Method Article

근접 결찰 분석(proximity ligation assay)을 통해 고정 조직에서 단백질 아르기닌 메틸화(protein arginine methylation)를 검출, 국소화 및 정량화할 수 있습니다.

DOI:

10.3791/64294

⸱

July 20th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Université de Lyon, 2Inserm U1052, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, 3CNRS UMR5286, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, 4Pathology Department, Centre Leon Bérard, 5Plateforme Anatomopathologie Recherche

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

근접 결찰 분석법은 변형된 아르기닌 잔류물을 알 수 없거나 특정 항체를 사용할 수 없는 경우 주어진 단백질의 아르기닌 메틸화를 국소화하고 정량화하는 데 매우 유용한 기술입니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

아르기닌 메틸화(arginine methylation)는 광범위한 생물학적 과정과 관련된 중요한 번역 후 변형(post-translational modification)으로 부상하고 있습니다. 조직에 대한 연구는 표적 아르기닌 잔류물을 인식하는 특정 항체가 없기 때문에 종종 제한됩니다. 근접 결찰 분석법(PLA)은 원래 단백질/단백질 상호 작용을 연구하기 위해 개발되었습니다. 여기에서는 글루코코르티코이드 수용체(GR)에 적용한 아르기닌 메틸화 검출 전용 PLA 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 이전에 PRMT5가 세포의 GR을 디메틸화한다는 것을 보여준 후, 우리는 PLA를 팬 대칭 디메틸 항체 및 항-GR 항체와 함께 사용하여 유방 종양의 GR 메틸화를 측정했습니다. 우리는 PLA가 메틸화 부위가 확인되지 않은 경우에도 표적 단백질의 아르기닌 메틸화를 측정하는 고유한 접근 방식을 제공한다는 것을 보여줍니다. 이 기술은 효과적인 pan 항체를 사용할 수 있는 다른 post-translational modification으로 확장될 수 있습니다. 따라서 GR을 예로 들어 고정 조직에서 아르기닌 메틸화를 감지하는 데 사용되는 PLA 기술에 대해 자세히 설명합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

단백질 아르기닌 메틸전이효소(PRMT)에 의한 아르기닌 메틸화는 수많은 생물학적 과정에 관여하는 풍부한 번역 후 변형(PTM)입니다. PRMT는 S-아데노실 메티오닌에서 아르기닌 잔기로 메틸기의 전달을 촉매합니다. PRMT 제품군은 수행하는 메틸화 유형에 따라 분류된 9개의 구성원으로 구성됩니다. 모든 구성원은 모노메틸화(MMA)를 수행합니다. 유형 1(PRMT1, 2, 3, 4, 6 및 8) PRMT는 비대칭 디메틸화(ADMA)를 촉매하는 반면, 유형 2(PRMT5 및 9)는 대칭 디메틸화(SDMA)를 촉매하고 유형 3(PRMT7)은 MMA1만 생성합니다. 수많은 기질을 메틸화함으로써 다양한 PRMT는 DNA 복구, 전사 조절, 면역 반응, RNA 처리 및 신호 전달과 같은 다양한 중요한 세포 과정을 조절합니다 2,3. 이것은 PRMT가 수용체 자체뿐만 아니라 조절자 또는 히스톤을 메틸화하여 스테로이드 수용체의 활성을 수정하는 스테로이드 호르몬 신호전달에 특히 해당됩니다2.

아르기닌 메틸화는 ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

각 환자로부터 서면 동의서를 받았습니다. 이 연구 프로토콜은 리옹 암 연구 센터(Cancer Research Center of Lyon)의 기관 윤리 위원회(institutional ethics committee)의 승인을 받았습니다.

1. 항체의 선택

  1. IHC 또는 면역형광(IF)으로 검증된 1차 항체를 사용합니다.
    참고: 연구를 위해 선택된 1차 항체는 PLA의 성공에 매우 중요하며, 특히 고정 조직에서 매우 중요합니다. IHC 또는 IF에서 검증한 항체를 사용하면 실험의 성공률이 높아집니다. 실험을 수행하기 전에 항체의 최적화 및 특이성이 필요하며, 이상적으로는 관심 단백질의 발현에 대해 무효화된 세포에서 대조 실험을 수행하고 관련된 메틸전이효소의 효소 활성에 특이적인 억제제를 사용하는 것이 좋습니다. 여기서 조건은 이전에 최적화되었습니다10.

2. 파라핀 함유 세포주 펠렛 준비

참고: 샘플은 겔에 내장된 다음 샘플 탈수 및 파라핀 포매를 위해....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

위에서 설명한 절차를 사용하여 관심 단백질의 메틸화를 검출하고 정량화할 수 있습니다. 여기에서는 PRMT5에 의한 GR의 메틸화의 예를 보여줍니다. PLA에 대한 항체 및 실험 조건은 이전에 세포10에 적용되었습니다. 간단히 말해서, GR 및 SDMA를 표적으로 하는 1차 항체는 상보적 올리고뉴클레오티드와 접합된 근접 프로브에 의해 인식됩니다. 그런 다음, 원형 DNA 프로브의 혼성화는 단백질이 매우 근접할 때 발생합니다. 이 DNA의 후속 증폭은 명시야 현미경 검사에서 HRP에 의해 시각화됩니다(그림 1). IHC에 의한 GR 및 PRMT5를 검출하기 위한 이상적인 조건은 먼저 여러 유방 종양에서 분석되었습니다(그림 2). GR 메틸화를 검출하기 위해 GR(마우스)과 pan SDMA(토끼)를 인식하는 다른 동물 종에서 사육된 1차 항체를 사용했습니다. 앞서 설명한 대로 후속 PL.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

