Method Article

Caenorhabditis elegans 생식계열 내 시냅톤 복합체의 초고해상도 현미경

DOI:

10.3791/64363

⸱

September 13th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Cell Biology and Biophysics, European Molecular Biology Laboratory, 2Collaboration for joint PhD degree between EMBL and Heidelberg University, Faculty of Biosciences, 3EMBL Imaging Centre, European Molecular Biology Laboratory

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

초고해상도 현미경은 감수 분열의 시냅톤 복합체 내 구성 요소 구성에 대한 자세한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기에서는 Caenorhabditis elegans synaptonemal 복합체의 개별 단백질을 해결하기위한 프로토콜을 보여줍니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

감수 분열 동안, 상동 염색체는 올바른 분리를 허용하기 위해 서로를 인식하고 부착해야합니다. 상동 염색체의 상호 작용을 확보하는 주요 사건 중 하나는 감수 분열 전상 I에서 시냅톤 복합체 (SC)의 조립입니다. 다른 종들 사이에서 SC 내의 단백질 성분들 사이에 서열 상동성이 거의 없지만, SC의 일반적인 구조는 진화 동안 고도로 보존되어 왔다. 전자 현미경 사진에서 SC는 측면 요소 또는 축, 가로 필라멘트 및 중심 요소로 구성된 삼자 사다리 모양의 구조로 나타납니다.

그러나 SC의 분자 구조를 결정하기 위해 전자 현미경으로 복합체 내 개별 성분의 위치를 정확하게 식별하는 것은 여전히 어려운 일입니다. 대조적으로, 형광 현미경은 복합체 내의 개별 단백질 성분을 식별할 수 있게 해줍니다. 그러나 SC의 폭이 ~100nm에 불과하기 때문에 회절이 제한된 기존의 형광 현미경으로 하부 구조를 해결할 수 없습니다. 따라서 SC의 분자 구조를 결정하려면 구조화 조명 현미경(SIM), 유도 방출 고갈(STED) 현미경 또는 단일 분자 국소화 현미경(SMLM)과 같은 초고해상도 광학 현미경 기술이 필요합니다.

SC 내에서 개별 구성 요소의 구조와 상호 작용을 유지하려면 생식 세포의 고유 환경에 가까운 환경에서 복합체를 관찰하는 것이 중요합니다. 따라서 우리는 SMLM 및 STED 현미경으로 손상되지 않은 압출 Caenorhabditis elegans 생식선 조직에서 SC의 하부 구조를 연구할 수 있는 면역조직화학 및 이미징 프로토콜을 입증합니다. 조직을 커버슬립에 직접 고정하면 이미징 중 샘플의 움직임을 줄이고 샘플의 수차를 최소화하여 생물학적 맥락에서 SC의 하부 구조를 시각화하는 데 필요한 고해상도를 얻을 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

감수 분열 동안 염색체 수를 절반으로 줄이는 것은 성적으로 번식하는 유기체에서 건강한 자손을 생성하는 데 중요합니다. 염색체 수의 이러한 감소를 달성하기 위해, 상동 염색체는 감수 분열 I 동안 쌍을 이루고 분리되어야합니다. 상동 염색체의 정확한 분리를 보장하기 위해 생식 세포는 확장된 prophase I을 거치며, 이 기간 동안 상동 염색체가 쌍, 시냅스 및 재결합하여 상동체1 사이의 물리적 연결을 생성합니다. SC는 감수 분열2 단계를 통해 올바른 진행을 조절하는 핵심 구조로 부상했습니다.

SC는 단백질 구성 요소 사이에 상동성이 거의 없음에도 불구하고 일반적인 구조가 진화적으로 보존되는 복합체입니다. SC는 전자 현미경 사진에서 두 개의 측면 요소 또는 축, 가로 필라멘트로 형성된 중앙 영역 및 중심 요소 3,4로 구성된 삼자 사다리 모양의 구조로 처음 확인되었습니다. 복합체 내에서 개별 구성 요소의 구성을 결정하는 것은 감수 분열 단계에서 SC의 역할에 대한 이해를 높이는 데 중요합니다.

모델 유기체 C. elegans는 생식선이 완전히 조립된 SC5를 가진 많은 수의 감수 분열 핵을 포함하고 있기 때문에 SC의 구조와 기능을 연구하는 데 이상적입니다. 유전 및 생화학 적 연구에 따르면 염색체 축은 C. elegans에서 HTP-1 / 2 / 3 및 HIM-3 7,8,9,10,11이라고하는 3 개의 별개의 코헤신 복합체 6,7과 4 개의 HORMA 도메인 단백질에 의해 형성됩니다. SC의 중앙 영역에서, 코일 코일 도메인을 함유하는 6 개의 단백질이 현재까지 12,13,14,15,16,17로 확인되었다. 두 축 사이의 거리를 연결하기 위해 SYP-1, -5 및 -6은 일대일 방식으로 이량 체화되는 반면 (그림 1), 세 개의 추가 단백질은 중심 요소16,17,18,19에서 상호 작용을 안정화시킵니다.

이러한 단백질의 조직에 대한 자세한 통찰력을 얻는 것은 감수 분열 동안 SC의 많은 기능을 이해하는 데 필수적입니다. SC의 중심 영역의 폭이 ~ 100 nm에 불과하기 때문에 회절 제한 형광 현미경으로 하부 구조를 분해 할 수 없습니다. 그러나 이 크기의 구조 내에서 구성 요소를 시각화하는 것은 초고해상도 현미경으로 쉽게 달성할 수 있습니다. 실제로, 구조화 조명 현미경 (SIM), 확장 현미경 (20), 자극 방출 고갈 (STED) 현미경 (21) 및 단일 분자 국소화 현미경 (SMLM) 22,23은 종 16,24,25,26,27,28,29에 걸쳐 SC의 분자 구조를 연구하는 데 필수적인 도구로 부상했습니다. 30.

분해능 한계를 극복하기 위해 STED 현미경은 방출광의 회절 제한 스폿을 STED 레이저의 도넛 모양 빔과 오버레이하는 데 의존하며, 이는 이론적으로 점 확산 기능을 분자 치수31,32까지 제한합니다. 그러나, 생물학적 샘플 내에서 STED에 의해 실질적으로 달성 가능한 분해능은 xy33에서 수십 나노미터의 범위로 유지된다.

SMLM 기술로 생물학적 샘플에서 더 높은 분해능을 얻을 수 있습니다. SMLM은 특정 형광단의 깜박임 특성을 활용하여 공간적으로 겹치는 형광단을 시간에 분리하여 하위 회절 수준에서 물체를 해결합니다. 그런 다음 샘플을 반복적으로 이미지화하여 형광단의 다양한 하위 집합을 캡처합니다. 그런 다음 샘플 내 형광단의 위치는 모든 이미지에서 얻은 신호에 점 확산 함수(PSF)를 피팅하여 결정되며, 이는 15nm23,34까지 구조를 분해할 수 있습니다.

