이 프로토콜은 나노 에멀젼 오피오포고닌 D 보조제가 효과적인 세포 면역 반응을 촉진하는지 여부를 평가하기 위한 상세한 방법을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
백신의 주성분으로서 보조제는 항원과 관련된 강력하고 광범위하며 선천적이며 적응적인 면역 반응을 직접 유도하거나 향상시킬 수 있습니다. 오피오포곤 자포 니쿠스 식물에서 추출한 정제 성분인 오피오포고닌 D(OP-D)는 백신 보조제로 유용한 것으로 밝혀졌습니다. OP-D의 낮은 용해도 및 독성 문제는 저에너지 유화 방법을 사용하여 나노 에멀젼 오피오포고닌 D(NOD)를 제조함으로써 효과적으로 극복할 수 있습니다. 이 기사에서는 세포 활동 평가를 위한 일련의 시험관 내 프로토콜을 검사합니다. L929의 세포독성 효과는 세포 계수 키트-8 분석을 사용하여 결정하였다. 이어서, 면역화된 마우스로부터 비장세포를 자극하고 배양한 후에 분비된 사이토카인 수치 및 상응하는 면역세포수를 ELISA 및 ELISpot 방법으로 검출하였다. 또한, C57BL/6 마우스로부터 분리되고 GM-CSF와 IL-4로 배양한 후 성숙된 골수 유래 수지상 세포(BMDC)의 항원 흡수능을 레이저 스캐닝 공초점 현미경(CLSM)으로 관찰하였다. 중요하게는, 대식세포 활성화는 24시간 동안 보조제와 함께 빈 마우스로부터의 복막 대식세포 (PMs)를 공동 배양한 후 ELISA 키트에 의해 IL-1β, IL-6, 및 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α) 사이토카인의 수준을 측정함으로써 확인되었다. 이 프로토콜이 다른 연구자들에게 새로운 백신 보조제의 세포 반응 효율성을 평가하기 위한 직접적이고 효과적인 실험적 접근 방식을 제공할 것으로 기대됩니다.
서론
백신은 전염성 및 비 전염성 질병을 예방하고 치료하는 중요한 수단입니다. 백신 제형에 보조제 및 전달 비히클의 적절한 첨가는 항원의 면역원성을 향상시키고 오래 지속되는면역 반응을 생성하는 데 유익합니다1. 고전적인 보조제 명반 (알루미늄 염) 외에도 현재 판매되는 백신 용 보조제에는 MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG10184 및 Matrix-M5의 6 가지 보조제가 있습니다. 일반적으로 인체가 바이러스 공격을 받으면 1, 2차 방어선(피부, 점막, 대식세포)이 주도적으로 바이러스를 제거하고, 마지막으로 면역기관과 면역세포를 포함하는 3차 방어선이 활성화된다. 알루미늄 및 알루미늄 염은 1920년대 초부터 인간 백신에 가장 널리 사용되는 보조제였으며 효과적인 선천성면역 반응을 유도했습니다6. 그러나, 면역 세포가 특정 세트의 사이토카인 및 케모카인을 생성하도록 자....
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프로토콜
모든 세포 실험은 기본 수술실, 완충실, 멸균 배양실, 식별 및 분석실을 갖춘 세포 공학 실험실에서 수행되었습니다. 작업 환경과 조건에는 미생물 오염 및 기타 유해 요인이 없었습니다. 동물실험은 실험동물의 관리 및 사용에 관한 가이드라인에 의거하여 수행되었으며, 제3군의과대학 실험동물복지윤리위원회의 승인을 받았다.
1. 오토클레이브 및 재료 준비
- 인산완충식염수(PBS), 가위, 집게, 연마망 등의 시약 및 소모품을 121°C에서 20분간 오토클레이빙하여 습열 멸균하여 준비합니다.
- 필요한 시약 및 장비는 재료 표를 참조하십시오. 블랭크 나노에멀젼(BNE)의 화학식에 대해서는 표 1을 확인하였다.
2. L929 세포독성 분석
- 수조를 켜고 온도를 37 °C로 조절하십시오. 액체 질소로부터 동결된 L929 세포 튜브 하나를 수집하고 37°C 수조에서 빠르게 해동합니다.
- 해동 후 세포를 15mL 멸균 원심분리 튜브에 빠르게 피펫팅하고 DMEM 2mL를 추가하고 잘 혼합합니다.
- 샘플을....
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결과
보조제 OP-D 및 NOD의 세포 활성 평가는 프로토콜 에 따라 시험관내에서 완료되었다. L929 섬유아세포는 NOD 의 시험관내 독성 시험을 위한 유용한 스크리닝 모델이다(도 1). 비장의 염증성 사이토카인 수치의 정량화는 연구자들이 면역 반응을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다(그림 2). ELISpot을 사용한 CTL 모니터링은 임상 시험에서 항원 특이적 T 세포 면역을 평가하고 백신 후보를 선별하기 위한 황금 표준입니다(그림 3). DC에 의한 항원 흡수 증가는 향상된 적응 면역 반응을 유도할 수 있습니다(그림 4). 대식세포는 T 세포에 항원을 제시하고 다른 항원 제시 세포가 공동자극 분자를 발현하도록 유도하여 적응성 면역 반응을 시작하는 데 중요한 역할을 합니다(
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토론
서브유닛 백신은 안전성은 우수하지만 면역원성은 좋지 않습니다. 면역원성을 향상시키기 위한 주요 전략은 항원을 보조제와 물리적으로 흡착하거나 결합하고 이를 약물 전달 시스템에 통합하여 DC의 흡수 및 제시를 촉진하는 것입니다. 퀼라이아 사포닌 및 그 유도체와 같은 천연 식물 사포닌은 독성이 강하며 인간 백신 개발에 적합하지 않습니다17. 따라서 백신이나 보조제가 세포에 미치는 독성 영향에 대한 연구는 새로운 백신 평가에서 필요한 첫 번째 단계입니다.
