이 백서에서는 전혈에서 무세포 DNA 및 순환 종양 세포와 같은 물질을 쉽고 효율적으로 분리하고 수집하기 위한 자동화 장비의 적용에 대해 설명합니다.
이 백서에서는 전혈에서 무세포 DNA 및 순환 종양 세포와 같은 물질을 쉽고 효율적으로 분리하고 수집하기 위한 자동화 장비의 적용에 대해 설명합니다.
최근에는 암을 비롯한 다양한 질병을 진단하기 위해 액체 생검이 사용되었습니다. 체액에는 정상 조직에서 유래한 세포, 단백질 및 핵산을 포함한 많은 물질이 포함되어 있지만 이러한 물질 중 일부는 질병 부위에서도 유래합니다. 체액에서 이러한 물질의 조사 및 분석은 다양한 질병의 진단에 중추적인 역할을 합니다. 따라서 필요한 물질을 정확하게 분리하는 것이 중요하며,이를 위해 여러 기술이 개발되었습니다.
우리는 CD-PRIME이라는 랩 온 어 디스크 유형의 장치 및 플랫폼을 개발했습니다. 이 장치는 자동화되어 있으며 시료 오염 및 시료 안정성에 대해 우수한 결과를 제공합니다. 또한 우수한 획득 수율, 짧은 작동 시간 및 높은 재현성의 장점이 있습니다. 또한, 장착할 디스크의 종류에 따라, 무세포 DNA를 포함하는 혈장, 순환 종양 세포, 말초 혈액 단핵 세포 또는 버피 코트가 분리될 수 있다. 따라서, 체액에 존재하는 다양한 물질의 획득은 오믹스의 연구를 포함하는 다양한 다운스트림 응용을 위해 수행될 수 있다.
암을 포함한 다양한 질병의 조기에 정확한 발견은 치료 전략 1,2,3,4를 수립하는 데 가장 중요한 요소입니다. 특히, 암의 조기 발견은 환자 5,6,7,8의 생존 기회 증가와 밀접한 관련이 있습니다. 최근에는 암의 조기 발견을 위해 액체 생검이 각광을 받고 있습니다. 고형 종양은 혈관 신생을 겪고 다양한 물질을 혈액으로 방출합니다. 특히, 암 환자의 혈액에서 순환 DNA (ctDNA), 순환 RNA (ctRNA), 단백질, 엑소 좀과 같은 소포 및 순환 종양 세포 (CTC)가 발견되었습니다 2,9. 이러한 물질의 양에는 차이가 있지만 초기 단계뿐만 아니라 후기 단계 6,10
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모든 전혈 샘플은 폐암 환자로부터 수득하였다. 클라이노믹스의 연구 및 분석은 암유전체학연구소에서 수행하며, 정부의 IRB 연구 승인은 서울아산의료원 기관심의위원회(IRB NO. 2021-0802)가 주도하고 있으며, IRB 번호는 클라이노믹스에 등록되어 있습니다.
1. 샘플 준비
2. 장치 준비
3. 장치 작동 및 샘플 수집
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이 기술의 목표는 전혈에서 암 관련 물질을 쉽고 자동으로 분리하는 것입니다. 특히 누구나 모든 적합한 연구 및 분석 분야에서이 기술을 사용할 수 있습니다. 단일 혈액 샘플에서 여러 물질을 동시에 재현 가능하게 분리하는 것은 액체 생검에서 중요합니다. LBx-1 및 LBx-2 디스크는 전혈에서 혈장 및 버피 코트 또는 PBMC를 분리하는 데 사용됩니다. 그림 1 은이 장치의 적용에 의해 분리 된 재료를 보여줍니다. 먼저, 혈장은 LBx-1을 사용하여 10mL의 혈액으로부터 수득하였고 PBMC는 LBx-2를 사용하여 수득하였다. 둘째, 분리된 버피 코트 3mL를 PBS로 FAST-auto에 재주입하고, CTC를 멤브레인을 통해 여과하였다. 셋째, 멤브레인을 저장 완충액으로 채워진 튜브로 옮기거나 즉시 염색에 사용했습니다. 다른 응용 분야 또는 장기 보관의 경우 CTC를 와동하여 멤브레인에서 쉽게 제거할 수 있습니다.
cfDNA는 .......