종합하면, 국부적 인 이미지는 모든 형광단의 위치를 인코딩합니다. SMLM의 분해능은 형광단의 표지 밀도 및 깜박임 특성에 의해 결정됩니다. Nyquist-Shannon 기준에 따르면 평균 레이블 간 거리의 두 배 미만인 물체를 안정적으로 해결하는 것은 불가능합니다. 따라서 고해상도 이미징을 위해서는 높은 라벨링 밀도가 필요합니다. C. elegans의 SC의 경우, 게놈 편집을 사용하여 내인성 단백질의 특정 부위에 부착 된 에피토프 태그를 사용하여 높은 표지 밀도를 달성 할 수 있습니다. 이어서, 에피토프 태그는 높은 친화도19,30을 갖는 특이적 모노클로날 항체를 사용하여 고밀도로 염색될 수 있다. 동시에, 개별 형광단의 온-사이클은 공간적으로 중첩되는 형광단이 동시에 포집되지 않도록 충분히 짧아야 한다(35).

이 두 가지 요구 사항으로 인해 SC와 같은 큰 거대분자 복합체의 구조를 해결하려면 충분히 많은 수의 이미지를 이미징해야 하므로 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. 긴 이미징 시간의 함정은 샘플이 스테이지의 이동 또는 샘플 버퍼 내의 작은 전류로 인해 드리프트되는 경향이 있다는 것입니다. 10nm 정도의 작은 움직임도 nm 분해능에서는 해롭기 때문에 이를 수정해야 합니다. 그러나, 일반적으로 사용되는 드리프트 보정 방법들은 순차적으로 이미징된 2개의 채널의 이미지들을 정확하게 오버레이할 만큼 충분히 견고하지 않다(36). 생물학적 질문은 종종 동일한 샘플 내에서 여러 표적의 정확한 검출 및 위치를 요구하기 때문에 문제가됩니다. 이러한 문제를 피하기 위해 비율 측정 이미징과 같은 방법이 개발되었습니다. 비율계량 이미징은 중첩된 여기 및 방출 스펙트럼을 갖는 다수의 형광단의 동시 이미징을 허용하며, 스펙트럼적으로 구별되는 채널(37,38)에서의 강도의 비율에 기초하여 각각의 검출된 신호의 후속 할당을 각각의 형광단에 할당한다.

또한 SC와 같은 거대 분자 복합체의 조직을 연구하려면 3차원(3D) 정보가 필요합니다. 3차원(3D-SMLM)에서 초고해상도를 달성하기 위해 초점면으로부터의 거리에 따라 형광단의 PSF 모양을 왜곡하는 방출된 빛의 광학 경로에 원통형 렌즈가 통합되어 있습니다. 따라서, z-평면에서 형광단의 정확한 위치는 방출 신호(35, 39)의 형상을 분석함으로써 외삽될 수 있다. SMLM에서 이러한 발전을 결합하면 SC를 포함한 거대분자 복합체의 3D 조직을 이미징할 수 있습니다.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 용액 및 커버슬립 준비

알림: 모든 재료 및 시약과 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하고 이 프로토콜에 사용되는 용액 구성에 대해서는 표 1 을 참조하십시오.

  1. 폴리-L-라이신 코팅 커버슬립
    1. 0.01 % (w / v) 폴리 -L- 라이신을 준비하십시오 ( 표 1 참조).
    2. 정밀 커버 슬립 (직경 24mm, 0.17 ± 0.005mm, 1.5 번)을 에탄올에 10-30 분 동안 씻으십시오. 커버 슬립을 ddH2O로 헹구어 에탄올을 제거하고 커버 슬립을 실온에서 건조시킵니다.
    3. 플라즈마 클리너를 사용하여 커버 슬립을 청소하십시오.
      알림: 플라즈마 청소는 커버슬립의 친수성을 증가시키고 다음 단계를 용이하게 합니다. 플라즈마 클리너를 사용할 수 없는 경우 이 단계를 건너뛸 수 있지만 폴리-L-라이신 용액의 부피 및/또는 농도를 조정해야 할 수 있습니다. 이 수정은 테스트되지 않았습니다.
    4. 커버 슬립에 0.01 % (w / v) 폴리 -L- 라이신 한 방울 (120 μL)을 놓습니다. 실온에서 10분 동안 배양합니다.
    5. 배양 후, 커버슬립을ddH2O로 헹구고 실온에서 건조시킨다. 4 ° C에서 최대 1 개월까지 보관하십시오.
  2. 형광 유기 염료와 접합된 F(ab')2 단편
    1. PCR 튜브에 다음 순서로 추가합니다 : PBS의 0.6-0.7 mg / mL F (ab') 2 단편 10 μL, DMSO 중 0.1 M NaHCO 3 (pH8.3 ) 1 μL 및 DMSO 중 1 mM 숙신이미 딜 (NHS) 에스테르 반응성 형광단 1 μL (F (ab ') 2 : 염료의 몰비는 ~ 1 : 17). 위아래로 피펫팅하여 잘 섞는다.
    2. 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오.
    3. 제조업체의 사양에 따라 탈염 컬럼(7K MWCO)을 사용하여 나머지 자유 반응성 염료에서 F(ab')2 단편을 분리합니다. 컬럼의 평형화와 표지된 F(ab')2 단편의 용리를 위해 1x PBS를 사용합니다.
    4. 표지된 F(ab')2 단편을 4°C에서 최대 3개월 동안 보관하십시오.
      알림: 3개월 이상의 보관 시간은 테스트되지 않았습니다.

2. 해부 및 고정

참고: 해부 및 고정 절차는 초고해상도 현미경을 위한 최적의 샘플을 얻기 위해 이전에 권장된 절차16,40에서 수정됩니다.

  1. 해부
    1. 연령이 일치하는 C. elegans 벌레(이 연구를 위해 20°C에서 성장)를 커버 슬립(22mm x 22mm, 1번)에 EBTT(1x 계란 버퍼41 , 0.2% 비이온성 세제가 포함된 표 1)에 30μL 떨어뜨립니다. 쉽게 조작할 수 있도록 커버 슬립을 유리 슬라이드에 놓습니다. 30 μL의 EBTT로 여러 번 위아래로 피펫팅하여 세척합니다. 30μL의 용액을 제거하여 커버 슬립에 30μL 방울을 남깁니다.
      알림: 웜이 플라스틱 팁에 달라붙는 것을 방지하기 위해 웜이 피펫팅된 모든 용액에 소량의 비이온성 세제를 추가해야 합니다.
    2. 메스 블레이드를 사용하여 벌레의 머리 및/또는 꼬리를 잘라 생식선을 돌출시킵니다(그림 2A).
  2. 고정
    1. 30 μL의 고정액(표 1)을 해부된 벌레의 방울에 넣고 피펫을 위아래로 혼합하여 피펫하였다.
      알림: 위아래로 몇 번 피펫팅하면 더 많은 생식선을 방출하는 데 도움이 될 수 있습니다.
    2. 정착액을 추가한 후 정확히 1분 동안 고정합니다.
    3. TBST로 채워진 PCR 튜브로 웜을 옮겨 고정을 중지하십시오 (표 1). 가능한 한 적은 부피 (~ 15 μL)로 웜을 옮깁니다.
    4. 미니 벤치탑 원심분리기(2,000× g, 10초)에서 PCR 튜브를 회전시킵니다. 상청액을 제거하고 각각 200 μL의 TBST로 2x 세척한다.
    5. 200μL의 PBST(표 1)로 5-10분 동안 세척합니다. 해부된 샘플을 얼음 위에 유지하면서 최대 4개의 샘플에 대해 2.1.1-2.2.5단계를 반복합니다.
      알림: 4개 이상의 샘플을 처리하는 경우 4개 샘플마다 2.2.6-2.2.7단계를 진행하여 모든 샘플에서 샘플 고정이 일관되게 유지되도록 합니다.
    6. 해부된 샘플을 미니 벤치탑 원심분리기(2,000×g, 10초)에서 회전시키고, PBST를 제거 하고, 50-100μL의 차가운 메탄올(-20°C)을 첨가한다.
      주의 : 메탄올은 독성이 있습니다. 보호 장비를 착용하고 흡입을 피하십시오.
    7. 위아래로 피펫팅하여 혼합하고 샘플을 메탄올에 30-60초 동안 그대로 두십시오. 샘플을 200 μL의 PBST에서 2x 세척한다.
      알림: 4개 이상의 샘플을 처리하는 경우 나머지 샘플의 해부를 진행합니다(2.1.1 - 2.2.7단계).
    8. 샘플을 200 μL의 PBST로 세 번째로 세척한다.

