자궁내막 탈락 연구를 위한 난소 절제술을 이용한 마우스 인공 탈락 모델의 생성

요약

여기서는 자궁내막 탈락 연구 분야의 대표적인 자궁내막 탈락 실험인 난소 절제된 마우스를 이용하여 인공 탈락 모델을 생성하는 방법을 설명합니다.

초록

자궁 내막 탈락은 월경 및 임신과 밀접한 관련이있는 자궁 내막의 독특한 분화 과정입니다. 탈락 장애는 불임, 재발성 유산 및 조산과 같은 다양한 자궁내막 장애를 유발합니다. 생식 연구에서 자궁내막 탈락 모델의 개발 및 사용은 오랫동안 생식 연구자들에게 하이라이트였습니다. 마우스는 번식 및 탈락을 연구하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 탈락화와 관련하여 잘 정립된 세 가지 마우스 모델, 즉 자연 임신 탈락(NPD), 인공 탈락화(AD) 및 시험관 내 탈락화(IVD)가 있습니다. 그 중 AD는 구현하기 쉽고 NPD에 가까운 마우스 탈락화에 대한 신뢰할 수 있는 모델로 간주됩니다. 이 논문은 난소 효과를 피하기 위해 난소 절제술을 통한 마우스 인공 탈락 모델의 생성 및 적용 과정의 수정된 방법에 초점을 맞추고 있으며, 이는 그룹 내 작은 분산으로 재현성이 높은 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 자궁내막 탈락 연구를 위한 훌륭하고 신뢰할 수 있는 동물 모델을 제공합니다.

서론

인간 보조 생식 기술의 발달로 현재 체외 수정-배아 이식(IVF-ET)의 임상 임신율은 자연 임신에 도달하거나 심지어 초과했습니다. 그럼에도 불구하고 보조 생식 임상 실습에 있는 많은 환자들은 여전히 여러 번의 배아 이식을 받지만 원하는 대로 임신을 달성하지 못합니다. 그러나 그 구체적인 분자 메커니즘은 여전히 불분명하므로 임상 개입은 효과가 없으며 이는 생식 의학이 직면한 중요한 과제 중 하나입니다 ^1,2.

자궁내막 인자는 IVF 실패 원인의 약 2/3를 차지한다³. 인간 배아 착상은 위치 지정, 접착 및 침습의 세 단계로 나뉩니다 ^4,5,6. 산모 자궁 내막은 배아의 도착을 충족시키기 위해 일련의 변화를 겪습니다. 착상 "창 기간"을 형성하는 것은 배아 이식에 유리한 조건을 제공한다 ^7,8.

대부분의 포유류에서 배반포가 자궁의 내강 상피에 부착 된 후 배반포를 둘러싼 간질 세포가 빠르게 증식하고 분화하기 시작하고 중간엽의 빠른 리모델링으로 모양과 기능이 바뀌어 배아 이식이 이루어진다 ^5,9,10. 부위의 부피와 무게가 급격히 증가하면 배반포가 자궁 기질에 박히게 되는데, 이 과정을 탈락화(decidualization)^{라고 한다 11}. 자궁내막 기질은 임신을 준비하기 위해 분화하고 개조하는 반면, 기질 세포의 전이는 탈락 세포가 기능을 수행할 수 있는 공간과 새로운 신호 연결을 제공합니다^12,13. 기질 세포는 탈락 세포로 변형되어 프로락틴(PRL), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 1(Igfbp1) 등과 같은 많은 상징적 인자를 분비합니다. 연구에 따르면 비정상적인 탈락이 배아 이식 실패의 주요 원인 중 하나이지만 비정상적인 탈락의 원인은 여전히 불분명하며 더 많은 설명이 필요합니다 ^1,14.

마우스 인공 탈락 모델은 탈락의 기초가 되는 생리학적 과정과 분자 메커니즘을 연구하는 데 필수적입니다. 인공 탈락 (AD)은 주로 임신 또는 생리주기를 시뮬레이션하기 위해 인공적인 방법으로 확립 된 자궁 내막 탈락 과정을 말합니다. 형태학적인 측면에서, 임신 탈락과 인공 탈락 사이에는 전반적인 차이가 거의 없다^15,16. 자궁 땀샘은 탈락 형성 전에 자궁 내막에 존재하며 탈락 후 사라집니다. 유전자 발현과 관련하여 자연 임신 탈락(NPD)과 AD¹⁵ 사이에는 약간의 차이만 확인됩니다. 결과적으로, 생쥐의 인공 탈락 모델은 인간 생식 질환의 알려지지 않은 병인과 새로운 치료법을 탐구하기 위해 임신 탈락을 시뮬레이션할 수 있습니다.