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cfDNA와 CTC의 양과 농도는 암의 개인, 단계 및 유형에 따라 다릅니다. 또한 환자 2,4,5,10,20의 상태에 따라 다릅니다. 특히 암의 초기 또는 전암기에서는 암 관련 물질의 농도가 매우 낮아 검출이 불가능할 가능성이 높다. 그럼에도 불구하고 조기 발견은 환자의 생존 및 치료 전략 수립에 매우 긍정적 인 영향을 미칩니다. cfDNA와 CTC는 혈액에서 반감기가 짧기 때문에 암21,22,23,24,25<.......
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저자는이 작업과 관련하여 이해 상충이 없습니다.
이 원고는 한국의료기기개발기금(KMDF, 보조금 번호 RS-2020-KD000019)과 한국보건산업진흥원(KHIDI, 보조금 번호. HI19C0521020020)의 일부 지원을 받았다.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1% BSA(소 혈청 알부민) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| 1.5mL 미세 원심분리기 튜브 | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 15mL 원뿔형 튜브 | SPL | 50015 | |
| 4150 TapeStation 시스템 | 애질런트 | G2992AA | 무세포 DNA 스크리닝 테이프(애질런트, 5067-5630), 무세포 DNA 샘플 버퍼(애질런트, 5067-5633) |
| Apostle MiniMax 고효율 Cell-Free DNA 분리 키트 | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 preps 버전 |
| BD Vacutainer 혈액 채취 튜브 | BD | 367525 | EDTA 혈액 채취 튜브 (10 mL) |
| BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview 시스템. Allegro Plus 현미경 기반 맞춤 장비 | |
| CD45 단클론 항체 (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
| FAST 자동 카트리지 | Clinomics | CLX-M3001 | |
| LBx-1 카트리지 | Clinomics | CLX-M4101 | |
| LBx-2 카트리지 | Clinomics | CLX-M4201 | |
| OPR-2000 instrument | Clinomics | CLX-I2001 | |
| 커버 유리 | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
| DynaMag 2 자석 스탠드 | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Ficoll Paque 솔루션 | GE 헬스케어 | 17-1440-03 | 밀도 구배 솔루션 |
| 필터 팁, 10 &마이크로; L | Axygen | AX-TF-10 | 피펫 팁은 교차 오염을 방지하는 데 권장됩니다. |
| 필터 팁, 200 &마이크로; L | Axygen | AX-TF-200 | 에어로졸 장벽이 있는 피펫 팁은 교차 오염을 방지하기 위해 권장됩니다. |
| 필터 팁, 100 &마이크로; L | Axygen | AX-TF-100 | 에어로졸 장벽이 있는 피펫 팁은 교차 오염을 방지하는 데 권장됩니다. |
| 필터 팁, 1000 &마이크로; L | Axygen | AX-TF-1000 | 에어로졸 장벽이 있는 피펫 팁은 교차 오염을 방지하는 데 권장됩니다. |
| FITC anti-human CD326 (EpCAM) 항체 | BioLegend | 324204 | |
| FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin | BD Biosciences | 347653 | |
| 포름알데히드 용액 (H2O 중 35wt.%) | Sigma Aldrich | 433284 | |
| Kimtech Science 와이퍼 | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
| 라텍스 장갑 | Microflex | 63-754 | |
| 마그네틱 비드 분리 랙 | V& P Scientific | VP 772F2M-2 | |
| 수동 피펫팅 (0.5-10 &마이크로; L) | Eppendorf | 3120000020 | |
| 수동 피펫팅 (2-20 &마이크로; L) | Eppendorf | 3120000038 | |
| 수동 피펫팅 (10-100 &마이크로; L) | Eppendorf | 3120000046 | |
| 수동 피펫팅 (20-200 &마이크로; L) | Eppendorf | 3120000054 | |
| 수동 피펫팅 (100-1000 &마이크로; L) | Eppendorf | 3120000062 | |
| Mounting medium with DAPI - 수성, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
| Normal Human IgG Control | R& D Systems | 1-001-A | |
| OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
| Pan Cytokeratin Monoclonal 항체 (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) | Corning | 21-040CVC | |
| Portable Pipet Aid | Drummond | 4-000-201 | |
| Slide Glass | Marienfeld 슈페리어 | HSU-1000612 | |
| StainTray 염색 상자 | Simport | M920 | |
| 멸균 혈청학 피펫 (10 mL) | SPL | 91010 | |
| Triton X-100 솔루션 | Sigma Aldrich | 93443 | |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| 전혈은 | 4-8 °에 저장되었습니다. C EDTA 또는 cfDNA 안정관에 채취 : 9mL 내에 전혈이 부족할 경우 PBS(phosphate buffered saline)를 필요한 만큼 첨가합니다. | ||
| X-Cite 120Q (형광 램프 조명기) | Excelitas | 010-00157 |
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