3. 항체 배양

  1. 블로킹
    1. 실온에서 45-60분 동안 1x 블로킹 용액(표 1)에서 샘플을 차단합니다.
      참고: 배양 시간은 실온에서 30분에서 4°C에서 며칠까지 다양합니다(테스트는 최대 3일까지 수행됨).
  2. 1차 항체 용액
    1. 항-HTP-3(치킨42) 및 항-HA(마우스) 항체(또는 선택한 항체)를 작업 용액(SMLM의 경우 1:250, STED 현미경 샘플의 경우 1:1,000)으로 희석합니다.
      참고: SMLM 현미경 검사에는 더 높은 라벨링 밀도가 권장되기 때문에 SMLM 샘플에 라벨링하는 데 사용되는 항체는 STED 샘플보다 더 농축되어 있습니다.
    2. 미니 벤치탑 원심분리기(2,000× g, 10초)에서 샘플을 돌리고 블로킹 버퍼를 제거한 다음 30-50μL의 1차 항체 용액을 추가합니다. 4°C(권장)에서 밤새 배양하거나 실온에서 1-2시간 동안 배양합니다.
    3. 배양 후, PBST로 3 x 5-15 분 세척한다.
  3. 형광 염료에 접합된 F(ab')2 단편의 작업 용액
    1. 라벨이 부착된 F(ab')2 단편(단계 1.2.4)을 1x 블로킹 용액의 작업 용액(SMLM의 경우 1:100, STED 현미경 샘플의 경우 1:1,000)으로 희석합니다.
      참고: 두 초고해상도 기술 모두에 대해 이전에 보고된 형광단 쌍, 즉 SMLM용 AlexaFluor647/CF680 및 STED용 AlexaFluor594/Abberior STAR635P가 사용되었습니다. AlexaFluor647 및 STAR645P는 SYP-5의 C-말단을 표적으로 하는 항마우스(Fab')2 단편을 표지하는 데 사용되었으며, HTP-3을 표적으로 하기 위해 CF680/AlexaFluor594-표지된 항닭(Fab')2 단편을 표지하는 데 사용되었습니다.
    2. 미니 벤치탑 원심분리기(2,000× g, 10초)에서 샘플을 스핀하고 PBST를 제거한 다음 30-50μL의 2차 항체 용액을 추가합니다. 실온(권장)에서 30분 내지 2시간 동안 배양하거나 4°C에서 밤새 배양합니다. PBST로 3 x 5-15 분 세척하십시오.

4. 커버 슬립에 샘플 장착

  1. 포스트 고정
    참고: 4.1.1-4.2.1단계를 통해 샘플을 개별적으로 처리합니다.
    1. 염색된 샘플을 스핀다운하고 상청액을 제거합니다. 50μL의 PBST0.2 를 추가하고 염색된 웜을 22mm x 22mm No. 1 커버슬립에 옮깁니다.
      알림: 웜이 커버슬립에 달라붙는 것을 방지하기 위해 이 단계에서는 0.2% 비이온성 세제(표 1)와 함께 새 PBST0.2를 사용하십시오.
    2. 5.7-6.3 μL의 고정 후 용액을 폴리 -L- 라이신 커버 슬립에 피펫합니다.
      알림: 4°C에서 보관된 Poly-L-라이신 커버슬립은 먼저 실온으로 가져와야 합니다.
    3. 해부된 웜을 동일한 부피(5.7-6.3 μL)로 피펫팅하고 폴리-L-라이신 커버슬립의 고정제 방울로 옮깁니다(그림 2B).
      알림: 이 단계와 다음 단계에서는 폴리-L-라이신 코팅 커버슬립의 중앙에 해부된 조직을 유지하는 것이 매우 중요합니다. 이는 여기에 사용된 맞춤형 SMLM 현미경에 맞게 맞춤형 홀더에 샘플을 장착하는 경우 특히 중요합니다( 그림 2B의 5.1단계 참조).
    4. 샘플을 작은 커버슬립(직경 12mm, 그림 2B)으로 덮습니다. 작은 여과지를 사용하여 과도한 액체를 제거합니다(그림 2B). 어두운 방에서 3-5 분 동안 고정하십시오.
  2. "동결 크래킹"
    1. 샘플을 드라이 아이스의 알루미늄 블록에 올려 동결시킵니다 (그림 2B).
      알림: 알루미늄 블록은 샘플을 놓기 전에 드라이 아이스에서 잘 냉각되어야합니다. 나머지 샘플의 사후 고정을 진행합니다(단계 4.1.1 - 4.2.1). 샘플은 다음 단계(4.2.2) 전에 최소 20분 또는 최대 1시간 동안 드라이아이스 위에 있어야 합니다.
    2. 면도기를 사용하여 더 작은 커버슬립을 제거합니다(그림 2B).
      참고: STED의 경우 5.2.1단계로 진행합니다. SMLM의 경우 4.2.3단계에서 계속하십시오.
    3. 커버슬립을 얼음처럼 차가운 PBS(권장) 또는 -20°C 메탄올이 포함된 50mL 원뿔형 튜브에 약 10초 동안 담그십시오.
      알림: 온도는 이 단계에서 매우 중요한 요소입니다. 따라서 갓 해동하거나 얼음/에탄올 욕조에 보관한 PBS를 사용하십시오.
    4. 커버슬립을 PBST 버퍼로 채워진 6웰 플레이트의 웰에 넣습니다. 웰에서 PBST를 제거하고 새로운 PBS를 추가합니다. 샘플을 PBS에 5분 동안 그대로 둡니다.
      알림: 샘플이 손상되거나 분리되지 않도록 PBS를 웰 측면에 피펫하십시오.
    5. 신선한 PBS로 세척하고 이미징 될 때까지 샘플을 4 ° C에 두십시오.
      참고: 샘플은 최대 2주 동안 안정적이지만 샘플을 2일 이내에 이미지화하면 최상의 결과를 얻을 수 있습니다.
    6. 이미징하기 전에 실체 현미경으로 샘플 장착의 품질을 평가하십시오.
      알림: 성공적으로 장착된 생식선은 커버슬립에 대해 식별할 수 있는 움직임 없이 안정적으로 부착됩니다. 제대로 부착되지 않은 생식선은 완충 용액에서 펄럭입니다.

