 용액을 사용하십시오. 명시되지 않는 한, 모든 용액은 멸균 초순수로 준비됩니다.

  1. 완충 원액의 준비
    1. 표 1에 나열된 오토클레이브 가능한 스톡 용액을 준비하고 15분 동안 오토클레이브한 다음 RT에 보관합니다.
    2. 표 1에 나열된 필터 멸균 가능한 스톡 용액을 준비하고 필터 멸균 한 다음 -20 ° C에서 보관하십시오.
  2. 폴리솜 추출 완충액(PEB, 표 1 참조)을 준비하고 얼음 위에 보관합니다.
    참고: 주어진 볼륨은 6개의 샘플에 대한 것입니다.
  3. 원심분리기를 4°C로 냉각하고 2mL 미세 원심분리기 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
  4. 칭량 접시에서 손상되지 않은 결절 약 0.2g을 칭량하고 이를 사전 냉각된 2mL 튜브로 옮깁니다.
    알림: 샘플이 해동되지 않도록 이 단계를 빠르게 수행하십시오. 대안적으로, 0.2 g 대신에 0.4-0.5 mL의 추정된 결절 부피가 사용될 수 있다.
  5. 1.2mL의 PEB를 추가하고 샘플을 2분 동안 해동시킨 다음 결절이 완전히 파괴되고 균질화될 때까지 조직 분쇄기로 균질화합니다.
    알림: 해동된 결절은 미세 원심분리기 튜브의 조직 분쇄기( 재료 표 참조)로 쉽게 파손될 수 있을 만큼 충분히 부드러워지므로 반드시 연마하십시오. 얼어 붙은 결절은 갈기가 어렵습니다. 또한 샘플을 시원하게 유지하면서 적절한 균질화를 위해 튜브를 벤치탑 냉각기(0°C)에 배치하는 것이 좋습니다.
  6. 10분 동안 또는 모든 샘플이 처리될 때까지 부드럽게 교반하면서 얼음 위에서 샘플을 배양합니다.
  7. 16,000 ×g에서 4 ° C에서 15 분 동안 원 심 분리하여 파편을 펠릿합니다. 상청액을 회수하고 원심분리 단계를 반복한다.
  8. 정화된 세포질 추출물을 조심스럽게 회수하고 200μL 분취량을 깨끗한 1.5mL 미세원심분리 튜브로 옮겨 TOTAL 분리합니다(TOTAL 샘플, 섹션 7 참조).

5. 자당 쿠션의 제조

알림: 이 프로토콜은 12mL 초원심분리 튜브에 33.5겹 자당 쿠션(13.2% 및 13.2%)을 사용합니다( 재료 표 참조). 모든 용액은 멸균 초순수로 준비됩니다.

  1. 자당과 소금 원액을 준비하십시오.
    1. 2M 자당 용액 100mL를 준비합니다(68.5%, 표 1).
    2. 10x 소금 용액을 준비하십시오 (표 1).
  2. 수크로스 쿠션의 2층을 표 2에 기재된 바와 같이 준비한다. 항생제(CHX 및 CHL) 스톡 용액의 조성에 대해서는 표 1 을 참조하십시오.
    알림: 주어진 볼륨은 6개의 쿠션용입니다.
  3. 4.5mL의 33.5% 자당 층을 원심분리 튜브에 붓습니다. 그런 다음 P1000 마이크로피펫으로 12% 층 4.5mL를 조심스럽게 천천히 추가합니다. 정화 된 세포질 추출물이 첨가 될 때까지 튜브를 얼음 위에 올려 놓으십시오.

6. 폴리솜 정제

  1. 정화된 세포질 추출물 1mL(단계 4.8)를 튜브의 측벽에 조심스럽게 피펫팅하여 자당 쿠션 위에 놓습니다.
  2. 초원심분리 튜브를 4°C에서 2시간 동안 217,874×g(기준 로터에서 35,000rpm)의 예냉식 버킷과 원심분리기로 옮깁니다.
  3. 남아 있는 시토졸 추출물 및 슈크로스 쿠션을 버리고, 폴리좀 펠렛을 200 μL의 예냉된 RB( 표 1에 따라 미리 제조됨)로 재현탁시킨다.
  4. 얼음 위에서 30분 동안 배양한 다음 폴리솜 재현탁액을 1.5mL 예냉된 튜브로 옮깁니다. RNA 추출 (PAR 샘플)을 진행하십시오.

