여기서 우리는 유세포 분석을 사용하여 혈관 내 또는 내피 공간에서의 위치를 기반으로 심근 B- 림프구의 정량화 및 분화를위한 프로토콜을보고합니다.
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이 논문에서
요약
초록
점점 더 많은 증거에 따르면 B- 림프구는 심근 생리학 및 심근 적응의 맥락에서 중요한 역할을합니다. 그러나 문헌은 심근 B 세포의 유병률에 대한 대조적 인 데이터를보고합니다. B 세포는 설치류 심장에서 가장 널리 퍼진 면역 세포 중 하나이거나 존재하는 것으로 보고되었지만 골수 세포보다 유병률이 현저히 낮거나 매우 드문 것으로 보고되었습니다. 유사하게, 몇몇 그룹은 급성 허혈성 심근 손상 후 심근 B 세포의 수가 증가한다고 설명했지만, 한 그룹은 손상된 심근의 B 세포 수에 변화가 없다고보고했다. 심근 B 세포의 유병률을 평가하기 위한 공유되고 재현 가능한 방법의 구현은 다양한 연구 그룹의 관찰을 조화시켜 B 세포 심근 상호 작용 연구의 발전을 촉진하는 데 중요합니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 문헌에보고 된 겉보기에 대조적 인 관찰은 쥐의 심근 B 세포가 대부분 혈관 내피에 연결되어 있고 미세 혈관 내피에 연결되어 있다는 사실에서 비롯된 것 같습니다. 따라서 쥐의 심장에서 회수 된 B 세포의 수는 장기를 청소하는 데 사용되는 관류 조건과 사용 된 소화 방법에 절묘하게 민감합니다. 여기에서는 이 두 가지 중요한 변수를 특정 방식으로 설명하는 최적화된 프로토콜을 보고합니다. 이 프로토콜은 쥐 심근 B 세포 수에 대한 재현 가능한 유세포 분석 기반 분석을 강화하고 연구원이 혈관 외 심근 B 세포와 혈관 내 심근 B 세포를 구별 할 수 있도록합니다.
서론
B-림프구는 적응면역 반응과 선천성 면역 반응 모두에서 중요한 역할을 하는 고도로 전문화된 면역 세포입니다1. B 세포의 두 가지 주요 집단이 있습니다 : 배아 생활 동안 주로 생성되는 B1 세포의 작은 집단과 골수1에서 성인 생활에서 생성되는 B2 세포의 우세한 집단. 골수에서 성숙 한 후 B 세포는 1 차 및 2 차 림프 기관으로 이동합니다. 거기에서 그들은 혈관과 림프관을 통해 이동하는 림프 기관 사이에서 지속적으로 재순환합니다2. B 세포는 수용체로 기능하는 표면에 특정 항체를 발현합니다. B 세포가 수용체에 결합하는 항원을 만나면 활성화 신호가 트리거 될 수 있습니다. 활성화된 B 세포는 항원이 발견된 조직으로 이동하거나 골수로 돌아가 항체 생성 형질 세포로 성숙할 수 있습니다 3,4.
최근에, 심장에는 상당한 수의 B 세포 집단이 있다는 것이 인식되고 있다. 설치류를 대상으로 한 연구에 따르면 B 세포는 배아 발달 초기에 심장에 식민지화되며5, 심근 관련 B ....
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프로토콜
이 원고에 설명 된 모든 실험은 존스 홉킨스 의과 대학의 IACUC의 승인을 받아 수행되었습니다.
1. 준비
- 표 1에 설명된 대로 FACS 버퍼를 준비합니다.
- 동물을 안락사시키기에 충분한CO2 가 있는지 확인하십시오.
- 해부 공간을 준비하십시오 (벤치 패드를 놓고 테이프와 해부 도구를 근처에 두십시오).
- 15mL 튜브에 라벨을 붙이고 각 튜브에 칼슘과 마그네슘이 함유된 HBSS 3mL를 넣고(재료 표 참조) 얼음 위에 놓습니다(심장당 튜브 1개, 참조 그룹/유세포분석 대조군의 경우 추가 튜브 1개). 또한 작은(35mm) 페트리 접시에 HBSS를 채웁니다.
- 온도 제어 셰이커를 켜고 37 ° C로 설정 한 다음 4 ° C의 온도에서 원심 분리기를 사전 냉각합니다.
- 주사기 펌프를 준비하고 유속을 3mL/분으로 설정합니다. 20mL 주사기에 HBSS를 채우고 튜브 라인을 버퍼로 프라이밍한 다음 기포를 제거합니다.
2. 혈관내 B세포 염색(생체 내)<....
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결과
수집이 완료되고 모든 이벤트가 수집되면 표준 유세포분석 관행에 따라 데이터를 분석해야 합니다. 분석의 초점은 각 실험의 개별 목표에 따라 다릅니다. 이 경우 혈관내 및 혈관외 B세포의 정량화를 추구하였으며, 조직 mg당 세포수로 표시하였다.