5. 이미징

  1. 단일 분자 국소화 현미경
    참고: 이미지는 EMBL 이미징 센터에서 이전에 보고된 바와 같이 맞춤형 본체 주위에 구성된 맞춤형 단일 분자 국소화 현미경을 사용하여 획득되었습니다.38,43에 지정된 고유한 기능을 사용하여 재료 표; https://www.embl.org/about/info/imaging-centre 참조
    1. 3D 비드 보정 획득
      1. 앞서 설명한 대로 접착성 100nm 형광 비드를 사용하여 정밀 커버슬립(직경 24mm, 0.17 ± 0.005mm, No. 1.5)을 준비합니다.
      2. 5.1.1.1단계의 교정 샘플을 샘플 홀더에 놓습니다.
      3. 깨끗한 100x/1.5 오일 대물렌즈에 액침 오일 한 방울을 추가하고 보정 샘플을 현미경에 장착합니다.
      4. MicroManager 2 45,46 내에서 교정 샘플에서15-20개 위치를 지정합니다.
      5. EMU 플러그인 윈도우(47) 내에서, 단계 5.1.1.5로부터의 각각의 포지션에 대한 z-스택 이미지의 획득을 셋업한다.
        참고: 여기에서 복합 원통형 렌즈는 3D 이미징에 필요한 난시를 제공하며 -1μm에서 1μm 사이의 범위에 걸쳐 각 위치에 대해 201개의 z 슬라이스를 10nm 단위로 획득했습니다. 각 z-슬라이스에 대해 25ms 동안 2kW/cm2 640nm 레이저 조명을 사용했습니다.
      6. 5.1.11단계에서 샘플 이미지를 획득하는 데 사용할 동일한 광학 경로를 통해 100nm 형광 비드의 z-스택 이미지를 획득합니다.
      7. 초고해상도 현미경 분석 플랫폼(SMAP48)을 사용하여 5.1.13단계에서 3D-SMLM 데이터를 피팅하는 데 사용할 실험점 확산 함수(PSF)의 cspline 모델을 생성합니다.
    2. 샘플 홀더를 준비합니다. 여기에 사용된 맞춤형 홀더의 경우 마그네틱 링을 사용하여 이미징 챔버를 만듭니다(그림 2B), 마그네틱 링을 파라필름으로 감싸십시오.
      참고: 또는 오목한 함몰 캐비티가 있는 현미경 슬라이드를 사용하여 슬라이드 홀더가 있는 현미경용 샘플을 장착할 수 있습니다.
    3. 1mL의 이미징 버퍼44 를 준비합니다(표 1).
    4. 4.2.6단계에서 커버슬립 하나를 꺼내 맞춤형 홀더에 넣습니다. 파라필름으로 감싼 마그네틱 링으로 홀더에 커버슬립을 고정합니다(5.1.2단계).
    5. 샘플 상단의 자기 링에 의해 생성된 챔버에서 이미징 버퍼(단계 5.1.3)를 부드럽게 파이펫합니다(그림 2B). 파라 필름 조각으로 챔버를 밀봉하십시오.
    6. 샘플을 장착하려면 깨끗한 100x/1.5 오일 대물렌즈에 이멀젼 오일 한 방울을 추가합니다. 이멀젼 오일에 공기를 넣지 않고 장착된 샘플(단계 5.1.5)이 있는 샘플 홀더를 현미경 스테이지에 부드럽게 놓습니다.
      알림: 샘플을 현미경에 놓기 전에 커버슬립 바닥을 티슈와 70% 에탄올로 청소하십시오.
    7. MicroManager 2(45,46) 내의 EMU 플러그인 창(47)을 이용하여, 초점 잠금 레이저로부터의 신호가 사분면 포토다이오드(QPD)에서 검출될 때까지 피에조 스테이지를 이동시킨다.
      참고: 이미징 시간 동안 고정 초점을 유지하기 위해 커버슬립에서 근적외선 광섬유 결합 레이저의 전체 내부 반사와 사분면 광 다이오드(QPD)에서 높이 감지 감지를 통해 초점 잠금이 달성됩니다. QPD 신호는 대물 렌즈 피에조 마운트의 폐쇄 루프 제어를 제공했습니다.
    8. 저출력(즉, 1-5%)에서 640nm 여기 레이저로 후면 초점면 이미지를 획득하여 침지 오일에 기포가 없는지 확인합니다.
      알림: 기포가 감지되면 스테이지에서 샘플을 제거하십시오. 커버슬립 하단과 대물렌즈를 청소하고 5.1.6-5.1.8단계를 반복합니다. 그렇지 않으면, EMU 소프트웨어(47) 내에서 초점을 고정하는 것을 진행한다.
    9. 명시야 조명을 사용하여 생식선 조직을 국소화합니다. 저강도 640nm 조명을 사용하여 많은 SC 스트레치가 포함된 조직 부분에 초점을 맞춥니다.
      알림: 커버슬립에서 2μm 이상 떨어진 구조물에 초점을 맞추지 마십시오. 샘플을 찾기 위해 더 높은 레이저 출력을 사용하지 마십시오., 이렇게 하면 일부 형광단이 조기에 깜박이는 상태로 바뀔 수 있습니다. 여기서, 펄스가 1,000으로 설정된 상승 모드에서 1kW/cm2 가 사용되었다.
    10. 적절한 깜박임 속도에 도달할 때까지 ~640초 동안 높은 방사조도(27kW/cm2)에서 2nm 조명으로 샘플을 노출시킵니다(보충 비디오 1).
    11. MicroManager 245,46의 다차원 수집 도구를 사용하여 20ms 노출 시간으로 200,000프레임을 수집합니다.
    12. 한편, 원하는 점멸 속도를 유지하기 위해 EMU 플러그인(38,47)의 활성화 옵션을 사용하여 UV 활성화를 설정한다.
      알림: 최대 펄스 길이가 3로 설정된 상승 모드에서 2kW/cm10,000 조도로 UV 레이저를 사용하십시오.
    13. SMLM 이미지 재구성 및 후처리를 수행합니다.
      참고: 원시 SMLM 데이터에서 이미지를 재구성하려면 게시된 메서드를 참조하십시오. 여기에 제시된 데이터는 SMAP48,49 소프트웨어를 사용하여 처리되었습니다. 초고해상도 이미지 재구성, 채널 할당, 드리프트 보정, 현지화 정밀도가 낮은 현지화 필터링 및 최대우도 필터가 SMAP48 소프트웨어에서 수행되었습니다.
  2. 유도 방출 고갈 현미경
    참고: 이미지는 EMBL 이미징 센터(https://www.embl.org/about/info/imaging-centre)에서 백색광 레이저, 775nm 펄스 STED 레이저 및 FALCON F발광 Lifetime IM에이징 모듈(재료 표)이 장착된 통합 STED 현미경 시스템에서 획득되었습니다.
    1. 현미경 슬라이드에 20μL의 장착 매체(재료 표)를 떨어뜨립니다. 4.2.2단계에서 커버슬립 하나를 꺼내 장착 매체를 향한 슬라이드에 샘플을 부드럽게 놓습니다(그림 2B).
      알림: 장착 매체 내에 공기 주머니가 들어가지 않도록 하십시오.
    2. 장착 매체를 밤새 경화시키십시오.
      알림: 다음 날 샘플을 이미징하거나 이미징할 때까지 4°C에서 보관하십시오.
    3. 샘플을 장착하려면 5.2.2단계의 샘플 커버슬립에 침지 오일 한 방울을 추가합니다. 100x/1.40 오일 대물렌즈를 사용하여 샘플을 현미경 스테이지에 부드럽게 놓습니다.
    4. 샘플에 초점을 맞추고 명시야 조명을 사용하여 생식계열 조직을 찾습니다.
    5. 현미경 소프트웨어를 사용하여 TauSTED 이미지를 획득할 관심 영역을 지정합니다.
    6. 여기 레이저와 샘플에 사용된 형광단을 여기시키는 데 사용되는 적절한 출력을 선택하십시오.
      참고: 여기서 4% 전력의 580nm 레이저를 사용하여 AlexaFluor 594-접합 F(ab')2 2차 항체 단편을 이미지화하고, 3% 전력에서 635nm를 사용하여 STAR 635P 접합 F(ab')2 단편을 이미지화했습니다.
    7. 현미경 소프트웨어를 사용하여 적절한 STED 공핍 레이저 출력을 선택하고 이미지 감지를 설정합니다.
      참고: 여기서 775nm STED 공핍 레이저 출력은 40%로 설정되었습니다. 검출기는 광자 검출을 위한 이득 값이 10, 스캔 속도가 100Hz, 픽셀 크기가 17nm인 카운팅 모드에서 사용되었습니다. TauSTED 획득을 위해 4 라인 축적이 사용되었습니다.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SMLM에 의한 C. elegans 생식계열 조직 내의 SC를 이미지화하기 위해 우리는 2색 비율 측정 3D-SMLM을 사용하여 염색체 축의 구성 요소인 HTP-3와 헤마글루티닌(HA) 태그로 내인성으로 태그된 횡방향 필라멘트 SYP-5의 C-말단을 국소화했습니다. C. elegans의 SC 내에서 두 단백질의 위치는 이전에 다른 연구16,30에 의해 결정되었습니다.