NPD, AD 및 시험관 내 탈락화(IVD)는 마우스 탈락을 달성하기 위한 세 가지 방법입니다. NPD 모델은 자연 임신에 의존하며 배아의 영향을 포함하여 산모의 생리적 상태에 가장 가깝습니다. 착상 부위와 비 착상 부위의 차이점을 비교하는 것은 탈락을 연구하는 데 더 생리학적이고 편리한 접근 방식입니다. AD 모델은 배아의 영향을 피하기 위해 정관 수술을 받은 수컷과 교미한 가임신한 암컷 마우스에서 탈락을 유도하기 위해 각성제로 참기름을 자궁 내 주사하여 개발되었습니다. NPD와 AD 모델은 서로 다른 연구 목적에서 필수적인 역할을 하지만 모체 호르몬 대사의 다양한 활동으로 인한 짝짓기 실패와 그룹 내 차이를 피할 수는 없습니다. IVD는 세포 수준에서 에스트로겐과 프로게스테론을 병용하여 치료하는 방법으로보다 엄격한 실험 조건과 작동 능력이 필요합니다. 그러나, 시험관내 모델은 생리학적 조건¹⁵ 하에서 탈락 반응을 완전히 시뮬레이션할 수 없다. 따라서 우리는 탈락에 대한 내인성 호르몬의 영향을 줄이기 위해 전통적인 AD에서 변형된 간단하고 개선된 유도 방법을 제안합니다. 탈락 유도의 성공을 보장함으로써 생리적 상태에 더 가깝고 배아 인자를 배제해야 하는 실험에 더 적합합니다.

프로토콜

설명된 모든 동물 실험은 난징 대학 의과대학 부속 드럼 타워 병원 동물 사용 및 관리 위원회(제20171202호)의 승인을 받았습니다. 모든 작업은 적절한 동물 관리 및 사용 기관 및 국가 지침을 따릅니다.

참고: 마우스는 온도 22°C ± 1°C, 상대 습도 50% ± 1%, 명암 주기 12시간/12시간, 음식과 물에 대한 자유로운 접근이 가능한 특정 병원체가 없는(SPF) 환경에서 자랐습니다.

1. 마우스 난소 절제술

1. 수술 1일 전에 고온 고압 살균기로 수술 기구를 소독하십시오.
2. 8주령 C57BL/6 마우스의 체중을 측정하고 그에 따라 1% 펜토바르비탈 나트륨을 복강내(i.p) 주사하여 마우스를 마취합니다. 사용된 용량은 40mg/kg이다¹⁷. 이 용량은 난소 절제술의 요구 사항을 충족하는 40-60 분의 진정 작용을 제공합니다. 수술 전 진통의 경우 마우스에 5mg/kg 멜록시캄(s.c)을 주사합니다.
   참고 : 생쥐의 성공적인 마취는 심부 근육 반사의 소실과 꾸준한 호흡으로 나타낼 수 있습니다. 성공적인 마취의 징후로는 안안을 만질 때 눈을 깜빡이지 않고, 혀를 당길 때 삼키지 않고, 발가락 사이의 피부를 꼬집었을 때 다리를 구부리지 않고, 꼬리를 바늘로 꿰맬 때 튀지 않는 것이 있습니다.
3. 마취 중 건조를 방지하기 위해 안구에 보호용 눈 연고를 바르십시오.
4. 마우스가 완전히 마취되면 수술을 시작하십시오. 마우스를 수술면의 엎드린 자세에 놓고 고정하고 비눗물로 적신 후 뒤쪽의 머리카락을 면도하십시오. 면도 후 70 % 에탄올로 피부를 소독하십시오.
5. 척추와 평행한 양쪽 뒷다리의 허벅지 뿌리 위쪽 가장자리에서 0.5cm(또는 갈비뼈 아래 1.0cm)에서 수술 절개 부위를 찾습니다(그림 1A).
   참고: 정확한 절개 위치는 난소의 위치를 빠르게 파악하는 데 필수적입니다.
6. 절개 부위를 중심으로 iodophor 3x로 절개 부위를 소독 한 다음 절개 부위 주위에 수술 용 드레이프를 놓습니다.
7. 가위를 사용하여 약 0.5-1.0cm의 세로 절개를하십시오. 근막을 자르고 핀셋으로 근육을 수동적으로 분리하십시오.
8. 얇은 근육층을 통해 신장의 아래쪽 극에 가까운 절개 부위에서 흰색 지방 패드 조각을 찾습니다(그림 1B).
   참고: 백색 지방 패드는 난소의 위치를 나타내는 가장 확실한 지표입니다.
9. 지혈 클립으로 지방 덩어리를 고정하고 지방 패드로 감싼 난소를 절개 부위에서 빼냅니다.
10. 구부러진 핀셋으로 난소와 나팔관의 접합부를 고정하고 가위로 난소 척추를 따라 난소를 제거하십시오. 전기 응고 펜이나 알코올 램프에서 가열 된 1mL 주사기 바늘을 사용하여 출혈을 멈 춥니 다.
    참고 : 자궁 뿔에 참기름을 주입하기위한 해부학 적 랜드 마크 인 나팔관을 보존하십시오.
11. 조직 유착을 방지하기 위해 수술 절개 부위를 생리식염수로 헹구고, 4-0 봉합사를 사용하여 근육과 피부를 각각 꿰매고, 수술 절개 부위를 다시 요오드포어로 소독합니다.
12. 마우스를 케이지의 엎드린 자세에 놓고 광원과 환기 시스템이 장착 된 25 °C 인큐베이터에서 약 2 시간 동안 소생시킵니다.
13. 수술 후 생쥐에주의를 기울이고 완전히 회복 될 때까지 원래의 먹이 장소에 다시 넣고 충분한 물과 음식을주십시오.

