상향 조절된 많은 유전자는 종양 세포의 이동과 침입을 자극하여 예후를 악화시킵니다. 어떤 유전자가 종양 세포의 이동과 침입을 조절하는지 알아내는 것은 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 종양 세포의 이동 및 침입에 대한 유전자 발현 증가의 효과를 실시간으로 조사하는 방법을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
종양 세포는 운동성이 높고 침습적이며 변형된 유전자 발현 패턴을 나타냅니다. 유전자 발현의 변화가 종양 세포의 이동과 침입을 어떻게 조절하는지에 대한 지식은 종양 세포가 인접한 건강한 조직으로 침투하여 전이되는 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다. 이전에는 유전자 녹다운(knockdown)에 이은 임피던스 기반 종양 세포 이동 및 침습 실시간 측정을 통해 종양 세포 이동 및 침습에 필요한 유전자를 식별할 수 있음을 입증했습니다. 최근 SARS-CoV-2에 대한 mRNA 백신은 치료 목적으로 합성 mRNA를 사용하는 것에 대한 관심이 높아졌습니다. 여기서는 유전자 과발현이 종양 세포 이동 및 침습에 미치는 영향을 연구하기 위해 합성 mRNA를 이용한 방법을 수정하였다. 이 연구는 합성 mRNA transfection을 통한 유전자 발현 증가 후 임피던스 기반 실시간 측정이 종양 세포 이동 및 침입을 자극하는 유전자를 식별하는 데 도움이 될 수 있음을 보여줍니다. 이 방법 논문은 종양 세포 이동 및 침습에 대한 변경된 유전자 발현의 영향을 조사하는 절차에 대한 중요한 세부 정보를 제공합니다.
서론
종양 세포 운동성은 전이 1,2에 중요한 역할을 합니다. 종양 세포가 인접 및 원격 건강 조직으로 퍼지면 암 치료가 어려워지고 재발에 기여합니다 3,4. 따라서 종양 세포 운동성의 메커니즘을 이해하고 관련 치료 전략을 개발하는 것이 필수적입니다. 많은 종양 세포가 유전자 발현 프로파일을 변경했기 때문에 유전자 발현 프로파일의 어떤 변화가 종양 세포 운동성의 변화로 이어지는지 이해하는 것이 중요합니다 5,6.
in vitro에서 세포 이동을 측정하기 위해 여러 분석법이 개발되었습니다. 일부 분석법은 특정 시점에서만 측정이 가능하기 때문에 제한된 정보만 제공하는 반면, 다른 분석법은 종양 세포 운동성에 대한 포괄적인 정보를 실시간으로 제공한다7. 이러한 세포 운동성 분석의 대부분은 주어진 시간 또는 종말점에서 정량적 결과를 제공할 수 있지만 실험 기간 동안 세포 이동 속도의 동....
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프로토콜
1. mRNA의 합성
참고: mRNA 합성을 위해 모든 시약과 장비는 사용하기 전에 RNase를 비활성화하도록 특수 처리해야 합니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 기기 및 시약에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
- DNA의 선형화
참고: CrkI 및 CrkL의 마우스 cDNA를 pFLAG-CMV-5a 발현 벡터로 클로닝하여 C-말단에 FLAG 에피토프 태그를 추가하고, 이전에 기술된 바와 같이, T7 프로모터를 통합하기 위해 pcDNA3.1/myc-His 벡터로 서브클로닝하였다(18,19).- 10 μL의 10x 반응 완충액, 1.5 μL의 PmeI(10,000 units/mL) 및 10 μg의 플라스미드 DNA를 마이크로 원심분리 튜브에 추가하여 플라스미드 DNA를 제한 효소로 선형화합니다. 뉴클레아제가 없는 물을 첨가하여 반응 부피를 100μL로 만듭니다.
- 두드려서 혼합하고, 스핀 다운하고, 반응 혼합물을 37°C에서 밤새 배양합니다.
- 스핀 ....
