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방법 논문

깨어 있는 머리 고정 쥐의 신경 영상을 위한 머리 임플란트

2.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/64324

⸱

2022년 9월 7일

 ,  ,  , 
1Department of Neurobiology and Behavior, School of Biological Sciences, University of California Irvine, 2Department of Biomedical Engineering, School of Engineering, University of California, Irvine, 33Center for Neurobiology of Learning and Memory, University of California, Irvine

이 논문에서

요약

깨어 있는 머리 고정 쥐의 기능적 이미징을 위한 상세한 새로운 절차가 설명됩니다.

초록

전임상 및 기초 과학 연구에 일반적으로 사용되는 마취제는 뇌의 대사, 신경 및 혈관 기능에 우울한 영향을 미치며 신경 생리학적 결과에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 연구 연구에 깨어 있는 동물을 사용하는 것은 유리하지만 데이터 수집 전반에 걸쳐 모션 아티팩트를 최소화하기 위해 동물을 침착하고 정지 상태로 유지해야 하는 주요 과제를 제기합니다. 더 작은 크기의 설치류(예: 생쥐)에서 깨어 있는 이미징은 매우 일반적이지만 쥐가 더 크고 강하며 이미징에 필요한 오랜 기간 동안 움직임 제한 및 머리 고정에 반대하는 경향이 더 크기 때문에 쥐에서는 부족합니다. 맞춤형 손으로 꿰매는 슬링, 3D 프린팅된 머리 임플란트, 헤드 캡 및 헤드프레임을 사용하여 깨어 있는 머리 고정 쥐의 신경 영상의 새로운 모델에 대해 설명합니다. 단일 수염 자극에 대한 단일 시도 후 얻은 결과는 유발된 기능적 반응의 강도가 증가했음을 시사합니다. 깨어 있는 머리가 고정된 쥐에서 유발된 기능적 반응을 얻는 것은 마취된 쥐보다 빠르고 신뢰할 수 있고 재현 가능하며 반복적인 종단 연구에 사용할 수 있습니다.

서론

대부분의 기본, 전임상 및 중개 과학적 신경 영상 조사는 마취 된 동물 1,2에서 획득됩니다. 마취제는 실험을 용이하게 하지만 뇌와 신체의 신진대사, 혈압 및 심박수에 지속적으로 영향을 미칩니다3. 마취제의 종류와 투여 기간 및 경로는 재현성 및 번역 실패에 기여할 수 있는 데이터 해석에 교란 변수를 추가합니다4. 깨어 있는 머리 고정 쥐 신경 영상 연구의 주요 병목 현상은 준비 및 데이터 수집 과정 전반에 걸쳐 쥐를 고정시키고 침착하게 유지해야 한다는 요구 사항입니다. 작은 움직임은 부당한 모션 아티팩트를 생성하여 데이터 분석 및 해석에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.

맞춤형 슬링, 3차원(3D) 프린팅된 머리 임플란트, 헤드 캡 및 헤드프레임을 사용하여 깨어 있는 머리 고정 쥐의 새로운 신경 영상 모델이 고안되어 쉽게 실험할 수 있는 몇 가지 이점을 제공합니다. 3D 헤드 임플란트는 가볍고 트랜스픽션에 필요한 두개골의 작은 부분을 덮습니다. 3D 프린팅된 머리 임플란트 및 캡은 CAD(Computer-Aided Design) 소프트웨어를 사용하여 설계되었습니다. 수염 자극, 데이터 수집, 데이터 분석 및 마취된 쥐의 결과는 이전 연구 5,6,7에서 자세히 설명되었습니다.

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프로토콜

모든 절차는 국립 보건원 (National Institute of Health) 지침을 준수했으며 캘리포니아 대학교 어바인 동물 관리 및 사용위원회 (University of California, Irvine Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 7마리의 수컷 및 1마리의 암컷 쥐(Sprague-Dawley, 체중: 185-350 g)를 본 연구에 사용하였다. 연구 완료 후, 래트를 이산화탄소 과다 투여를 사용하여 희생시켰다.

