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방법 논문

자궁내막 탈락 연구를 위한 난소 절제술을 이용한 마우스 인공 탈락 모델의 생성

6.7K 조회수

DOI:

10.3791/64278

2022년 7월 27일

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기서는 자궁내막 탈락 연구 분야의 대표적인 자궁내막 탈락 실험인 난소 절제된 마우스를 이용하여 인공 탈락 모델을 생성하는 방법을 설명합니다.

초록

자궁 내막 탈락은 월경 및 임신과 밀접한 관련이있는 자궁 내막의 독특한 분화 과정입니다. 탈락 장애는 불임, 재발성 유산 및 조산과 같은 다양한 자궁내막 장애를 유발합니다. 생식 연구에서 자궁내막 탈락 모델의 개발 및 사용은 오랫동안 생식 연구자들에게 하이라이트였습니다. 마우스는 번식 및 탈락을 연구하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 탈락화와 관련하여 잘 정립된 세 가지 마우스 모델, 즉 자연 임신 탈락(NPD), 인공 탈락화(AD) 및 시험관 내 탈락화(IVD)가 있습니다. 그 중 AD는 구현하기 쉽고 NPD에 가까운 마우스 탈락화에 대한 신뢰할 수 있는 모델로 간주됩니다. 이 논문은 난소 효과를 피하기 위해 난소 절제술을 통한 마우스 인공 탈락 모델의 생성 및 적용 과정의 수정된 방법에 초점을 맞추고 있으며, 이는 그룹 내 작은 분산으로 재현성이 높은 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 자궁내막 탈락 연구를 위한 훌륭하고 신뢰할 수 있는 동물 모델을 제공합니다.

서론

인간 보조 생식 기술의 발달로 현재 체외 수정-배아 이식(IVF-ET)의 임상 임신율은 자연 임신에 도달하거나 심지어 초과했습니다. 그럼에도 불구하고 보조 생식 임상 실습에 있는 많은 환자들은 여전히 여러 번의 배아 이식을 받지만 원하는 대로 임신을 달성하지 못합니다. 그러나 그 구체적인 분자 메커니즘은 여전히 불분명하므로 임상 개입은 효과가 없으며 이는 생식 의학이 직면한 중요한 과제 중 하나입니다 1,2.

자궁내막 인자는 IVF 실패 원인의 약 2/3를 차지한다3. 인간 배아 착상은 위치 지정, 접착 및 침습의 세 단계로 나뉩니다 4,5,6. 산모 자궁 내막은 배아의 도착을 충족시키기 위해 일련의 변화를 겪습니다. 착상 "창 기간"을 형성하는 것은 배아 이식에 유리한 조건을 제공한다 7,8.

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프로토콜

설명된 모든 동물 실험은 난징 대학 의과대학 부속 드럼 타워 병원 동물 사용 및 관리 위원회(제20171202호)의 승인을 받았습니다. 모든 작업은 적절한 동물 관리 및 사용 기관 및 국가 지침을 따릅니다.

참고: 마우스는 온도 22°C ± 1°C, 상대 습도 50% ± 1%, 명암 주기 12시간/12시간, 음식과 물에 대한 자유로운 접근이 가능한 특정 병원체가 없는(SPF) 환경에서 자랐습니다.

1. 마우스 난소 절제술

  1. 수술 1일 전에 고온 고압 살균기로 수술 기구를 소독하십시오.
  2. 8주령 C57BL/6 마우스의 체중을 측정하고 그에 따라 1% 펜토바르비탈 나트륨을 복강내(i.p) 주사하여 마우스를 마취합니다. 사용된 용량은 40mg/kg이다17. 이 용량은 난소 절제술의 요구 사항을 충족하는 40-60 분의 진정 작용을 제공합니다. 수술 전 진통의 경우 마우스에 5mg/kg 멜록시캄(s.c)을 주사합니다.
    참고 : 생쥐의 성공적인 마취는 심부 근육 반사의 소실과 꾸준한 호흡으로 나타낼 수 있습니다. 성공적인 마취의 징후로는 안안을 만질 때 눈을 깜빡이지 않고, 혀를 당길 때 삼키....

