Method Article

small extracellular vesicle의 High-throughput Isolation and Purification (고처리량 분리 및 정제를 위한 유세포 분석 분류 파라미터 최적화)

DOI:

10.3791/64360

⸱

January 20th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Central Laboratory of Women’s Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2School of Medical Technology and Information Engineering, Zhejiang Chinese Medical University, 3Core Facilities, Zhejiang University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 공기 분무 노즐의 크기, 시스 유체 압력, 샘플 흐름 압력, 전압, 이득 및 트리거링 임계값 매개변수를 최적화하여 작은 세포외 소포에 대한 신속하고 크기별 분리 방법을 제공합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

작은 세포외 소포(sEV)는 모든 세포 유형에서 방출될 수 있으며 단백질, DNA 및 RNA를 운반할 수 있습니다. 신호 분자는 세포의 생리적 및 병리학적 상태를 나타내는 지표 역할을 합니다. 그러나 다운스트림 바이오마커 식별 및 약물 개입 연구를 방해하는 sEV 분리를 위한 표준 방법은 없습니다. 이 기사에서는 플로우 셀 분류기에 의한 50-200nm sEV의 분리 및 정제를 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이를 위해 50μm 노즐과 80psi 시스 유체 압력을 선택하여 우수한 분류 속도와 안정적인 측류를 얻었습니다. 표준 크기의 폴리스티렌 미소 구체는 100, 200 및 300 nm 입자의 집단을 찾는 데 사용되었습니다. 전압, 이득 및 순방향 산란(FSC) 트리거 임계값을 추가로 최적화하면 sEV 신호를 배경 잡음과 분리할 수 있습니다. 이러한 최적화는 FSC 대 측면 산란(SSC)만 사용하여 sEV의 대표 모집단을 얻을 수 있는 중요한 정렬 설정 패널을 제공합니다. 유세포 분석 기반 분리 방법은 고처리량 분석을 가능하게 할 뿐만 아니라 바이오마커 발현을 기반으로 sEV의 동기식 분류 또는 프로테옴 분석을 가능하게 하여 수많은 다운스트림 연구 응용 분야를 열어줍니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포는 다양한 크기의 세포외 소포체(EV)를 방출하여 세포간 통신에 중요한 신호 분자와 막 내포물을 생성합니다1. 다양한 크기의 EV는 또한 50-200nm sEV가 RNA, DNA 및 단백질을 올바른 세포외 위치에 정확하게 분배할 수 있는 다양한 생물학적 역할을 합니다. sEV는 또한 면역 감시, 줄기 세포 유지, 혈액 응고 및 조직 복구와 같은 정상적인 생리적 과정의 조절뿐만 아니라 종양 진행 및 전이와 같은 여러 질병의 기저에 있는 병리를 포함하는 분비 메커니즘을 결정하는 데 도움이 됩니다 2,3. sEV의 효과적인 분리 및 분석은 바이오마커를 식별하고 향후 약물 개입을 설계하는 데 중요합니다.

sEV의 임상 적용에 대한 지속적인 연구로 sEV의 격리 방법은 더 높은 요구 사항을 제시했습니다. 크기, 출처 및 함량이 sEV의 이질성과 물리화학적 및 생화학적 특성에서 다른 EV와의 유사성으로 인해 sEV 분리를 위한 표준 방법이 없습니다 4,5. 현재, 초원심분리, 크기 배제 크로마토그래피....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 세포 배양

  1. 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)의 배양 배지를 준비합니다. 인간 췌장암 세포인 PANC-1을 75cm2 배양 플라스크에서 1 x 106 cells/mL의 밀도로 배양합니다. 배양물을 5%CO2와 함께 37°C에서 배양한다.
  2. 세포 밀도가 현미경 관찰에서 75%-80%에 도달할 때 세포를 계대 배양합니다. 배지를 제거하고, 3-5 mL의 인산염 완충 식염수(PBS; 0.01 M, pH 7.2-7.4)로 2x 헹굽니다.
  3. 용액을 버리고 1-2mL의 트립신-EDTA 용액을 추가하고 현미경으로 배지에 둥글게 될 때까지 세포가 분리되도록 합니다. 신선한 배지를 추가하고, 흡인하고, 15 mL 배양 배지와 함께 75cm2 배양 플라스크에 분산시킨다. 1:2에서 1:4의 하위 재배 비율을 사용합니다(권장).
    알림: 모든 작업은 세포 오염을 방지하기 위해 생물 안전 캐비닛에서 수행됩니다.