1. 다른 구성 요소의 디자인

  1. 머리 임플란트의 디자인 :
    1. CAD 소프트웨어(그림 1C)를 사용하여 머리 임플란트를 만들고 체감각 피질을 중심으로 브레그마 뒤쪽과 정중선에 인접한 영역을 이미지화하도록 설계합니다. 머리 임플란트가 이미징 영역에서 떨어진 두개골의 0.9mm에서 1.9mm 영역을 덮는지 확인하십시오.
    2. 세 개의 나사만 사용하여 머리 임플란트를 쥐의 두개골에 고정합니다. 이미지화된 반구의 반대쪽 반구에서 정중선의 반대쪽에 유지되도록 모든 나사 구멍을 설계합니다.
    3. 그림 1D와 같이 와이어가 헤드 임플란트를 헤드 임플란트에 고정할 수 있도록 헤드 임플란트의 상단 부분에 안쪽에서 움푹 들어간 막대를 놓습니다.
  2. 헤드 캡의 디자인:
    1. 헤드 캡이 이미징 영역을 완전히 덮고 그림 1A, B와 같이 모든 종류의 외상으로부터 보호하는지 확인하십시오. 헤드 캡에 곡률을 추가하여 표준 강화 케이지에서 동물의 일상 활동에 어려움을주지 않고 머리 모양에 맞 춥니 다.
    2. 그림 1E와 같이 헤드 임플란트의 윗부분이 들어갈 수 있도록 헤드 캡의 안쪽을 더 넓은 직사각형 모양으로 자릅니다. 이 직사각형에 수직으로 두 개의 다른 직사각형 영역을 잘라 헤드 캡을 헤드 임플란트에 고정합니다.
    3. 그림 1E-G와 같이 쥐 머리에 헤드 캡을 고정하기 위해 헤드 임플란트의 상부 중공 막대를 통해 하나의 와이어를 통과시킵니다. 같은 방법으로 두 번째 와이어를 통과시킵니다.
      알림: 이 전선은 펜치나 집게를 사용하여 쉽게 제거할 수 있습니다. 3D 프린팅 파일은 보충 파일 1 및 보충 파일 2로 제공됩니다(파일 형식: STL).
  3. 헤드 프레임의 디자인 :
    1. 하나의 절단된 부분이 헤드 임플란트의 상단 막대를 통해 이동할 수 있고 클램프를 사용하여 고정되는 방식으로 헤드 프레임을 설계합니다.
    2. 다른 절단 부분의 각도를 조정하여 쥐의 머리를 고정된 상태로 유지하기 위한 추가 강도를 제공하여 반대쪽 면이 이미징을 위해 완전히 접근할 수 있도록 합니다. 이 연구의 목적을 위해 주석 조각으로 강판을 절단하여 헤드 프레임을 생성합니다(그림 1H, I).
      참고: 이 부품도 3D 인쇄할 수 있습니다.

2. 초기 쥐 훈련

  1. 쥐가 새장에서 2-3 일 동안 동물 사육장 환경에 적응하도록하십시오.
  2. 조용한 방에서 쥐를 다루기 시작하십시오. 새장을 열고 실험자가 쥐 근처의 새장 안에 손을 넣어 쥐가 익숙해지도록 15-20 분 동안 두십시오.
  3. 쥐가 깜짝 놀라거나 실험자의 손에서 도망 치지 않고 침착 함을 나타내면 쥐를 부드럽게 들어 올려 다루십시오. 슬링 훈련 전에 매일 30-45분 동안 쥐를 다루십시오.

3. 슬링 훈련

  1. 머리 임플란트와 머리 캡을 외과적으로 이식하기 전에 슬링에서 최소 2-3일 동안 쥐를 훈련시킵니다.
  2. 그림 2A와 같이 슬링 설정을 정렬합니다. 에탄올 물티슈를 사용하여 슬링 설정을 청소합니다.
    알림: 모든 슬링은 손으로 꿰매고 그림 2A, B와 같이 바닥 또는 양쪽에 그물 재료로 만들어졌습니다.
  3. 슬링 훈련의 경우 뒷발 핀치 반사가 없을 때까지 유도를 위해 4% 이소플루란을, 유지 관리를 위해 1%를 사용하여 쥐를 마취합니다.
  4. 이소 플루 란 마취하에 쥐를 20cm x 8cm (길이 x 너비) 크기의 유연한 플라스틱 시트에 놓고 플라스틱 시트의 10cm x 8cm가 벨크로의 부드러운 부분으로 완전히 덮여 있습니다.
    참고: 슬링 훈련을 위해 쥐를 마취하는 것은 주로 스트레스와 불안을 줄이는 데 사용되는 선택적 단계입니다.
  5. 훈련의 처음 2 일 동안, 양말 끝에 절개 된 작은 구멍을 통해 머리가 밖으로 나오도록 아기 양말 (크기 0-3 개월)에 쥐를 꼭 맞 춥니 다.
  6. 쥐를 건조하게 유지하고 배설물을 수집하기 위해 하체 부위에 작은 흡수 패드 조각을 감습니다.
  7. 통기성있는 면직물 (크기 : 25cm x 25cm)로 쥐를 싸십시오. 벨크로 스트립이 붙어있는 플라스틱 시트에 쥐를 놓습니다.
  8. 서로 3-6mm의 거리에있는 0.5cm 너비의 벨크로 스트립을 사용하여 쥐를 플라스틱 시트에 더 고정시킵니다.
  9. 슬링에 쥐를 고정하십시오. 가스 마취를 제거하십시오. 쥐가 슬링의 가스 마취에서 회복되도록하십시오.
  10. 쥐가 휘젓기 시작하면 10-15분마다 보상으로 10% 자당 용액 몇 방울을 제공하십시오.
  11. 쥐가 감각 자극에 익숙해지도록 이미징 중에 사용될 감각 자극(여기서는 수염 자극, 15-25분마다)을 무작위로 제시합니다. 임의의 간격으로 수염을 수동으로 자극하십시오.
  12. 그림 2C와 같이 슬링에서 쥐를 1일차에 1시간, 2일차에 2시간, 3일차에 3시간 동안 훈련시킵니다.

