여기서 목표는 심혈관 질환에서 dysbiosis의 메커니즘을 조사하기 위한 프로토콜을 설명하는 것입니다. 이 논문은 쥐 분변 샘플을 무균적으로 수집 및 이식하고, 장을 분리하고, "Swiss-roll" 방법을 사용한 다음 면역염색 기술을 사용하여 위장관의 변화를 조사하는 방법에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
장내 미생물 dysbiosis는 심혈관 및 대사 장애의 병태생리학에서 중요한 역할을 하지만 그 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 분변 미생물군 이식(FMT)은 질병 병태생리학에서 전체 미생물군 또는 분리된 종의 직접적인 역할을 설명하는 귀중한 접근 방식입니다. 재발성 클로스트리디움 디피실 감염 환자에게 안전한 치료 옵션입니다. 전임상 연구에 따르면 장내 미생물군을 조작하는 것이 dysbiosis와 질병 사이의 기계적 연관성을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 분변 미생물군 이식은 심혈관 질환의 관리 및 치료를 위한 새로운 장내 미생물군 표적 치료제를 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 설치류의 높은 성공률에도 불구하고 이식과 관련된 번역 변화가 남아 있습니다. 여기서 목표는 실험적 심혈관 질환에서 장내 미생물군집의 영향을 연구하는 데 지침을 제공하는 것입니다. 이 연구에서는 쥐 연구에서 분변 미생물총의 수집, 취급, 처리 및 이식에 대한 자세한 프로토콜이 설명됩니다. 수집 및 처리 단계는 인간 및 설치류 기증자 모두에 대해 설명됩니다. 마지막으로, 우리는 심혈관 질환 및 관련 장내 미생물군 메커니즘의 장 특이적 형태 및 무결성 변화를 평가하기 위해 스위스 롤링 및 면역 염색 기술의 조합을 사용하여 설명합니다.
서론
심장병과 뇌졸중을 포함한 심장 대사 장애는 전 세계 주요 사망 원인입니다1. 신체 활동 부족, 영양 부족, 노화 및 유전학은 이러한 장애의 병태생리학을 조절합니다. 축적된 증거는 장내 미생물군이 제2형 당뇨병2, 비만3, 고혈압4을 포함한 심혈관 및 대사 장애에 영향을 미친다는 개념을 뒷받침하며, 이는 이러한 질병에 대한 새로운 치료법 개발의 열쇠가 될 수 있습니다.
미생물군이 질병을 일으키는 정확한 메커니즘은 아직 알려지지 않았으며, 부분적으로는 방법론적 차이로 인해 현재 연구는 매우 다양합니다. 분변 미생물군 이식(FMT)은 질병 병태생리학에서 전체 미생물군 또는 분리된 종의 직접적인 역할을 설명하는 귀중한 접근 방식입니다. FMT는 표현형을 유도하거나 억제하기 위해 동물 연구에서 널리 사용됩니다. 예를 들어, 칼로리 섭취 및 포도당 대사는 배설물을 아픈 기증자로부터 건강한 수혜자에게 전달함으로써 조절될 수 있다 5,6. 인간의 경우, FMT는 클로스트리디움 ....
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프로토콜
밴더빌트 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회는 이 원고에 설명된 모든 절차를 승인했습니다. 생후 3개월의 C57B1/6 수컷 마우스를 잭슨 연구소(Jackson Laboratory)에서 구입하여 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 사육하고 관리했습니다.
1. 인간 배설물 샘플의 수집, 저장 및 처리
- 피험자가 클리닉에 있는 경우 멸균 용기를 사용하여 대변 샘플을 수집합니다. 처리 준비가 될 때까지 수집 후 36시간 이내에 4°C에서 대변 샘플을 냉장 보관합니다. 또는 시중에서 판매되는 도구를 사용하여 대변 샘플을 수집하여 주변 온도, 특히 가정에서 쉽게 DNA 안정성을 확보할 수 있습니다.
- 10% 표백제 용액 또는 기타 환경 보호국에서 승인한 소독제로 생물 안전 수준의 흄 후드를 소독하십시오.
- 서늘한 보관소에서 의자를 꺼내 흄 후드에 넣습니다. 일회용 주걱을 사용하여 ~1g 분취량을 만들고 완전히 처리할 준비가 될 때까지 -80°C 냉동고에 보관합니다.
- 모든 일회용품은 생물학적 위험 쓰레기통에 버리십시오. 모든 표면(후드 및 프로세서가 만지는 모....
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결과
위에서 설명한 단계는 그림 1에 요약되어 있습니다. 마우스 맹장 내용물 또는 인간 배설물을 멸균 식염수에 재현탁하여 먼저 연속 3일 동안, 그 다음 3일에 한 번씩 위관영양법으로 무균 마우스(100μL)에게 제공할 슬러리를 제조합니다. 프로토콜이 끝나면 꼬리 커프 방법으로 혈압을 측정하고 마우스를 안락사시키고 조직을 채취하여 장내 미생물총의 변화와 심혈관 및 대사 변화를 평가합니다.
미생물군을 선택하는 핵심 단계는 관심 있는 질병 표현형이 기증자에게 존재하고 dysbiotic 변화와 관련이 있는지 확인하는 것입니다. 예를 들어, 고염식은 dysbiosis와 심혈관 기능 장애와 밀접한 관련이 있습니다. 이 연구에서는 8% NaCl 식단을 먹인 마우스 기증자를 사용했습니다. 높은 염분에 대한 장내 미생물총의 변화에는 박테리아 생물다양성의 감소가 포함되었으며(그림 2A), 이는 .......
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토론
심혈관 및 대사 질환에서 장내 미생물총의 인과적 역할을 연구하는 귀중한 접근 방식은 전체 미생물군 또는 선별된 관심 종을 무균 마우스로 옮기는 것입니다. 여기에서 우리는 고혈압 장애에서 장내 미생물총의 역할을 연구하기 위해 인간과 전통적으로 수용된 쥐의 배설물 샘플을 무균 생쥐로 수집하는 프로토콜을 설명합니다.
생쥐에서는 호기성실에서 처리 된 무균 수집 맹장 내용물을 사용하고 인간에서는 대변을 수집합니다. FMT는 샘플이 아직 신선하거나 액체 질소에서 급속 냉동된 상태에서 즉시 수행할 수 있으며 사용할 준비가 될 때까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다. 인간이 집에서 샘플을 수집하는 경우와 같이 샘플을 즉시 얼릴 수 없는 경우 에탄올과 같은 핵산에 방부제를 사용하는 것이 중요합니다. 장내 대부분의 박테리아는 혐기성 세균입니다. 이식을 위해 분변 샘플을 준비할 때, 박테리아가 호기성 환경에 노출되는 것을 피하기 위해 신속하게 이루어져야 하는데, 이는 혼합물 내의 혐기성 세균의 감.......
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공개 사항
금전적 또는 기타 이해 상충은 저자에 의해 선언되지 않습니다.
감사의 글
이 연구는 National Center for Advancing Translational Sciences의 Vanderbilt Clinical and Translational Science Award Grant UL1TR002243(to A.K.)의 지원을 받았습니다. 미국 심장 협회 보조금 POST903428 (JAI에); 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소는 K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941(AK로) 보조금을 부여하고 NIH는 1P01HL116263(VK로)을 부여합니다. 그림 1 은 Biorender를 사용하여 생성되었습니다.
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참고문헌
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: a report From the American Heart Association. Circulation. 143 (8), 254(2021).
- Wu, H., et al. The gut microbiota in prediabetes and diabetes:....
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