2. 배양 배지 수집

  1. 세포를 5%CO2....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

실험 프로토콜의 순서도는 그림 1에 나와 있습니다. 이 방법에서는 표준 크기의 폴리스티렌 미소 구체가 입자 크기 분포에 대한 참조 표준으로 사용되었습니다. 특정 기기 매개변수 조건에서 입자 신호는 로그 형식을 사용하여 FSC 대 SSC 플롯의 배경 잡음과 명확하게 구별될 수 있습니다. 게이팅 전략은 그림 2에 나와 있습니다. R4, R5 및 R6은 각각 100nm, 200nm 및 300nm 미소 구체의 위치를 나타냅니다. R7은 50nm 미만의 전자 노이즈 감지 한계이고 R8은 50-200nm 입자의 위치 범위입니다.

PANC-1 세포로부터 유래된 EVs 혼합물의 입자 크기 분포는 초원심분리 후 40-400 nm의 넓은 범위로 나타났다(도 3). 50-200 nm sEV를 분리하고 정제하기 위해, 표준 마이크로스피어의 위.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 NTA에서 검증한 플로우 셀 분류기를 사용하여 지정된 입자 크기 50-200nm로 sEV를 분리하고 정제하는 최적화된 방법을 설명합니다. 이 방법은 균일한 입자 크기와 고순도의 sEV를 얻는 병목 문제를 해결하여 대형 EV에 싸인 관련 없는 생물학적 분자의 간섭을 피했습니다(22). 초당 100,000개의 입자를 포획하고 초당 70,000개의 분류 결정을 내릴 수 있는 유세포 분석을 통해 빠르고 높은 처리량의 분석이 가능하여17 시간을 크게 단축하고 sEV 입자의 이질성을 반영할 수 있습니다. 또한, 이 유세포 분석 기반 프로토콜은 특정 크기의 EV 하위 집단에 대한 개별 관심사에 따라 맞춤화할 수 있습니다. 대체 게이트 범위를 사용하여 공기 분무 노즐, 시스 유체 압력, 시료 흐름 압력 및 트리거 임계값 매개변수와 같이 위와 동일한 기기 파라미터를 설정하여 관심 모집단을 식별하고 분리할 수 있습니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 절강 중의과 대학 과학 연구 기금 (2020ZG29), 절강 성 기본 공공 복지 연구 프로젝트 (LGF19H150006, LTGY23B070001), 절강 성 교육부 프로젝트 (Y202147028) 및 절강 대학 실험실 부서의 실험 기술 프로젝트 (SJS201712, SYB202130).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
원심분리기 튜브Beckman Coulter344058
문화 플라스크Corning 
둘베코' s modified eagle mediumCorning Cellgro10-013-CV
소 태아 혈청SUERSUER050QY
플로우 셀 분류기Beckman CoulterMoflo Astrios EQ
인간 췌장암 세포, PANC-1NANAPANC-1 세포는 Zhejiang University 생명 과학 대학의 Weijun Yang 교수에 의해 기증되었습니다
입자 크기 및 제타 전위 분석기 MalvernZetasizer Nano ZS 90
인산염 완충액 식염수GibcoC20012500BT
폴리스티렌 형광 마이크로스피어Beckman Coulter6602336
투과 전자 현미경 JEOLJEM-1200EX
트립신-EDTA 용액Gibco1713949
울트라 레인보우 형광 입자벡크만 쿨터B28479
울트라 원심분리기벡크만 쿨터Optima-L80XP
초원심 분리기 로터벡크 맨 쿨터SW32TI
430641. 레이저

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. Meldolesi, J. Exosomes and ectosomes in intercellular communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
    3. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Small Extracellular VesiclesFlow CytometryVesicle IsolationVesicle PurificationCytometric SortingNanoparticle TrackingWestern BlotPolystyrene MicrospheresForward ScatterSide Scatter

Related Articles