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결과

마우스 탈락 모델 지수에는 자궁의 일반적인 형태, 탈락 및 비탈락 자궁의 질량 비율, 자궁내막의 조직학적 형태 및 탈락 마커 분자의 발현 수준이 포함됩니다. 기름에 의해 유도 된 생쥐의 인공 탈락 자궁의 일반적인 형태는 임신 중 자궁의 형태에 더 가깝습니다. 자궁체가 두꺼워지고 자궁강이 비 유도 측보다 작아집니다. 유도된 자궁 뿔의 부피와 무게는 유도되지 않은 쪽의 부피와 무게보다 훨씬 높습니다(그림 3A, B). 자궁 조직의 HE 염색은 땀샘이 사라지고 유도된 뿔의 자궁내막 기질 세포가 세포 경계가 불분명한 크고 둥근 세포질 및 다핵 탈락 세포로 분화되었음을 보여주었습니다. 유도되지 않은 측면 절편은 정상적인 생리학적 상태 하에서 자궁내막 조직 형태를 보여줍니다(그림 4A). 아조 커플링법의 결과는 오일 유도 측의 알칼리성 포스파타제 함량이 비유도 측보다 현저히 높은 것으로 나타났다(

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토론

생쥐의 탈락은 배아의 존재에 따라 자발적인 과정이며, 이는 인간과 다릅니다. 그러나 유리 구슬의 자궁 주입 및 자궁 열상과 같은 인공 자극은 배아 대신 자궁 내막의 탈락을 유도 할 수 있음이 밝혀졌습니다. 또한 연구자들은 스테로이드 호르몬, 프로스타글란딘 및 성장 억제 인자를 자궁강에 주입하는 것과 같은 많은 요인이 탈락을 유도하거나 탈락에 참여할 수 있음을 발견했습니다21. 위의 모델링 방법과 비교할 때, 참기름을 각성제로 사용하여 난소 절제술로 여기에 자세히 설명 된 마우스 모델은 내인성으로 생성 된 에스트로겐과 프로게스테론의 영향을 배제 할 수 있습니다. 따라서 경제적이고 조작이 간편합니다.

난소는 잔류 난소 조직을 방지하기 위해 깨끗하게 제거되어야하며, 이는 이후의 탈락 유도에 영향을 미칩니다. 이 단계는 난소에서 생성되는 내인성 에스트로겐과 프로게스테론의 영향을 줄이는 것을 목표로 합니다. 나팔관의 손상은 참기름을 자궁강에 주사.......

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

저자는 중국 국립 자연 과학 재단(82001629, XQS), 장쑤성 자연 과학 재단 청소년 프로그램(BK20200116, XQS) 및 장쑤성 박사후 연구 기금(2021K277B, XQS)의 지원에 감사드립니다.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
에스트로겐시그마E2758호르몬 보충제
프로게스테론시그마P0130호르몬 보충제
참기름 시그마S3547호르몬 보충제
소듐 펜토바르비탈 Dainippon Sumitomo 제약 Co., 주식 회사.마취
Meloxicam 주사Qilu Animal Health Products Co., Ltd진통제
알칼리 인산 타제 염색 키트 (카플로 / 아조 커플 링 방법)SolarbioG1480알칼리 인산 분해 효소 염색
EosinServicebioG1005-2HE 염색
HematoxylinServicebioG1005-1HE 염색
ChamQ 범용 SYBR qPCR 마스터 믹스VazymeQ711-02qPCR
70% 에탄올리콘ZH1120090소독
요오드포RunzekangRZK-DF
소독 에리스로마이신 눈 연고광저우 Baiyunshan마우스 안구 보호
4-0 봉합EthiconW329절개 봉합사
10% 포르말린YuluL25010118Tissue fix
최적 절단 온도 화합물Sakura4583Ssection
Trizol 시약Ambion15596018qPCR
어 사

참고문헌

  1. Carson, S. A., Kallen, A. N. Diagnosis and management of infertility: A review. JAMA. 326 (1), 65-76 (2021).
  2. Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. Genetics of human female infertility dagger. Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).
  3. Sang, Y., Li, Y., Xu, L., Li, D., Du, M.

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재인쇄 및 허가

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