두꺼운 생물학적 샘플에 내재 된 광산란과 광학 수차를 최소화하기 위해 SC를 포함하는 감수 분열 핵의 맨 아래 z 섹션을 이미지화했습니다 (그림 3, 노란색 선). 획득한 각 이미지에 대해, 이미징 평면의 피에조 스테이지 위치는 대물렌즈가 커버슬립에 초점을 맞출 때 피에조 스테이지 위치를 기준으로 표시되었습니다. 이를 통해 커버 슬립에서 피에조 거리를 계산할 수있었습니다. 성공적으로 장착된 샘플은 커버슬립 가까이에 안정적으로 부착되고 생식선 모양을 유지합니다(즉, 조직은 고정 후 단계 동안 두 커버슬립 사이에서 분쇄되지 않음). 샘플 장착의 품질은 잘 부착 된 생식선이 용액에서 움직임을 나타내지 않기 때문에 실체 현미경으로 쉽게 평가할 수 있습니다 (4.2.6 단계). 그럼에도 불구하고, 장착 과정의 확률 성으로 인해, 생식선 조직이 반드시 커버 슬립에 완전히 평평하게 배치되지는 않을 것입니다. 따라서, SC를 함유하는 핵의 바닥면은 동일한 생식선 내의 커버슬립에 대해 다양한 거리에서 발견될 수 있다.

커버슬립에 티슈의 부착에 따라 해상도가 어떻게 변하는지 설명하기 위해, 우리는 커버슬립까지 서로 다른 피에조 거리에서 이미지를 획득했습니다. 개별 이미지의 품질을 평가하기 위해, 푸리에 고리 상관(FRC) 곡선(50, 51)이 계산되었고, 해상도는 SMAP 소프트웨어(48) 내의 FRCResolution 플러그인을 사용하여 결정되었다. 커버슬립까지 서로 다른 거리에서 촬영한 두 개의 개별 3D-SMLM 이미지에서 추출한 두 개의 대표 핵이 그림 4에 표시됩니다. 커버 슬립 가까이에 위치한 SC에서 염색체 축과 SYP-5 ::HA의 C 말단은 3 차원 모두에서 잘 해결됩니다 (그림 4A, 커버 슬립에서 0.8μm). 주어진 거리로 분리된 2개의 구조를 해석하기 위해, 달성된 FRC 분해능은 일반적으로 축 분해능에서 이 거리의 절반보다 작아야 한다.

동일한 구조를 측면으로 분리하려면 더 작은 FRC 분해능 값을 달성해야 합니다. 실제로, 커버슬립에 근접하여 위치하는 샘플에서, FRC 분해능은 AlexaFluor 647 채널에 대해 38nm이고 CF680 채널에 대해 34nm이며, 따라서 SYP-5-말단 사이의 예상 거리인 84nm보다 훨씬 낮다(16). 따라서 이 결의안은 정면뿐만 아니라 측면에서도 SC의 조직을 쉽게 해결합니다(그림 4B i,ii). 대조적으로, 커버슬립에서 5μm 거리에 위치한 SC에서는 광산란 및 구면 수차로 인해 분해능이 저하됩니다(그림 4B). 이 거리에서의 FRC 분해능은 47 nm (AlexaFluor 647) 및 41 nm (CF680)로 떨어지며, 이는 SYP-5의 C- 말단을 완전히 분해 할 수 없다. 광학 수차는 축 방향 분해능보다 측면 해상도를 더 심각하게 손상시키기 때문에 HTP-3 및 SYP-5 대역은 커버슬립에서 5μm 거리에 위치한 샘플의 측면 보기 단면에서 더 이상 명확하게 분해되지 않습니다(그림 4B ii). 커버슬립으로부터 상이한 피에조 거리에서 획득한 이미지의 FRC 해상도를 비교한 결과, 이미징된 조직은 커버슬립으로부터 2μm를 넘지 않아야 한다는 것이 밝혀졌다(도 5). 이 결과는 조직이 커버 슬립의 폴리 -L- 라이신 코팅에 성공적으로 가교 결합되어야하는 사후 고정 단계의 올바른 실행의 중요성을 강조합니다.

또 다른 초고해상도 기술로 달성 가능한 해상도를 입증하기 위해 TauSTED 현미경으로 고정된 온전한 생식계열 조직에서 SC를 이미지화했습니다. 도 6A는 정면 뷰에서 SC의 라인 프로파일로부터 추정된 바와 같이, 본 연구 내에서 달성된 최고 및 최저 해상도를 갖는 TauSTED 이미지를 나타낸다(도 6B). 두 핵 모두에서 염색체 축에서 HTP-3의 두 국소화 밴드와 중앙 영역에서 SYP-5의 C- 말단을 분해 할 수 있으며,이 최적화 된 프로토콜을 사용하여 TauSTED에서 달성 할 수있는 해상도가 84nm 미만임을 입증했습니다. 최적의 조건(그림 6A, 상단)에서 50nm만 분리된 SC의 약간 기울어진 보기에서 C-말단을 해결할 수 있었습니다(그림 6A, 노란색 직사각형 및 6C).