4. 수술 전 준비

  1. 3D 프린터를 사용하여 머리 임플란트와 머리 캡을 인쇄합니다(그림 1).
  2. 장비를 Metricide28 살균제에 10시간 동안 담가 모든 수술 기구와 헤드피스(임플란트 및 캡)를 소독합니다. 수술 직전에 멸균수로 도구를 철저히 헹굽니다.
  3. 쥐를 4% 이소플루란에 노출시킨 다음 뒷발 꼬집음 반사가 없을 때까지 1%-2% 이소플루란을 유지합니다. 이 수술은 이소플루란, 펜토바르비탈 나트륨, 케타민-자일라진과 같은 다양한 유형의 마취 하에 수행할 수 있습니다.
  4. 아트로핀(0.05mg/kg)을 근육주사하여 점액 분비를 줄여 호흡을 돕습니다.
  5. 눈 사이부터 귀 뒤쪽까지 헤어 트리머를 사용하여 정중선을 중심으로 쥐의 머리를 5mm 면도합니다.
  6. 쥐의 뒷다리에 고정된 맥박 산소 측정기와 심박수 모니터 프로브를 통해 부분 산소 포화도와 심박수를 모니터링합니다.
  7. 쥐의 머리와 주변을 베타딘과 70% 알코올 물티슈를 번갈아 가며 세 번 닦습니다.
  8. 입체 시스템에서 쥐를 고정하십시오.
  9. 바셀린 윤활 직장 프로브를 삽입하여 쥐의 체온을 측정하고 마취 투여 후 저체온증을 피하기 위해 가열 담요의 피드백 시스템을 통해 유지합니다.
  10. 수술 부위에 국소 마취제 리도카인 염산염을 20mg/ml, 0.07mg/kg +/-0.2 체중의 농도로 피하 투여합니다.
  11. 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 안과 연고를 바르십시오.
  12. 수술 부위에 2% 국소 마취제를 피하 투여합니다.
  13. 수유 링거액 3mL를 실온에서 피하 주사하여 탈수를 방지하고 수술 중 영양을 공급합니다.