아르기닌 메틸화는 다른 PTM과 마찬가지로 단백질 기능의 미세한 조절에 기여합니다. 그러나 이러한 수정 사항을 평가하기가 어렵기 때문에 그 영향이 과소 평가되고 있으며, 주로 도구가 부족하기 때문입니다. 이는 생체 내에서 메틸화를 연구할 때 특히 그러한데, 아르기닌 메틸화를 측정하는 유일한 방법은 관심 단백질의 메틸화된 잔류물을 인식하는 특정 항체를 보유하는 것입니다. 이는 메틸화된 아르기닌 잔기를 알려야 하고, 변형에 대한 특이적이고 효과적인 항체가 IHC 적용을 위해 이용 가능해야 하기 때문에 명백히 한계를 구성하며, 이는 드문 경우입니다.

여기에서는 다양한 유형의 메틸화(MMA, SDMA 및 ADMA)에 대해 제기된 팬 메틸 항체를 사용하여 이러한 장애물을 우회하는 방법을 제시합니다. 우리는 이전에 관심 단백질을 인식하는 항체에 팬 메틸 항체를 결합하는 것이 고정 세포

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

원고를 교정해 주신 B. Manship에게 감사드립니다. 기술적 도움을 주신 Laura Francols, Clémentine Le Nevé, 연구 병리학 플랫폼(CRCL)에 감사드립니다. 그림 1은 Servier Medical Art를 사용하여 제작되었습니다. 이 연구는 Ligue Inter-régionale contre le Cancer와 협회 'Le Cancer du sein, parlons-en'의 지원을 받았습니다.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
접착 슬라이드 TOMO 90°, x100VWR631-1239
anti-GR 항체 (마우스)Santa Cruzsc393232
anti-GR 항체 (마우스)Santa Cruzsc393232
anti-PRMT5 항체 (rabbit)Merck07-405
anti-SDMA 항체 (rabbit)CST13222
Automate d'포함물LeicaASP 6025파라핀 침투 및 블록 준비
Autostainer XLLeicaST5010Autostainer
카세트 Q path macrostar III  x1500VWR720-2233
CC1Roche5279801001
Citrate Buffer pH 6 10x, 100 mLMMFF/T0050
Dako 항체 희석제Dako AgilentS202230-2항체 희석제
Discovery ChromoMap Diaminobenzidine (DAB) 키트Roche760-159Diaminobenzidine (DAB) 키트
Discovery WashRoche7311079001
Duolink insitu  PLA 프로브 안티 마우스 마이너스 Sigma-AldrichDUO92004PLA  키트(프로브 안티 래빗 마이너스)
Duolink 인사이투 검출 시약 명시야Sigma-AldrichDUO92012PLA  키트(현장 검출 시약)
Duolink 인사이투 PLA 프로브 안티 래빗 플러스Sigma-AldrichDUO92002PLA  키트(프로브 안티 래빗 플러스)
Duolink 인사이투 세척 버퍼 명시야Sigma-AldrichDUO82047PLA  키트 (현장 세척 버퍼)
에탄올 96% VOL TECHNISOLV, 5 LVWR83804.360
에탄올 절대 ≥ 99.8%, AnalaR 노마푸르 ACS,  5 LVWR20821.365
EZ Prep 10xRoche5279771001
Formol, 즉시 사용 가능, 5 LMMFF/40877-36Formalin
전자동 유리 커버슬리퍼LeicaCV5030자동 커버슬리퍼
유리 커버슬립 24 x 40Dutscher100037
HematoxylinVentana760-2021
IHC 기기RocheDISCOVERY XTIHC
LCSRoche5264839001
MicrotomeThermo ScientificMicrom HM340E블록을 포함한 조직 절단
매체 PertexHistolab00801-FR
PAP 면역 염색용 펜Sigma-AldrichZ672548-1EA
파라핀 왁스 텍 III, 4 x 2, 5kgSakura4511
파스퇴르 일회용 피펫Fisher Scientific12583237
PBS 버퍼 10x, 100 mLMMFF/T0020
반응 버퍼 10xRoche5353955001
Ribo Wash 10xRoche5266262001
RiboCC1Roche
2차 항체 안티-마우스Abcamab133469
2차 항체 OmniMap 안티-래빗 HRPRoche760-4311
조직 임베딩 센터MMFEC 350
크실렌 (이성질체의 혼합물) ≥ 98.5%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5LVWR28975.360
Zeiss Axio Imager M2 현미경정립 명시야 현미경
자동화 마운팅 5266297001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: The coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  2. Malbeteau, L., et al. How protein methylation regulates steroid receptor function. Endocrine Reviews. 43 (1), 160-197 (2021).
  3. Guccione, E., Richard, S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Proximity Ligation AssayArginine MethylationProtein MethylationFixed TissuePost Translational ModificationGlucocorticoid ReceptorPRMT5 DimethylationPan Dimethyl AntibodyProtein LocalizationProtein Quantification
Video Coming Soon

Related Articles