상동 염색체 구조도; 정면, 측면, 단면도; 가로 필라멘트.
그림 1 : Caenorhabditis elegans에서 synaptonemal 복합체의 조직 개략도. 만화는 두 개의 상동 염색체 (회색)를 연결하는 C. elegans에서 SC의 단순화 된 구조를 보여줍니다. 구조는 정면, 측면 및 단면도로 표시됩니다. 염색체 축은 빨간색 막대로 표시되고 가로 필라멘트는 청록색으로 표시됩니다. 횡단 필라멘트 단백질 (C. elegans의 SYP-1, 5, 6)은 두 축 사이의 거리를 연결하기 위해 중앙 영역에서 일대일 방식 (청록색 볼 스틱 그래픽)으로 배향됩니다. 축과 횡방향 필라멘트의 C- 말단 사이의 예상 거리가 표시됩니다. 약어 : SC = 시냅톤 복합체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

C. elegans 해부 및 고정 방법, 다이어그램; STED 및 SMLM 이미징을 위한 현미경 준비.
그림 2: 연구에 사용된 샘플 준비의 그림. (A) 어린 C. elegans 성인은 머리 또는 꼬리 (녹색, 점선)에서 해부되고 프로토콜에 설명 된대로 처리됩니다. (B) 방법의 개별 단계는 회색 화살표로 연결된 그래픽으로 표시됩니다. 약어 : STED = 자극 방출 고갈; SMLM = 단일 분자 국소화 현미경; PBS = 인산염 완충 식염수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

형광 현미경 이미지; HTP-3, SYP-5:HA 단백질; 생물학적 조직 단면 분석.
그림 3: 단일 분자 국소화 현미경으로 관찰할 수 있는 조직 절편의 위치. 전체 마운트 C. elegans 생식선의 회전 디스크 컨포칼 이미지의 MIP. HTP-3 및 SYP-5의 C-말단(SYP-5::HA)을 조직으로 염색하였으며, 결합된 신호는 회색으로 나타내었다. 개별 공초점 이미지는 그리드/컬렉션 스티칭 피지 플러그인(52)을 사용하여 스티칭하여 전체 생식선의 이미지를 생성했습니다. 삽입은 SC를 포함하는 맨 아래 z-평면의 xy 뷰를 보여줍니다. 이 평면의 국소화는 생식선의 MIP 이미지 (노란색 선)에서 직사각형으로 표시된 조직 섹션의 직교도에 표시됩니다. 스케일 바 = 10 μm. 약어: MIP = 최대 강도 투영; SC = 시냅톤 복합체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

시냅스 단백질 분포의 공초점 현미경 다이어그램; 0.8μm 및 5.0μm 거리에서 볼 수 있습니다.
그림 4: HTP-3 및 SYP-5의 C-말단의 단일 분자 국소화 현미경. (A,B) 왼쪽: HTP-3(빨간색)에 대해 염색된 파키텐 핵과 SYP-5의 C-말단(SYP-5::HA, 청록색)을 보여주는 SMLM 이미지(스케일 바 = 1μm). 중: A와 B에 표시된 관심 영역의 확대된 이미지로, 각 이미지 아래에 해당 단면도가 표시됩니다(i, ii, 스케일 바 = 100nm). 확대된 이미지 내에서 SC의 스트레치는 염색체 축이 y축에 평행하도록 회전됩니다. 오른쪽: SC 내에서 관심 단백질의 국소화를 그래픽으로 표현하여 그림의 중앙에 표시된 확대 영역에서 SC의 방향을 나타냅니다. 약어 : SMLM = 단일 분자 국소화 현미경; SC = 시냅톤 복합체. SMLM 이미지를 재구성하기 위한 원시 데이터는 바이오스터디 데이터베이스(60)(기탁 ID: S-BIAD504)를 통해 입수가능하다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

공간 주파수 분석을 통한 AlexaFluor647 및 CF680의 형광단 분해능 대비(FRC) 그래프.
그림 5: 단일 분자 국소화 현미경 이미지의 푸리에 고리 상관 분해능은 커버슬립 평면에서 이미징된 z 평면까지의 거리에 따라 달라집니다. 컬러 선은 커버슬립에서 서로 다른 거리(색상 막대로 표시됨)에서 획득한 이미지의 FRC 곡선을 보여줍니다. FRC 해상도를 결정하는데 사용되는 1/7 임계값은 검은색 수평선으로 표시된다. 삽입물은 커버슬립으로부터의 피에조 거리에 대한 FRC 해상도의 의존성을 보여준다. 플로팅은 사용자 정의 작성된 R 스크립트 (버전 4.1.2, 보충 파일 1)에 의해 수행되었으며, 원래 곡선은 "ggplot2"패키지의 함수로 평활화되었습니다. 약어: FRC = 푸리에 고리 상관관계; SMLM = 단일 분자 국소화 현미경; SC = 시냅톤 복합체. FRC 곡선 및 SMLM 데이터에 대한 데이터는 바이오스터디 데이터베이스(60)( 기탁 ID: S-BIAD504)를 통해 입수가능하다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

단백질 국소화의 초고해상도 현미경; 형광 현미경, 강도 프로파일 차트.
그림 6: 형광 수명 기반 정보(TauSTED)로 강화된 유도 방출 고갈 현미경은 HTP-3과 SYP-5의 C 말단 모두에 대해 두 개의 국소화 대역을 확인합니다. (A) 두 개의 대표적인 TauSTED 이미지는 HTP-3 (빨간색)과 SYP-5 (SYP-5 ::HA, 청록색)의 C- 말단에 대해 염색 된 파키 텐 핵을 더 높은 (상단) 및 더 낮은 (하단) 구조적 정의 (스케일 바 = 1 μm)로 보여줍니다. 직사각형은 정면(흰색)에 SYP-5의 해결된 C-말단과 SC의 약간 기울어진 보기(노란색)가 있는 영역을 표시합니다. (B,C) TauSTED에 의해 해결된 HTP-3(빨간색) 및 SYP-5(청록색) 신호의 C-말단의 분포. 정면(B) 또는 약간 기울어진(C) 보기에 SC를 포함하는 관심 영역의 선 프로파일은 강도가 최대값으로 정규화된 전체 선으로 표시됩니다. 라인 프로파일은 피지 ImageJ를 사용하여 생성되었습니다. B 의 파선은 각 단백질에 대한 평균 데이터를 보여줍니다. C 의 두꺼운 청록색 선은 SYP-5의 C- 말단 사이의 분해 거리가 가장 짧은 선 프로파일에 해당합니다. 특정 단백질을 표적으로 하는 항체 사이의 거리를 결정하기 위해, 라인 프로파일(n=9(B), n=7(C))에 맞춤형 R 스크립트(버전 4.1.2, 보충 파일 1)를 사용하여 이중 가우시안을 장착하였다. 표준 편차± 평균 거리(B)와 최소값이 굵게 강조 표시된 범위(C)가 각각 각 그래프 상단에 표시됩니다. 약어: STED = 유도 방출 고갈 현미경; SC = 시냅톤 복합체. 플롯된 라인 프로파일의 디스플레이된 이미지 및 데이터 포인트는 BioStudies 데이터베이스(60 )(기탁 ID: S-BIAD504)를 통해 이용 가능하다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 이 프로토콜에 사용된 완충액 및 용액의 조성. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 비디오 1: 단일 분자 국소화 현미경 획득. 형광단이 적절한 속도로 깜박이는 것을 보여주는 비디오(50프레임 표시, 스케일 바 = 5μm, 20ms/프레임). 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 데이터 분석 스크립트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

상동 염색체의 올바른 재조합 및 분리에 필수적인 SC의 사다리 모양의 조직은 거의 70 년 전에 전자 현미경 3,4에서 처음 관찰되었습니다. SC의 전체 조직은 전자 현미경에서 쉽게 해결되지만 이 복합체 내에서 개별 구성 요소의 국소화에는 보다 표적화된 접근 방식이 필요합니다. 폭이 ~100nm에 불과하기 때문에 SC의 하부 구조는 기존의 형광 현미경으로 분해할 수 없습니다. 그러나 초고해상도 현미경은 시냅톤 복합체 16,19,24,25,26,27,28,29,30의 구조와 기능에 대한 새로운 발견의 주요 동인이 되었습니다. 이 연구를 용이하게하기 위해 SMLM 및 STED 현미경으로 C. elegans 생식선 조직 내에서 SC의 구조를 연구 할 수있는 장착 절차를 시연했습니다.