7. RNA 추출 및 품질 관리

참고 :이 단계는 TOTAL (4.8 단계) 및 PAR 샘플 (6.4 단계)에 대해 수행됩니다.

  1. 멸균 초순수로 75 % EtOH를 준비하고 -20 ° C로 냉각시킵니다. 또한 클로로포름과 이소프로판올을 -20 ° C로 냉각하십시오.
  2. 샘플을 750μL의 RNA 분리 시약으로 균질화하고 RT에서 5분 동안 배양합니다.
  3. 차가운 클로로포름 200μL를 넣고 튜브를 15초 동안 세게 흔듭니다. RT에서 10 분 동안 배양하십시오.
  4. 상 분리를 위해 4°C에서 15 분 동안 12,000×g의 원심분리. 분홍색 유기상을 방해하지 않고 상부 수성상 500μL를 깨끗한 튜브로 옮기고 375μL의 차가운 이소프로판올과 0.5μL의 RNase가 없는 글리코겐을 추가합니다( 재료 표 참조). 위아래로 피펫팅하여 철저히 혼합합니다.
    참고: 글리코겐은 알코올 침전으로부터 핵산 회수를 증가시키기 위해 공침제로 사용되는 운반체입니다.
  5. 혼합물을 4°C에서 10분 동안 배양하고 12,000× g 에서 15분 동안 원심분리합니다. 상청액을 폐기하십시오.
  6. RNA 침전물을 차가운 75 % EtOH 1mL로 세척한다. 간단한 소용돌이로 혼합하십시오.
    참고: 이 시점에서 샘플은 -20°C에서 밤새 보관할 수 있습니다.
  7. 4°C에서 5 분 동안 7,500×g으로 원심분리하고, 마이크로피펫으로 상청액을 조심스럽게 제거하고, RNA 펠릿을 자연 건조시킨다.
  8. 펠릿을 RNase가 없는 물 50μL에 녹이고 65°C에서 5분 동안 배양합니다.
  9. 고감도 모세관 전기영동18(재료 표 참조) 및/또는 2% RNase가 없는 아가로스 겔(19)에 대한 전기영동으로 RNA 농도 및 무결성을 평가합니다(재료 표 참조).
    참고: RNA 샘플을 즉시 사용하지 않거나 RNA-seq 라이브러리 준비를 위해 시퀀싱 시설로 보내려는 경우 EtOH를 사용하여 침전시키는 것이 좋습니다.

8. RNA 침전

  1. 원심분리기 및 EtOH를 4°C로 냉각시킨다.
  2. 3M 아세트산 나트륨을 준비하십시오.
  3. 멸균 초순수로 70 % EtOH를 준비하고 -20 ° C로 냉각시킵니다.
  4. 샘플 부피를 추정합니다. 0.1 부피의 3M 아세트산 나트륨, 3 부피의 차가운 EtOH 및 0.5 μL의 RNase가없는 글리코겐을 추가하십시오. 철저히 섞는다.
  5. 필요할 때까지 -20 ° C에서 그대로 두십시오.
    참고: RNA 침전 샘플은 -1°C에서 최대 80년 동안 보관할 수 있습니다.

9. 유전자 발현 분석을 위한 표준 파이프라인

  1. 신뢰할 수 있는 트랜스크립톰 및 트랜스라톰 데이터 분석을 위해 판독 길이가 >100bp인 평균 40M Illumina 쌍단 판독을 수행합니다.
    참고: 표준 RNA-seq 데이터 분석에는 다음 단계 9.2-9.5가 포함됩니다.
  2. FastQC(https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) 또는 멀티샘플 MultiQC20을 사용하여 판독 품질 검사를 수행합니다.
  3. Trimmomatic 21, BBDuk (http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bb-tools/), cutadapt22, 낫23 또는 Trim Galore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/)를 사용하여 어댑터 및 저품질 시퀀스를 제거합니다.
  4. 종에 대한 참조 게놈을 사용할 수 있는 경우 참조에 대한 읽기 매핑을 수행한 다음 다른 오픈 소스 도구 외에도 Bowtie224, TopHat2 25 또는 Salmon 26 및 featureCounts27을 사용하여 풍부도 정량화를 수행합니다.
  5. edgeR28, DESeq229 또는 limma30을 사용하여 차등 발현 유전자 식별을 위한 통계 분석을 수행합니다.
    참고: 이러한 오픈 소스 소프트웨어는 명령줄을 통해 로컬로 사용할 수 있습니다. 대안적으로, 이들은 그래픽 사용자 인터페이스를 제공하는 은하계(31 ) 또는 지오익스플로러(32)와 같은 공개 서버의 웹 브라우저를 통해 작동될 수 있어서, 그것들을 사용하기 위해 커맨드 라인 지식이 필요하지 않다.