5. 수술

  1. 날카로운 수술용 가위를 사용하여 수술 부위(정중선과 머리 중앙을 중심으로 직경 4mm)의 피부 부분을 제거합니다. 머리의 측두엽에서 귀와 눈 사이의 피부 일부(직경 ~2mm, 왼쪽 체성감각 피질 위)를 해부하고 제거합니다.
  2. 메스를 사용하여 밑에 있는 피부(두개골 주위) 조직을 제거하여 두개골을 노출시킵니다. 멸균 된면 거즈를 사용하여 두개골을 청소하십시오.
  3. 측두근을 수축/절제하여 이미징 영역에 대해 원하는 크기[이 연구의 경우 7.5mm x 7.5mm]를 노출시킵니다.
  4. 머리 임플란트를 위해 반대쪽 반구에 두개골을 노출시킵니다. 그림 2D-F와 같이 두개골에 헤드 임플란트를 놓고 임플란트용 고정 나사의 위치를 확인합니다.
  5. 드릴 비트 1이 있는 India Ink를 사용하여 나사를 뚫기 위해 두개골을 표시합니다. 치과용 드릴 비트 3을 사용하여 나사용 버 구멍을 뚫습니다. 헤드 임플란트를 제자리에 조입니다.
  6. 멸균 거즈를 사용하여 두개골을 말리십시오. 두부 임플란트 주변과 아래에 조직 접착제를 얇게 바르고 두개골에 붙입니다. 헤드 임플란트를 제자리에 더 지지하기 위해 치과용 시멘트 층을 바르고 시멘트를 2-3분 동안 건조시킵니다.
    참고: 치과용 시멘트 외에 조직 접착제를 사용하면 강력한 고정력을 유지할 수 있습니다8.
  7. 치과용 드릴 비트 3을 사용하여 두개골 왼쪽의 브레그마 바로 뒤쪽과 정중선 측면의 7.5mm x 7.5mm 영역을 얇게 만듭니다. 그림 50A와 같이 두개골을 ~3μm로 얇게 만듭니다.
  8. 수술 부위에 국소 항생제 연고를 바르고 그림 3B와 같이 얇아진 두개골을 보호하기 위해 얇은 실리콘 고무 층으로 덮습니다. 그림 3C와 같이 헤드 캡을 사용하여 수술 부위를 덮습니다. 그림 3D, E와 같이 헤드 임플란트와 헤드 캡을 모두 통과하는 두 개의 작은 와이어 조각으로 제자리에 고정합니다. 그림 3F와 같이 머리 캡과 두개골을 덮기 위해 실리콘 고무를 적용하여 쥐의 머리에 헤드 캡을 더 고정시킵니다.
    알림: 실리콘 고무는 얇아진 두개골을 추가로 보호합니다.
  9. 통증 및 염증 관리를 위해 쥐에게 플루니신 메글루민(2.5mg/kg)을 피하 주사합니다. 감염을 예방하려면 Enrosite 항생제 enrofloxacin(22.7mg/ml, 10mg/kg +/-.01)을 복강 주사하십시오.
  10. 쥐를 회복실로 옮겨 온난화 담요와 열 램프로 체온을 유지하도록 돕습니다. 쥐가 의식을 되찾고 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 때까지 지속적으로 모니터링합니다.
  11. 쥐가 완전히 회복되면 별도의 케이지로 되돌립니다.
  12. 다음 3일 동안 플루니신과 부프레노르핀을 투여하여 염증과 통증을 완화하고 감염을 예방하기 위해 하루에 두 번 투여합니다.

6. 깨어있는 이미징

  1. 뒷발 꼬집음 반사가 없을 때 유도를 위해 4 % 이소 플루 란으로, 유지 관리를 위해 1 %로 쥐를 마취하십시오. 아세프로마진(0.3-0.5 mg/kg)을 피하 주사한다.
    참고: 이 농도의 아세프로마진은 경미한 진정 수준보다 낮으며 이미징 과정 전반에 걸쳐 쥐를 침착하게 유지하는 데 도움이 됩니다.
  2. 맞춤형 벨크로 스트립을 사용하여 훈련 과정에서 사용되는 플라스틱 시트에 쥐를 고정합니다. 흡수 패드를 사용하여 하체 부분을 감싸고 쥐를 슬링에 꼭 맞춥니다.
  3. 실리콘 고무를 제거합니다. 고정 와이어를 제거하여 헤드 캡을 제거합니다. 그림 2G와 같이 헤드 임플란트에 헤드프레임을 고정합니다.
  4. 헤드프레임을 잠급니다.amp그림 2H, I와 같이 s.
  5. 가스 마취를 제거하십시오. 식염수 3x로 이미징 영역을 세척하고 젖은 거즈로 청소합니다. 이미징 영역을 건조시키고 이미징 영역 주위에 바셀린을 사용하여 우물을 만듭니다. 멸균 된 식염수로 우물을 채우고 유리 슬라이드로 덮습니다 (그림 2E).
  6. 앞서6,7에서 상세히 논의한 고유 신호 광학 이미징, 수염 자극 프로토콜, 데이터 분석 및 프리젠테이션을 위한 획득 절차를 참조한다.
  7. 실험 전반에 걸쳐 쥐의 동요와 안절부절 못함의 징후를 모니터링하며, 이는 부드러운 천이나 거즈(선택 사항)로 쥐의 눈을 가리면 더 줄일 수 있습니다.

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결과

마취된 쥐의 단일 시험에서 나온 대표적인 광학 이미징 신호와 깨어 있는 쥐의 합산된 반응(수집된 40건의 시험)이 표시됩니다(그림 4). 깨어 있는 쥐의 단일 수염 자극에 대한 신호 강도는 마취된 쥐보다 더 높은 임계값에서 시각화될 수 있으며, 이는 깨어 있는 동물로부터 더 강한 신호를 보여줍니다. 쥐의 C2 수염을 5Hz에서 1초 동안 자극하고 기능적 반응을 기준선과 비교하여 부분 변화로 표시합니다. 어두운 영역(음의 역치 이하)은 신경 활동의 주요 영역이며, 밝은 흰색 영역(양성 역치 이상)은 자극에 대한 산소화된 혈액 반응을 나타낸다9. 화살표로 표시된 것처럼 왼쪽에서 오른쪽은 주둥이에서 꼬리까지(C), 위에서 아래로는 내측에서 측면(L) 방향이 되도록 이미지가 정렬됩니다.