스펙트럼 세포분석기를 사용하는 경우 초기 게이팅으로 분석을 시작하여 면역 세포에 해당하는 범위에 있지 않은 크기의 파편을 제거한 다음 살아있는 염색+ 신호를 제거하는 것이 좋습니다. 이를 통해 백혈구에 해당하는 CD45 양성 세포의 깨끗한 집단을 검출 할 수 있습니다 (그림 1). 더블릿을 제거한 후 순진한 손상되지 않은 심장에서 CD45+ 세포의 약 20%가 CD19+ B 세포가 될 것으로 예상됩니다(그림 2A, 이 대표적인 실험에서 18.1% B 세포). 이 세포 중 평균 5.5 %는 간질 공간에 위치하고 94.5 %는 혈관 내 공간.......
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토론
점점 더 많은 증거에 따르면 B 세포는 심근 생리학 및 심근 리모델링 / 부상에 대한 적응 7,8,9,10,11,12,13,36의 맥락에서 중요한 역할을합니다. 유세포 분석은 모든 조직의 면역 세포 집단을 연구하는 훌륭한 도구이며 심장의 B 세포에 초점을 맞춘 모든 연구에 거의 필수 도구입니다.
B 세포와 심장에 관한 새로운 문헌은 이미 심장의 B 세포 수와 손상으로 인한 심근 B 세포 수의 변화와 같은 매.......
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공개 사항
Luigi Adamo는 심부전 치료를위한 면역 조절 분자 개발에 중점을 둔 회사 인 i-Cordis, LLC의 공동 설립자이며 B 세포 조절 약물 피르 페니 돈의 유도체에 특별한 관심을 가지고 있습니다. 나머지 작성자는 선언할 충돌이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 Luigi Adamo에게 수여 된 NHLBI 보조금 5K08HLO145108-03 및 1R01HL160716-01의 지원을 받았습니다.
이 연구를 개발하는 데 사용 된 오로라 유세포 분석기는 NIH Grant S10OD026859의 자금 지원을 받았습니다. 우리는 JHU Ross Flow Cytometry Core의 지원을 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 700 안티-마우스/인간 CD11b 항체 | 101222 | BioLegend | 100 µ g 200 &마이크로; L |
| (CellTreat 29481) 세포 여과기, 40 & 마이크로; m, Blue | QBIAP303 | Southern Labware | |
| 0.5 mL 천연 마이크로 원심 분리기 튜브 | 1605-0000 | SealRite, USA Scientific | |
| 0.9 % 염화나트륨 주입, USP | 114-055-101 | 품질 생물학적 | 0.90% |
| 1.5 mL 천연 마이크로 원심 분리기 튜브 | 1615-5500 | SealRite, USA Scientific | |
| 10 µ L 눈금이 매겨진 TipOne 여과기는 | 11213810 | USA Scientific | |
| 1000 µ를 기울였습니다; L 눈금이 매겨진 TipOne 필터 팁 | 11267810 USA Scientific | ||
| 15 mL 원심분리기 튜브, 플러그 씰 캡, 폴리프로필렌, RNase-/DNase-free | 430052 Corning | ||
| 1-Way Stop Valve, 폴리카보네이 | SVPT951 | ECT 제조 | |
| 2,2,2-트리브로모에탄올 | T48402 | Sigma-Aldrich | |
| 200 µ L 눈금이 매겨진 TipOne 필터 팁 | 11208810 USA Scientific | ||
| 3방향 스톱 밸브, 폴리카보네이 | SVPT953 | ECT 제조 | |
| 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브, 12 x 75mm 스타일 | 352054 | Falcon, Corning 브랜드 | |
| 50mL 원심분리기 튜브, 플러그 씰 캡, 폴리프로필렌, RNase-/DNase-free | 430290 | Corning | |
| ACK( Ammonium-Chloride-Potassium) 용해 버퍼 | 118-156-101 | 품질 생물학적 | 삼투압: 290 + 또는 -5% mOsm/kg H20 |
| 어댑터 4x50ml, Rotor A-4-63 5810759005 Eppendorf | |||
| 15 mL 원심분리기 튜브용 어댑터, 어댑터당 튜브 9개, Rotor Model A-4-62 | 22638289 | Eppendorf | |
| 와 함께 사용하기 위한 원뿔형 바닥15개의 둥근 바닥 튜브용 어댑터 2.6 – 7 mL, Rotor A-4-62 | 22638246 | Eppendorf | |
| 알루미늄 호일 12 in x 75' 롤 .0007 | UPC 109153 | Reynolds 랩 | |
| 마취 유도 챔버의 250 | - 마우스 RWD-AICMV-100 | Conduct Science | |
| BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single-use, 1 mL | 309626 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Brandzig 초미세 인슐린 주사기 29G 1cc 1/2" 100팩 | CMD 2613 | Brandzig | |
| Brilliant Violet 421 안티-마우스 CD19 항체 | 115537 | BioLegend | 50 µ |
| 플로우 튜브용 g/mL CAPS w/스트레이너 메쉬 35 &마이크로; m, 12 x 75 mm 튜브용 이중 위치, 멸균 | T9009 | Southern Labware | |
| 이산화탄소 USP E CGA 940 | CD USPE | AirGas USA | |
| Cole-Parmer Essentials 저형 비커, 유리, 500mL | UX-34502-46 | Cole-Parmer | |
| Collagenase 2 | LS004176 | Sigma-Aldrich | |
| 커넥터 황동 크롬 도금 1/4" 암 NPT x 1/4" 미늘 | Y992611-AG | AirGas USA | |
| Cytek Aurora 유세포 분석기 | Cytek Biosciences | ||
| 디스 1080 니플 1/4 바브 CP | M-08-12 | 에어가스 USA | |