SMLM 이미징에서 해상도를 최적화하는 중요한 단계는 생식계열 조직을 poly-L-라이신 코팅 커버슬립에 직접 가교하는 것입니다(4단계). 커버슬립에 조직을 공유 부착하는 것은 샘플 내에서 큰 드리프트를 초래하고 SMLM의 장기간에 걸친 이미징을 불가능하게 만드는 움직임을 줄이는 데 필수적입니다. 또한 커버슬립에서 멀리 떨어진 곳에 SC를 포함하는 핵을 떠나는 차선책의 부착물조차도 구면 수차로 인한 달성 가능한 해상도가 크게 떨어집니다(그림 4). 여기에 사용된 공유 부착에 대한 대안적으로, 염색된 생식계열 조직은 또한 이미징 완충액(19, 30)의 작은 방울에서 2개의 밀봉된 커버슬립 사이에 고정화될 수 있다. 그러나, 이러한 고정화 방법은 여기에서 최적화된 프로토콜에 사용된 1mL에서 단 몇 μL로 샘플 내의 이미징 버퍼의 부피를 심각하게 감소시키고, 이는 이미징 버퍼의 산성화를 초래하고 샘플이 이미징될 수 있는 시간을 심각하게 감소시킬 것이다(38,53,54).

SMLM 및 STED 현미경 검사의 획득 시간이 길기 때문에 화학적으로 고정된 샘플의 이미징에 이러한 방법을 사용하는 것이 제한됩니다. 여기서 파라포름알데히드 고정은 샘플 준비 및 이미징 중에 SC의 구조가 보존되도록 합니다. 그러나, 손상되지 않은 조직 내에서 SC를 이미지화하기 위해 여기에서 취해진 예방 조치에도 불구하고, 고정 후 SC의 결과 구조는 살아있는 유기체 내의 그의 본래 상태의 구조와 반드시 동일하지는 않다. 더욱이, 고정된 SC의 단일 이미지가 생물학적 구조의 단일 "스냅샷"을 나타내기 때문에, 이러한 접근법은 생체내에서 천연 구조의 역학에 대해 맹목적으로 남아 있다.

그러나 거대 분자 구조의 역학 및 가변성에 대한 정보는 단일 "스냅 샷"뿐만 아니라 많은 "스냅 샷"을 획득하여 얻을 수도 있습니다. 이러한 접근법이 파키텐19 동안 SC의 구조 변화를 해결할 수 있지만, 이 프로토콜을 사용하여 제조된 단일 샘플로부터 획득될 수 있는 이미지의 수를 제한하는 몇 가지 요인이 있다. 첫째, 이미지 획득 중에 사용되는 높은 레이저 출력은 형광단의 영구적인 표백으로 이어지고 인접한 관심 영역 또는 여러 z-평면의 이미징을 배제하여 단일 샘플에서 획득할 수 있는 이미지 수를 크게 줄입니다. 둘째, 이 방법으로 제조된 커버슬립의 샘플/조직 밀도가 낮아 단일 커버슬립에서 획득할 수 있는 이미지 수가 크게 제한됩니다. 낮은 샘플 밀도는 또한 다른 생물학적 질문 34,55,56,57,58,59를 밝히는 데 도움이 되는 자동화된 이미지 획득 파이프라인의 사용을 금지합니다. 그러나 샘플 밀도는 숙련 된 사용자가 약간 높일 수 있습니다.

여기에 제시된 프로토콜은 SMLM35에서 최적의 분해능을 달성하는 데 필요한 높은 라벨링 밀도를 얻도록 최적화되어 있습니다. 이전 프로토콜은 면역염색16 전에 조직을 커버슬립에 공유 결합한 반면, 이 새로운 프로토콜은 샘플을 용액으로 염색한 후에만 조직을 커버슬립에 가교합니다. 이러한 변형은 면역표지에 사용되는 항체가 모든 면에서 조직에 자유롭게 접근할 수 있도록 하는 반면, 커버슬립에 대한 조직의 공유 부착은 항체가 커버슬립에 가장 가까운 핵에 도달하는 것을 제한하여 표지의 정도를 감소시킬 수 있습니다. 여기에 설명된 수정 사항은 분해능을 40-50nm(FRC 분해능)16 에서 30-40nm(이 프로토콜)로 향상시킵니다.