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토론

깨어 있는 머리 고정 쥐 이미징을 사용하면 용이성과 사용자 정의 측면에서 많은 이점을 얻을 수 있습니다. 맞춤형으로 설계된 슬링은 쥐를 통기성 있는 그물망 재료로 감쌀 수 있게 하여 동물을 밀폐된 플라스틱 구속실에 장기간 가둘 필요가 없습니다10,11. 쥐는 쥐의 약한 진정 수준(1.0-2.5mg/kg)보다 낮은 매우 낮은 용량의 아세프로마진을 사용하여 연속적인 이미징 세션의 긴 기간 동안 침착하고 스트레스 없이 유지됩니다.12. 쥐를 안정적으로 유지하고 이미징 세션 동안 모션 아티팩트를 추가로 제거하기 위해 벨크로 스트립이 사용됩니다. 벨크로 스트립은 장시간 불필요한 신체 수축을 방지하기 위해 서로 3-6mm 떨어진 곳에 배치됩니다. 쥐는 준비 및 데이터 수집 중에 슬링에서 침착하고 편안하게 휴식을 취할 수 있도록 어린 나이에 슬링으로 훈련되고 익숙해집니다. 예비 결과에 따르면, ...

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

Clara Jones, James Stirwalt, Linh Hoang, Young Joon Ha 및 Amirsoheil Zareh에게 쥐 훈련과 슬링 준비에 도움을 주신 것에 감사드립니다. 자금은 국립 보건원(NIH, 보조금 번호: NS119852)과 Leducq 재단(보조금 번호:15CVD02)에서 제공했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
쥐찰스 리버Sprague Dawley
IsofluranePivetal21295098전신 마취제
Lidocaine HCl 2 % 주입PhoenixL-2000-04국소 마취제
아트로핀 황산염 주사Vedco5098907512호흡에 도움
젖산 Ringer의 주사 솔루션Vedco
Flunixin 주사Vedco6064408670통증 관리
엔로사이트 주사 (Enrofloxacin 2.27%)VetOne501084감염 방지
PromAce 주사 (Acepromazine maleate)Beohringer Ingelheim136059
Animax 연고Dechra Veterinary Products122-75그램 당 nystatin 1000units, 그램 당 neomycin sulfate 2.5mg, gram 당 thiostrepton 2500 units 및 gram 당 triamcinolone acetonide 1mg의 활성 성분
Puralube 안과 연고Dechra Veterinary Products211-38
Povidone-iodine PVP 준비 패드MedlineMDS093917Betadine 일반
이소 프로필 알코올 면봉BD326895
Vetbond 조직 접착제3M1469SB
Bur (드릴 비트), 표준 작업자 카바이드SS White Burs14829# 3 버
나사, 00-90 x 1/8 플랫 헤드 스테인레스 스틸J.I. MorrisF0090CE125앵커 나사
입체 시스템Kopf Instruments1430
동종 난방 담요Harvard Apparatus50-7220-F
맥박 산소 측정기 및 심박수 모니터Kent ScientificMouseStat Jr.
PetrolatumFisher ScientificP66-1LB바셀린 일반
와이어, 벌거벗은 구리Fisher Scientific15-545-2C20 게이지
티츠 콜드 큐어 파우더Pearson DentalC73-0054 활성 성분 : 메틸 메타 크릴 레이트
Teets 콜드 큐어 리퀴드피어슨 치과C73-0078 활성 성분 : 메틸 메타 크릴 레이트
실리콘 몰드 고무Smooth-OnBody Double Fast실리콘 폴리머
Metricide 28 (살균제)MetrexOct-05
인도 잉크, 검정Pelikan 301051
치과 드릴NSK DentalUltimate XL-F
3D 프린터Prusa Researchi3 MK3S +
패스너벨크로봉제90030
애완 동물 스크리닝 유틸리티 패브릭Joann10173334그물 재료
버 (드릴 비트), 표준 운영 카바이드SS White Burs14829# 1 버
50989088317

참고문헌

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깨어 있는 머리 고정 쥐의 신경 영상을 위한 머리 임플란트
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