방법 논문

생물학적 장벽의 침투 강화를 위한 순환 세포 침투 펩타이드의 구성

DOI:

10.3791/64293

⸱

2022년 9월 19일

 ,  ,  , 
1Sichuan Engineering Research Center for Biomimetic Synthesis of Natural Drugs, School of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 방향족 가교를 갖는 고리형 세포 침투 펩타이드의 합성과 생물학적 장벽을 통한 투과성 평가를 설명합니다.

초록

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암은 세계 보건에서 큰 도전이었습니다. 그러나 복잡한 종양 미세 환경은 일반적으로 더 깊은 종양 세포에 대한 치료제의 접근을 제한하여 종양 재발을 유발합니다. 생물학적 장벽의 제한된 침투를 극복하기 위해 세포 침투 펩타이드(CPP)가 우수한 막 전위 능력을 가지고 발견되었으며 다양한 화물을 세포로 전달하는 데 유용한 분자 수송체로 부상했습니다. 그러나 기존의 선형 CPP는 일반적으로 단백질 분해 안정성이 손상되어 생물학적 장벽을 가로지르는 투과성을 제한합니다. 따라서, 생물학적 장벽을 뚫을 수 있고 향상된 단백질 분해 안정성을 나타낼 수 있는 신규한 분자 수송체의 개발은 생물의학 응용에서 약물 전달 효율을 촉진하기 위해 매우 요구되고 있다. 우리는 이전에 방향족 가교결합을 가진 짧은 고리형 CPP 패널을 합성했으며, 이는 선형 CPP에 비해 암세포와 조직에서 우수한 투과성을 나타냈습니다. 여기에서는 형광 표지된 고리형 폴리아르기닌 R8 펩타이드 및 그 선형 대응물의 합성과 세포 투과성을 조사하기 위한 주요 단계에 대한 간결한 프로토콜이 설명되어 있습니다.

서론

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지난 수십 년 동안 약물 전달을 위한 세포 침투 펩타이드(CPP) 개발이 급속히 발전했습니다. CPP는 신경 질환 1,2, 심장 질환3, 당뇨병4, 피부병5 및 암 6,7을 포함한 다양한 생명을 위협하는 질병의 치료를위한 분자 수송체로 널리 사용되었습니다. 암은 광범위한 연구 노력에도 불구하고 높은 이환율과 사망률을 동반하는 전 세계적인 건강 부담으로 남아 있습니다8. 암 치료의 심각한 장애물은 조밀한 세포외 기질(ECM), 비정상적인 종양 혈관 구조, 다막 장벽 및 높은 간질액 압력(IFP)과 같은 생리학적 장벽으로 인해 더 깊은 종양 세포에 대한 치료제의 제한된 접근입니다9. 따라서 생물학적 장벽을 넘어 화물을 운송할 수 있는 우수한 능력을 가진 새로운 CPP를 개발하는 것은 암 치료를 위한 필수 전략으로 간주됩니다10,11

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프로토콜

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1. 장비 준비

알림: 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 작동 흄 후드에서 모든 절차를 수행하십시오.

  1. 흄 후드에 수동 펩타이드 합성 장치를 조립합니다(그림 1). 3방향 마개(재료 표 참조)를 진공 매니폴드(재료 표 참조)에 놓고 질소(N2)에 연결합니다. 사용하지 않는 입구를 막아야 합니다.
  2. 10mL 폴리프로필렌 컬럼( 재료 표 참조)을 3방향 마개에 부착합니다. 고무 피펫 전구를 사용하거나 폐기물 트랩을 통해 진공을 사용하여 폴리프로필렌 컬럼에서 반응 혼합물 또는 용매를 배출합니다.

2. FITC 표지 선형 R8 펩타이드(FITC-R8) 및 FITC 표지 스테이플 R8 펩타이드(FITC-sR8-4)의 합성

참고: 펩타이드는 표준 Fmoc 기반 고체상 펩타이드 합성(SPPS) 프로토콜25에 따라 합성되었습니다. 4-(2'....

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결과

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이 프로토콜에서는 선형 폴리아르기닌 R8을 고리형 형태로 제한하는 합성 절차가 제시되었습니다. SPPS는 간단한 장치를 사용하여 수동으로 수행되었습니다(그림 1). SPPS의 상세한 합성 공정은 그림 2에 나와 있습니다. 간략하게, 수지를 충분히 팽윤시키고, 이어서 N α-Fmoc 보호기의 탈보호가 뒤따랐다. 이어서, N α-Fmoc-보호된 아미노산을 펩티드 조립이 완료될 때까지 레진 상에 앵커링하였다(도 2의 단계 1-4). 이어서, 미정제 펩티드를 절단 칵테일에 의해 수지로부터 절단하였다(도 2의 단계 5). FITC는 형광 표지된 순환 CPP를 합성하고 생물학적 장벽을 가로지르는 투과성을 추적하기 위해 펩타이드를 표지하는 데 사용되었습니다. .......