2. 수술 후 휴식과 에스트로겐 및 프로게스테론 제제

1. 난소 절제술 후 2 주 동안 마우스를 쉬게하십시오.
2. 매우 깨끗한 캐비닛에서 에스트로겐(2ng/μL)과 프로게스테론(0.2ng/μL)을 RNA 무효소 원심분리기 튜브의 참기름에 넣습니다.
3. 원심분리기 튜브를 37°C의 자동 온도 조절 수조에 넣고 튜브를 계속 흔들어 용해를 가속화합니다.
4. 완전히 용해 된 후, 참기름 용액을 100 μL aliqouts로 나누어 편리하게 사용할 수 있습니다. 제조된 에스트로겐 및 프로게스테론 용액을 4°C의 냉장고에 보관한다.

3. 유도 인공 탈락 모델

1. 참기름 50μL에 에스트로겐 100ng을 각 마우스에 3일 동안 피하(s.c) 주사한 후 2일 동안 휴식을 취한다(¹⁵).
   알림: 에스트로겐과 프로게스테론이 공식화되어 다른 장소에 배치되었는지 확인하십시오. 프로게스테론에 의한 에스트로겐의 오염은 실패로 이어질 수 있습니다.
2. 참기름 50 μL에 프로게스테론 1 mg과 에스트로겐 10 ng을 각 마우스에 3일 동안 추가로 주입한다¹⁵.
3. 마우스를 조작하여 인공 탈락 모델을¹⁵ 6시간 후에 3차 에스트로겐-프로게스테론 복합 주사를 유도한다.
4. 나팔관 하단에 있는 자궁 뿔을 찾아 자궁 뿔과 함께 참기름 20μL를 천천히 주입하고 조직을 뒤로 밀고 절개 부위를 봉합하고 마우스가 회복되도록 합니다. 수술에 대한 접근법은 마우스 난소 절제술과 동일하다¹⁵.
   참고: 난소 절제술이 성공한 경우에만 두 번째 수술을 진행합니다(피부 절개가 잘 치유되고 난소가 완전히 절제되며 나팔관의 잔여 말단이 주변 조직에 부착되지 않음).
   참고: AD 모델을 유도하려면 참기름 20μL가 적합합니다. 20μL 이상의 참기름은 다른 면에 쉽게 침투합니다.
5. 프로게스테론 1mg과 에스트로겐 10ng(H.)이 함유된 참기름 50μL를 4일 더 주입합니다. 그림 2^15,18의 세부 사항을 참조하십시오.

4. 시료 채취

1. 생쥐(n=6)를 이산화탄소 질식으로 안락사시키고 자궁을 채취한다. 양측 자궁의 모양을 관찰하고, 사진을 찍고, 자궁 뿔의 무게를 잰다(그림 3A, B).
2. 자궁 조직의 3-5mm를 10 % 포르말린으로 고정하고 파라핀에 넣고 절개하십시오. 헤마톡실린과 에오신으로 절편을 염색하여 형태학적 변화를 관찰한다¹⁹ (도 4A).
3. 자궁 조직의 또 다른 3-5mm를 최적 절단 온도 화합물(OCT)에 넣고 액체 질소에서 동결한 다음 -80°C 냉장고에 보관합니다. 조직을 10 μm로 절편하고, 아조 커플링법²⁰ 에 의해 자궁 조직에서 알칼리성 포스파타제 활성을 검출하였다(도 4B).
   참고: 파라핀 절편이 아닌 ALP 함량을 검출하기 위해 냉동 절편을 사용하여 만족스러운 결과를 얻을 수 있습니다.
4. Trizol 시약으로 자궁의 총 RNA를 추출하고 qPCR 마스터 믹스(Table of Materials)를 사용하여 Real-Time PCR 시스템(Table of Materials)에서 정량적 실시간 PCR(qPCR)을 수행하여 prolactin family 8 subfamily member 2(Prl8a2), 알칼리성 포스파타제 간/뼈/신장(Alpl) 및 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 1(Igfbp1)¹⁵의 상대적 mRNA 발현을 18S mRNA 수준으로 정규화하여 검출합니다(그림 4C-E ). PCR 조건을 따른다: 단계 1, 30초 동안 95°C; 2단계, 95°C에서 10초 동안 및 60°C에서 30초; 주기를 40 회 반복하십시오. 프라이머 서열의 전체 목록은 표 1에 제공된다.
5. 적절한 소프트웨어에서 통계 분석을 위해 ^{2-ΔΔCT 방법과 t-test} 방법을 사용하여 qPCR 데이터를 분석합니다. 본 연구에서는 p < 0.05가 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