이 연구에서 제시된 프로토콜은 ISO 10993-5:200918에 따라 수행되어 샘플 제작에 약간의 유연성을 허용합니다. 표준 독성 세포주, L929 섬유아세포 및 치은 섬유아세포는 유사한 수준의 세포독성을 갖는다. 그러나, L929 섬유아세포는 이들의 우수한 재현성 때문에 나노물질의 시험관내 독성 시험을 위한 유용한 스크리닝 모델이 .......
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공개 사항
저자는이 논문에보고 된 작업에 영향을 미칠 수있는 경쟁적인 재정적 또는 개인적 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램의 보조금 번호 2021YFC2302603, 중국 국립 자연 과학 재단 프로그램의 보조금 번호 31670938, 32070924, 82041045 및 32000651, 충칭 자연 과학 재단 프로젝트 프로그램의 보조금 번호 2014jcyjA0107 및 2019jcyjA-msxmx0159, 보조금 번호. 충칭의 대학원 연구 및 혁신 프로젝트의 CYS21519, 육군 의과 대학 특별 프로젝트의 보조금 번호 2020XBK24 및 대학생을위한 국가 혁신 및 기업가 정신 프로그램 202090031021 번 부여.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | GIBCO, 미국 | 25200056 | |
| 96웰 필터 플레이트 | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO4 | General Chemical Company, 미국 | null | |
| Automated Cell Counter | Countstar, 중국 | IC1000 | |
| BALB/c 마우스 및 C57BL/6 마우스 | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | null | |
| 카프릴릭/카프릭 트리글리세리드(GTCC) | Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., 베이징, 중국 | null | |
| CCK-8 키트 | 일본 도진도 | CK04 | |
| 세포 계수판 | Costar, 코닝, 미국 | CO010101 | |
| Cell Sieve | biosharp, 중국 | BS-70-CS | |
| 원심분리기 5810 R | Eppendorf, 독일 | ||
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| DMEM basic(1x) medium | GIBCO, 미국 | C11885500BT | |
| DSZ5000X 도립 현미경 | Nikon, 일본 | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | 뭄바이, 인도 | null | |
| ELISpot classic | AID, 독일 | ELR06 | |
| 소 태아 혈청 | GIBCO, 미국 | 10099141C | |
| 전체 기능 마이크로플레이트 리더 | Thermo Fisher Scientific, 미국 | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, USA | 35050061 | |
| 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 | GM-CSF, R& D Systems, 미국 | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, 미국 | 15630106 | |
| HF 90/240 인큐베이터 | Heal Force, 스위스 | null | |
| IL-4 | PeproTech, 미국 | 042149 | |
| L929 세포주 | FENGHUISHENGWU, 중국 | NCTC 클론 929 (RRID:CVCL_0462) | |
| 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 | Zeiss, 독일 | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, 프랑스 | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, 프랑스 | 36372K | |
| 마우스 IFN-&감마; ELISA 키트 | Dakewe, 중국 | 1210002 | |
| 마우스 IFN-γ 사전 코팅된 ELISPOT 키트 | Dakewe, 중국 | DKW22-2000-096 | |
| 마우스 IL-17A ELISA 키트 | Dakewe, 중국 | 1211702 | |
| 마우스 IL-17A ELISpotPLUS 키트 | ebiosciences, 미국 | 3521-4HPW-2 | |
| 마우스 IL-1β ELISA 키트 | Dakewe, 중국 | 1210122 | |
| 마우스 IL-6 ELISA 키트 | Dakewe, 중국 | 1210602 | |
| 마우스 TNF-&알파; ELISA kit | Dakewe, 중국 | 1217202 | |
| 비필수 아미노산(100x) | Invitrogen, 미국 | 11140050 | |
| Ophiopogonin-D | Chengdu Purui Technology Co. Ltd | 945619-74-9 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 용액 | Invitrogen, 미국 | 15070063 | |
| Phalloidin | Solarbio, 중국 | CA1620 | |
| 인산염 완충 식염수 | ZSGB-BIO, 중국 | ZLI-9062 | |
| 적혈구 용해 완충액 | Solarbio, 중국 | R1010 | |
| RPMI 1640 매체 | Hyclone (Life Technology), 미국 | SH30809.01 | |
| 나트륨 피루베이트 (100 mM) | Invitrogen, 미국 | 11360070 | |
| Squalene | Sigma, 미국 | S3626 | |
| β- 메르캅토에탄올 | Invitrogen, 미국 | 21985023 |
참고문헌
- Cao, W., et al. Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant. Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeuti....
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