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토론

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구조적 제약을 통합함으로써 펩티드의 화학적 안정화는 펩티드26의 안정성 및 세포 투과성을 개선하기 위한 효과적인 전략인 것으로 입증되었다. 이 프로토콜에서는 방향족 가교를 갖는 고리형 CPP의 합성 및 생물학적 장벽에 걸친 투과성 평가를 위한 단계별 절차가 설명됩니다. 친수성 락탐 또는 트리아 졸 가교 결합22,27과 비교하여, 방향족 가교 결합 (이 연구에서 사용됨)의 통합은 CPP의 전반적인 소수성을 향상시켜 세포 투과성을 크게 증가시킵니다. 반면에, 펩타이드 고리화는 금속 촉매 없이 시스테인과의 치환 반응을 통해 쉽게 달성할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 CPP의 고리화는 수지에서 수행되었습니다. 그러나, 고리화 효율은 또한 입체 효과로 인한 펩티드의 특정 서열 및 길이에 의존하며, 이는 이량체 부산물28의 형성을 초래할 수 있다. 이.......

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 중국 자연 과학 재단 (21708031), 중국 박사후 과학 재단 (BX20180264, 2018M643519) 및 중앙 대학 기초 연구 기금 (2682021ZTPY075)의 지원을 받고 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1,2-에탄디티올알라딘K1722093악취
2-(7-아조벤조트리아졸)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HATU)HEOWNSA-0443697
4,4'-bis(bromomethyl)biphenylTCIB1921
4T1 cellsATCC4T1 세포를 37°C에서 10% FBS(Hyclone)가 보충된 DMEM 배지에서 배양하였다. 5% CO2를 함유한 C 가습 인큐베이터.
아세토니트릴 Adamas1484971독성
디클로로 메탄에너지W330229피부 유해
디 에틸 에테르알드리치673811가연성
디메틸 설폭사이드 BeyotimeST038피부 유해
Dulbecco ' s Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco
Electrospray 이온화 질량 분석기WatersG2-S Tof
에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA)BioFroxx1340
소 태아 혈청(FBS)HyClone
유세포 분석기Beckman CoulterCytoFLEX
플루오레세인 이소티오시아네이트 이성질체( FITC)에너지E0801812500
형광 현미경Carl ZeissAxio Observer 7
Fmoc-Arg(Pbf)-OHHEOWNSF-81070
Fmoc-Cys(Trt)-OHGL BiochemGLS201115-35202
Fmoc-β Ala-OHAdamas51341C
HeLa 세포ATCCHeLa 세포를 37°C에서 10% FBS(Hyclone)가 보충된 DMEM에서 배양했습니다. 5% CO2를 함유한 C 가습 인큐베이터.
고성능 액체 크로마토그래애질런트 애질런1260
고성능 액체 크로마토그래피 컬럼애질런트Poroshell EC-C18 120, 4.6 > 150 mm (공극 크기 120 &, 입자 크기 4 & m)
동결 건조기SP 과학Vir Tis
메탄올Aldrich9758독성
Microtiter 플레이트Thermo μ 드롭 플레이트N12391
MorpholineHEOWNSM99040자극성
다중 기술 마이크로플레이트 리더ThermoVARIOSKAN LUX
N,N-DiisopropylethylamineHEOWNSE-81416자극성
N,N-디메틸 포름아미드피부에유해한B020051
Poly-Prep 컬럼Bio-Rad7321010폴리 프로필렌 크로마토 그래피 컬럼
링크 아미드 MBHA 수지 (0.572 mmol / g)GL BiochemGLS180301-49101
3 방향 스톱콕Bio-Rad7328107
조직 배양 플레이트 인서트LABSELECT14211
트리 플루오로 아세트산HEOWNST63278부식성
트리 이소 프로필 실란HEOWNST-0284475
TrypsinBioFroxx1004
진공 매니폴드PromegaA7231
피 트 에너지

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, L., et al. Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(β-amino esters) delivery platform for nerve regeneration. Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).
  2. Park, T. E., et al.

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재인쇄 및 허가

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