| DNase I - 40,000 U | D4527 | 시그마-알드리치 | |
| 이지펫 3 - 전동 피펫 컨트롤러 | 4430000018 | Eppendorf | |
| Electronic Balance, AX223/E | 30100606 | Ohaus Corp. | |
| Eppendorf 5810R 원심분리기 | 5810R | Eppendorf | |
| Eppendorf Research plus, 1채널 가변 피펫, | Eppendorf | ||
| FlowJo 10.8.1 | BD, Becton, Dickinson and Company | ||
| , GLACIERbrand, 삼중 밀도 아이스 팬(IPAN-3100) | Z740287 | Heathrow Scientific | |
| HBSS(1x) - Ca2+ [+], Mg2+ [+] | 14025076 | gibco | 1x |
| Hyaluronidase | H3506 | Sigma-Aldrich | |
| Kelly 지혈제, 스트레이트 | 13018-14 | 파인 사이언스 도구 | |
| 루어 슬립 주사기 멸균, 일회용, 20 mL | 302831 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940 | M1-940-PG | AirGas USA | |
| McKesson 언더패드, 보통 | 4033- CS150 | McKesson | |
| 네비게이터 다목적 휴대용 저울 | NV2201 | 오하우스 공사 | |
| PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-] | 10010023 | gibco | 1x |
| PE 안티-마우스/인간 CD45R/B220 항체 | 103208 BioLegend | 200 µ g/mL | |
| PerCP/Cyanine5.5 안티-마우스 CD45 항체 | 103132 | BioLegend | 100 µ g 500 uL |
| 페트리 접시, 쌓을 수 있는 35mm x 10mm 멸균 폴리스티렌 | FB0875711YZ | Fisher Scientific | |
| Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02 | M08-1 | AirGas USA | |
| 강력한 6와트 LED 듀얼 구즈넥 일루미네이터 | LED-6W | AmScope | |
| PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm) | 305122 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| 정제된 쥐 안티 마우스 CD16/CD32 (마우스 BD Fc 블록) 클론 2.4G2 (RUO) | 553141 | BD Becton, Dickinson and Company Biosciences | 0.5 mg/mL |
| R 4.1.1 | The R Foundation | ||
| Razor Blades | 9501250000 | Accutec Blades Inc | |
| 레귤레이터 분석 2단계 0-25 psi 전달 CGA320 3500 psi 주입구 | Y12244A320-AG | AirGas USA | |
| Rotor A-4-62, 4 x 250 mL 직사각형 버켓 포함 | Rotor A-4-62 | Eppendorf | |
| Serological pipette, 플러그형, 10 mL, sterile, 비발열성/내독소 무함유, 비세포독성, 1개/블리스터 | 86.1254.001 | Sarstedt AG & Co KG | |
| 시그마 라벨 테이프 | L8394 | 시그마-알드리치 | |
| 스펙트로플로 3.0.0 | Cytek Biosciences | ||
| Spex VapLock 루어 피팅, PP, 스트레이트, 남성 루어 락 x 1/8" 호스 바브; 1/EA | MTLL230-6005 | Spex | |
| Std 벽 실험실 튜빙, 크기 S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" 벽 x 50' 길이 | CG-730-003 | Excelon 연구소 | |
| 주사기 PP/PE without needle, 3 mL | Z683566 | Millipore Sigma | |
| 주사기 펌프 | 55-1199 (95-240) | Harvard Apparatus | |
| Thomas 3-채널 알람 타이머 TM10500 | 9371W13 | Thomas Scientific | |
| Tube Rack, 12 위치, 6 대 5.0 mL 및 15 mL 튜브 및 6 개 25 mL 및 50 mL 튜브, 폴리프로필렌, 번호가 매겨진 위치, 오토클레이브 30119835 | Eppendorf | ||
| Tube Rack, 12 위치, 5.0 mL 및 15 mL 튜브, 폴리프로필렌, 번호가 매겨진 위치, 오토클레이브 가능 | 30119827 | Eppendorf | |
| TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in. | T8913 (Millipore Sigma) | Tygon, Saint-Gobain | |
| Vortex-Genie 2 | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. | |
| VWR 곡선 팁이 있는 가이드 핀이 있는 해부 집게 | 89259-946 | Avantor, VWR | |
| VWR 해부 가위, 날카로운 팁, 4½ " | 82027-578 | Avantor, by VWR | |
| VWR Incubating Orbital Shaker, 모델 3500I | 12620-946 | Avantor, by VWR | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | 423102 | BioLegend |
참고문헌
- Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease. Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).
- Gowans, J. L., Knight, E. J. The route of re-circulation of lymphocytes in....
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