결과

마우스 탈락 모델 지수에는 자궁의 일반적인 형태, 탈락 및 비탈락 자궁의 질량 비율, 자궁내막의 조직학적 형태 및 탈락 마커 분자의 발현 수준이 포함됩니다. 기름에 의해 유도 된 생쥐의 인공 탈락 자궁의 일반적인 형태는 임신 중 자궁의 형태에 더 가깝습니다. 자궁체가 두꺼워지고 자궁강이 비 유도 측보다 작아집니다. 유도된 자궁 뿔의 부피와 무게는 유도되지 않은 쪽의 부피와 무게보다 훨씬 높습니다(그림 3A, B). 자궁 조직의 HE 염색은 땀샘이 사라지고 유도된 뿔의 자궁내막 기질 세포가 세포 경계가 불분명한 크고 둥근 세포질 및 다핵 탈락 세포로 분화되었음을 보여주었습니다. 유도되지 않은 측면 절편은 정상적인 생리학적 상태 하에서 자궁내막 조직 형태를 보여줍니다(그림 4A). 아조 커플링법의 결과는 오일 유도 측의 알칼리성 포스파타제 함량이 비유도 측보다 현저히 높은 것으로 나타났다(

토론

생쥐의 탈락은 배아의 존재에 따라 자발적인 과정이며, 이는 인간과 다릅니다. 그러나 유리 구슬의 자궁 주입 및 자궁 열상과 같은 인공 자극은 배아 대신 자궁 내막의 탈락을 유도 할 수 있음이 밝혀졌습니다. 또한 연구자들은 스테로이드 호르몬, 프로스타글란딘 및 성장 억제 인자를 자궁강에 주입하는 것과 같은 많은 요인이 탈락을 유도하거나 탈락에 참여할 수 있음을 발견했습니다²¹. 위의 모델링 방법과 비교할 때, 참기름을 각성제로 사용하여 난소 절제술로 여기에 자세히 설명 된 마우스 모델은 내인성으로 생성 된 에스트로겐과 프로게스테론의 영향을 배제 할 수 있습니다. 따라서 경제적이고 조작이 간편합니다.

난소는 잔류 난소 조직을 방지하기 위해 깨끗하게 제거되어야하며, 이는 이후의 탈락 유도에 영향을 미칩니다. 이 단계는 난소에서 생성되는 내인성 에스트로겐과 프로게스테론의 영향을 줄이는 것을 목표로 합니다. 나팔관의 손상은 참기름을 자궁강에 주사...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
에스트로겐	시그마	E2758	호르몬 보충제
프로게스테론	시그마	P0130	호르몬 보충제
참기름	시그마	S3547	호르몬 보충제
소듐 펜토바르비탈	Dainippon Sumitomo 제약 Co., 주식 회사.		마취
Meloxicam 주사	Qilu Animal Health Products Co., Ltd		진통제
알칼리 인산 타제 염색 키트 (카플로 / 아조 커플 링 방법)	Solarbio	G1480	알칼리 인산 분해 효소 염색
Eosin	Servicebio	G1005-2	HE 염색
Hematoxylin	Servicebio	G1005-1	HE 염색
ChamQ 범용 SYBR qPCR 마스터 믹스	Vazyme	Q711-02	qPCR
70% 에탄올	리콘	ZH1120090	소독
요오드포	Runzekang	RZK-DF
소독 에리스로마이신 눈 연고	광저우 Baiyunshan		마우스 안구 보호
4-0 봉합	Ethicon	W329	절개 봉합사
10% 포르말린	Yulu	L25010118	Tissue fix
최적 절단 온도 화합물	Sakura	4583	Ssection
Trizol 시약	Ambion	15596018	qPCR