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결과

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RNA 시퀀싱과 같은 대부분의 다운스트림 응용 분야에서 고품질 샘플이 라이브러리 준비 및 시퀀싱의 기본이기 때문에 위에서 언급한 절차로 정제된 TOTAL 및 PAR 분획의 양 및 품질 평가는 성공 여부를 결정하는 데 중요합니다. 더욱이, RNA 분자의 완전성은 샘플 수집순간 (18)에서 유전자 발현 프로파일의 스냅 샷의 캡처를 허용한다. 이러한 맥락에서 RNA 무결성 번호(RIN)는 바이오분석기를 사용하여 이러한 측정을 수행할 때 얻어집니다. RIN은 10(온전)에서 1(완전 저하)18 범위의 강력하고 안정적이며 사용자 독립적인 방식으로 무결성 값을 할당하는 데 사용됩니다.

그림 2A, B 는 여러 TOTAL 및 PAR 샘플 분획에 대한 고감도 모세관 전기 영동 시스템 (Bioanalyzer)의 표준 출력을 보여...

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

번역 수준에서 유전자 발현 조절을 연구하는 것은 세포 유전자 발현의 종말점이 단백질 풍부도이기 때문에 다양한 생물학적 과정을 더 잘 이해하는 데 중요합니다13,14. 이것은 다염색체 분획을 정제해야하는 관심 조직 또는 유기체의 트랜스 라톰을 분석하고 관련 mRNA를 분석 한 3,4,34,35,36을 분석하여 평가할 수 있습니다.

자당 쿠션을 통해 대두 공생 결절 폴리솜을 정제한 다음 TOTAL 및 PAR 추출을 수행하는 방법이 여기에 제시됩니다. 두 RNA 분획을 모두 얻는 것은 RNA-...

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공개 사항

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저자는 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 CSIC I+D 2020 보조금 번호 282, FVF 2017 보조금 번호 210 및 PEDECIBA(마리아 마사 사인즈)의 자금 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
식물 생장 및 rhizobia 접종
Orbital shakerDaihan ScientificModel SHO-1D
YEM-mediumAmrescoJ850 (효모 추출물) 0122 (만니톨)
수분 결핍 치료< / strong>
KNO3Merck
포로미터십각형 장치모델 SC-1
메스
<강>세포질 추출물 준비
Brij L23시그마-알드리치P1254
원심분리기시그마모델 2K15
클로란페니콜시그마-알드리치C0378
시클로헥시미드시그마-알드리치C7698
DOC시그마-알드리치30970
DTT시그마-알드리치D9779
EGTA시그마-알드리치E3889
이그팔 CA 360시그마-알드리치I8896
KCl머크1.04936
MgCl2Sigma-AldrichM8266
플라스틱 티슈 그라인더Fisher Scientific12649595
PMSFSigma-AldrichP7626
PTESigma-AldrichP2393
TrisInvitrogen15504-020
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP1379
계량 접시 Deltalab1911103
Preparation of sucrose cushions
SucroseInvitrogen15503022
SW 40 Ti rotorBeckman-Coulter
UltracentrifugeBeckman-CoulterOptima L-100K
Ultracentrifuge tubesBeckman-Coulter34405913.2 mL 튜브
RNA 추출 및 품질 관리
AgaroseThermo scientificR0492
바이오분석기애질런트모델 2100. 진핵생물 총 RNA 나노 분석
클로로포DI41191
에탄올DorwilUN1170
이소프로판올Mallinckrodt3032-06
글리코겐시그마10814-010
TRIzol LSAmbion102960028
Miscellaneous
Falcon 튜브 15 mLBiologix10-0152
필터 팁 10 &마이크로; LBioPointe Scientific321-4050
필터 팁 1000 &마이크로; LBioPointe Scientific361-1050
필터 팁 20 &마이크로; LBioPointe Scientific341-4050
필터 팁 200 &마이크로; LTarsons528104
마이크로 원심분리기 튜브 1.5 mLTarsons500010-N
마이크로 원심분리기 튜브 2.0 mLTarsons500020-N
염기서열분석 회사Macrogen
Sterile 250 mL 플라스크Marienfeld4110207
221295름

참고문헌

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