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결과
Crk 및 CrkL 단백질은 뉴런22, T 세포23, 섬유아세포 18,19 및 다양한 종양 세포13를 포함한 많은 세포 유형의 운동성에 중요한 역할을 한다. Crk 및 CrkL 단백질이 교모세포종24,25,26에서 상승하는 것으로 보고되었기 때문에 Crk의 접합 변이체인 CrkI의 과발현이 교모세포종 세포 이동에 미치는 영향을 이 연구에서 연구했습니다. U-118MG 세포를 다양한 농도의 합성 CrkI mRNA로 전기천공하고 단백질 수준 및 세포 이동을 분석했습니다. 다양한 농도의 합성 CrkI mRNA를 사용한 U-.......
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토론
이동과 침입은 종양 세포의 중요한 특징입니다. 종양 세포의 운동성을 측정하고 종양 세포 운동성을 조절하는 근본적인 메커니즘을 이해하면 치료 개입에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있습니다 2,27. 세포 이동을 연구하기 위해 몇 가지 방법이 개발되었다7. 스크래치 또는 배양 삽입물을 사용하는 상처 치유 분석은 간극 봉합의 대조 이미지를 제공하는 간단하고 자주 사용되는 방법입니다. 개별 세포 추적 분석은 세포에 형광 염료를 태깅할 수 있는 타임 랩스 이미징으로 개별 세포를 모니터링해야 합니다. 상처 치유 분석과 개별 세포 추적 분석은 모두 세포의 자발적인 움직임을 측정합니다.
타임랩스 이미징 및 집중적인 요청 후 데이터 처리의 도움으로, 두 분석 모두 샘플 간의 정량적 비교를 제공할 수 있다28.......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
저자들은 이 원고를 편집해 준 Children's Mercy Kansas City의 Medical Writing Center에 감사를 표합니다. 이 작업은 Natalie's A.R.T. Foundation(T.P.)과 Children's Mercy Hospital(CMH) 및 University of Kansas Cancer Center(KUCC)의 MCA Partners Advisory Board 보조금(T.P.)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| AlphaImager HP | ProteinSimple | 92-13823-00 | Agarose gel imaging system |
| α-Tubulin 항체 | Sigma | T9026 | α-tubulin protein (dilution 1:3,000)을 검출하는 데 사용됨 |
| CIM-plate 16 | Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | 세포 침입 및 이동 플레이트 |
| Crk 항체 | BD Biosciences | 610035 | CrkI 및 CrkII 단백질 검출에 사용 (희석 1:1,500) |
| CrkL 항체 | Santa Cruz | sc-319 | CrkL 단백질 검출에 사용 (희석 1:1,500) |
| Dulbecco' 의 변형된 독수리' s 배지 (DMEM) | ATCC | 302002 | 세포 배양 배지 |
| Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) | Corning | 21-031-CV | 세포 세척에 사용되는 버퍼 |
| 소 태아 혈청(FBS) | Hyclone | SH30910.03 | 배양 배지 보충제 |
| Heracell VIOS 160i CO2 인큐베이터 | Thermo Scientific | 51030285 | CO2 인큐베이터 |
| IRDye 800CW 염소 항-마우스 IgG 2차 항체 | Li-Cor | 926-32210 | 웨스턴 블롯 분석을 위한 2차 항체 (희석 1:10,000) |
| IRDye 800CW 염소 안티-토끼 IgG 2차 항체 | Li-Cor | 926-32211 | 웨스턴 블롯 분석을 위한 2차 항체 (희석 1:10,000) |
| 염화리튬 | Invitrogen | AM9480 | RNA 침전에 사용 |
| Matrigel 매트릭스 | Corning | 354234 | 세포외 기질(ECM) 젤 |
| MEGAscript T7 전사 키트 | Invitrogen | AM1334 | RNA 합성에 사용 |
| Millennium RNA 마커 | Invitrogen | AM7150 | 포름알데히드 아가로스 젤 전기영동에 사용 |
| 미니 원심분리기 | ISC BioExpress | C1301P-ISC | 세포를 스핀다운하는 데 사용됩니다 |
| 마우스 뇌 QUICK-Clone cDNA | TaKaRa | 637301 | 닝을 위한 유전자(삽입물)의 출처 |
| nbsp; | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system1 |
| Neon transfection system 10 µ L kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Neon transfection system 100 µ L kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | Electroporation kit |
| NorthernMax 변성 겔 버퍼 | Invitrogen | AM8676 | 포름알데히드 아가로스 젤 전기영동에 사용 |
| NorthernMax 포름알데히드 로드 염료 | Invitrogen | AM8552 | 포름알데히드 아가로스 젤 전기영동에 사용 |
| NorthernMax 러닝 버퍼 | Invitrogen | AM8671 | 포름알데히드 아가로스 겔 전기영동에 사용 |
| 뉴클레아제가 없는 물 | Teknova | W3331 | mRNA 합성 중 다양한 반응에 사용 |
| Odyssey CLx Imager | Li-Cor | Imager 웨스턴 블롯 분석용 | |
| pcDNA3.1/myc-His | Invitrogen | V80020 | 삽입물(마우스 CrkI 및 CrkL cDNA)이 복제된 벡터 |
| pFLAG-CMV-5a | Millipore Sigma | E7523 | FLAG 에피토프 태그의 출처 |
| 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 | Sigma | P2069 | DNA 추출에 사용됨 |
| PmeI | New England BioLabs | R0560L | mRNA 합성을 위한 플라스미드를 선형화하는 데 사용됨 |
| Poly(A) tailing kit | Invitrogen | AM1350 | poly(A) tail reaction에 사용됨 |
| 폴리스티렌 조직 배양 접시(100 x 20mm 스타일) | Corning | 353003 | transfection |
| 전 세포 배양에 사용됨폴리스티렌 조직 배양 접시 (35 x 10 mm 스타일) | Corning | 353001 | 형질주입된 세포를 배양하는 데 사용됨 |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | 반응 혼합물에서 단백질을 제거하는 데 사용됨 |
| Purifier Axiom Class II, Type C1 | Labconco Corporation | 304410001 | 세포의 멸균 처리를 위한 Biosafety cabinet |
| Resuspension Buffer R | ThermoFisher Scientific | electroporation 키트, MPK1025 및 MPK10096에 포함된 버퍼. 완충액은 electroporation 전에 세포를 재생하는 데 사용되며 그 구성은 독점 정보입니다. | |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | RNA 오염 제거 솔루션 |
| Scepter | Millipore | C85360 | 휴대용 자동 세포 카운터 |
| ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit | Cellscript | C-SCMT0625 | 캡핑 반응에 사용 |
| ScriptCap m7G 캡핑 시스템 | Cellscript | C-SCCE0625 | 캡핑 반응에 사용 |
| Sodium dodecyl sulfate 용액 | Invitrogen | 15553-035 | proteinase K 반응에 사용되는 |
| 세제 Sorvall Legend XT 원심분리기 | Thermo Scientific | 75004532 | 세포를 스핀다운시키기 위한 벤치탑 원심분리기 |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 세포 U-118MG의 해리에 사용됩니다 | ATCC | HTB15 | 인간 교모세포종 환자에서 유래한 부착 세포주 |
| Vinculin 항체 | Sigma | V9131 | 빈쿨린 단백질(희석 1:100,000) 검출에 사용 |
| xCELLigence RTCA DP | Agilent Technologies, Inc | 380601050 | 실시간 세포 분석 |
| 에 사용되는 기기다양한 세포주에 대한 1Electroporation 파라미터 및 기타 관련 정보는 제조업체의 홈페이지에서 확인할 수 있습니다(https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?). |
참고문헌
- Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. Targeting tumor cell motility to prevent metastasis. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).
- Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in....
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재인쇄 및 허가