중요한 것은 SMLM에는 높은 표지 밀도와 높은 항체 농도가 필수적이지만 더 낮은 항체 농도를 사용하여 더 나은 STED 현미경 이미지를 얻을 수 있음을 발견했습니다(3단계). 수십 나노미터의 분해능에서 관심 단백질을 표지하는 데 사용되는 분자의 크기가 점점 더 중요해지고 있습니다. 따라서 우리는 전장 항체의 절반 크기인 F(ab')2 단편을 사용했습니다. 더 작은 신호 소스로 인한 국소 대조의 개선, 따라서 전장 2차 항체를 사용하는 것과 비교하여 이러한 변형에 의해 얻어진 분해능은 TauSTED에 의한 중앙 영역 내의 SYP-5의 2개의 C-말단의 분해능을 허용했으며, 이는 전장 항체를 사용하는 종래의 STED에 의해 분해되지 않았다(도 16 및 데이터는 나타내지 않음). 우리는 손상되지 않은 C. elegan의 생식계열에서 SC를 이미징하기 위한 이 최적화된 프로토콜이 감수 분열 동안 SC의 구조-기능 관계를 조사하는 것을 용이하게 할 것으로 기대합니다.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SMLM 이미징을 위한 이미징 버퍼를 공유해 주신 Jonas Ries와 Ries 연구소에 감사드립니다. 또한 이 프로토콜에 사용된 C. elegans 균주에 대해 김유미와 닭-항-HTP-3 항체에 대해 Abby F. Dernburg에게 감사드립니다. Olympus iXplore SPIN SR 컨포칼 현미경 사용에 대한 지원을 해주신 EMBL 하이델베르크 고급 광학 현미경 시설의 Marko Lampe와 Stefan Terjung에게 감사드립니다. 이 연구는 European Molecular Biology Laboratory와 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation - 452616889, SK)의 지원을 받았습니다. 우리는 베링거 잉겔하임 재단이 아낌없이 지원하는 유럽 분자 생물학 연구소(EMBL IC)의 이미징 센터에서 제공하는 액세스와 서비스를 인정합니다.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100x/1.5 오일 대물렌즈OlympusUPLAPO100XOHR
UPLAPO100XOHR 2-메르캅토에틸아민 (MEA)Sigma-Aldrich30070-10GMilliQ 물에 용해되어 5 M 용액, pH  8.7은 HCl로 조정됨. 일회용 용량으로 분표하여 동결하고 -80 °C로 유지됨.
추가 640nm 부스터 레이저TopticaIBEAM-SMART-640-S-HP
AlexaFluor 594, NHS 에스테르ThermoFischer ScientificA37572DMSO에 용해되어 1mM 용액에 분주하고 일회용 부피로 분주하고 동결 및 -80°도로 유지되었습니다. C
AlexaFluor 647, NHS 에스테르ThermoFischer ScientificA37573DMSO에 1mM 용액에 용해, 일회용 부피로 분주, 냉동 및 -80°°C 유지; C
anti-HAThermo Fisher Scientific2-2.2.14마우스 단클론성, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED 현미경)
anti-HTP-3Abby F. DernburgMacQueen et al., 2005Chicken polyclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)
Caenorhabditis elegans strain  YKM349김유미Hurlock et al., 2020syp-5(kim9[syp-5::HA]) I의 선물; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II
CF6680, NHS 에스테르Biotium92139DMSO에 용해되어 1mM 용액에 용해되고 일회용 부피로 분주되어 냉동 및 -80°C로 유지됨; C
원형 커버 유리 12mm No. 1Menzel-Gl Ä 세르; VWR631-0713
원형 커버 유리 24mm No. 1.5Carl RothPK26.1
원통형 렌즈ThorlabsLJ1516RM-A, LK1002RM-A
계란 완충액 (10x)Edgar 1995250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4
에탄올 (분석용 절대 값)Merck64-17-5
F(ab')2 fragment anti-chicken IgYJackson ImmunoresearchAB_2340347Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED 현미경)
F(ab')2 fragment anti-mouse IgGJackson ImmunoresearchAB_2340761Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)
Fisherbrand 현미경 슬라이드 T/F 그라운드 0.8-1.0 mm 두께Fisher scientific7107
Gauge Worm Pick 30 직경 0.254 mm - 이리듐 10%Kisker789265
포도당 산화효소/카탈라아제 효소 믹스 (GlOX/Cat)Jonas Ries의 선물Hoess, Mund, Reitberger 및 Ries, 201820x, 1916 U/mL 포도당 산화효소(Sigma G7141), 42350 U/mL 카탈라아제(Sigma C3155),
50mM Tris-HCl pH 8.0, 51% 글리세롤, MilliQ 물. -20 °C에 저장됩니다.
이미징 버퍼 베이스는 Jonas RiesHoess, Mund, Reitberger 등의 선물입니다. Ries, 201850 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 10% D-Glucose.
일회용 부피(950 μ L)을 동결하고 -80 °C로 유지했습니다.
Invitrogen ProLong Glass Antifade MountantThermoFischer ScientificP36982
Leica Stellaris 8 STED FALCONLeicaN/A현미경에는 최신 백색광 레이저, 775nm 펄스 STED 레이저, FALCON Fluorescence Lifetime IMaging 모듈, HC PL APO CS2 100x/1.40 오일 대물렌즈 및 Leica HyD X 검출기. 이 시스템은 염료의 특정 형광 수명을 측정하는 FLIM 모듈 강화 Tau-STED를 사용할 수 있으므로 염료의 형광 수명의 차이와 샘플의 염료 조건에 따라 배경 신호를 제거할 수 있습니다.  또한, 해상도는 고갈 도넛의 다른 영역에서 형광 수명의 변화를 고려하여 증가합니다.
장파 채널 방출 필터AHF AnalysentechnikF47-702700/100nm 대역통과
메탄올(분석용 절대)Merck67-56-1
NaHCO3Sigma-Aldrich/MerckS5761-500G100mM NaHCO3, pH 8.3
근적외선 광섬유 결합 레이저TopticaIBEAM-SMART-PT-CD맞춤형 디자인, 808 nm - 75mW
대물 렌즈 피에조 마운트 (PIFOC)Physik InstrumenteP-726.1.CD100 & 마이크로; m 이동 범위
Orca Fusion BT sCMOS 카메라HamamatsuC15440-20UP
PCR 튜브Greiner Bio-One6732830.2mL
인산 식염수 완충액(PBS 10x)N/A137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, pH 7.4
피어싱 16% 포름알데히드(w/v), 메탄올 무함유ThermoFischer Scientific2890616% 포름알데히드는 원래 유리 앰플에서 1.5mL 튜브로 전달되어 실온에서 보관됩니다.
PlasmaPrep2 플라즈마 세정제GaLa Instrumente GmbHN/A
Poly-L-lysine hydrobromideSigma-Aldrich/MerckP2636-25MG0.1% w/v 용액을 Milli-Q 물에서 제조하고 -20°C의 부분 표본에 저장했습니다.
Primary dichroic (illumination reflecting)AHF AnalysentechnikF73-866Squad bandpass @ 405, 488, 561, 640
쿼드노치 필터AHF AnalysentechnikF40-072405/488/561/640 nm
Quadrant photodiode (QPD)Laser ComponentsSD197-23-21-041, LC301DQD-PV
Razor bladesApollo Herkenrath SolingerN/A
굴절 빔 쉐이퍼AdlOpticaPiShaper 6_6_VIS
Roche 차단 시약Roche1109617600110x 용액을 권장 사항에 따라 제조했습니다. 냉동 분취액은 -20°C에서 보관되었습니다.
메스 블레이드 (Feather brand #11, No. 3)Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH1110911
메스 제거 상자Fisher scientific10002-50
Secondary dichroic (emission reflecting)AHF AnalysentechnikF38-785S750 nm longpass
Shortpass filterSemrockBSP01-785R-25  750nm
단파 채널 방출 필터AHF AnalysentechnikF37-677  676/37nm 대역통과
단일분자 국소화 현미경EMBL 이미징 센터Diekmann et al., 2020 수정현미경은 단일 모드 광섬유 결합 레이저 엔진, 추가 부스터 레이저 및 굴절 빔 셰이퍼를 통해 광시야 에피 조명을 제공하여 균일한 조명 필드를 제공합니다(Stehr et al, 2019). 광시야 이미지는 sCMOS 카메라에서 캡처됩니다. 61x의 시스템 배율 및 106 nm의 픽셀 크기에 적합한 릴레이 광학 장치.
스펙트럼으로 중첩되는 원적외선 염료의 비율 계량 이미징을 위해 이미지 스플리터는 카메라에서 두 개의 스펙트럼으로 구별되는 이미지를 생성합니다(분할 이색성: 665nm 장역 통과, 단파 채널 방출 필터: 676/37nm 대역 통과, 장파 방출 필터: 700/100nm 대역 통과). 추가 405/488/561/640nm 쿼드노치 필터와 750nm 쇼트패스 필터는 두 경로에 공통적이며 추가 레이저 차단을 제공합니다).
복합 원통형 렌즈는 3D 이미징에 필요한 난시를 제공합니다.
2시간을 초과하는 촬상(200,000 - 250,000개의 이미지로 구성)에서 고정 초점을 유지하기 위해, 초점 잠금은 근적외선 섬유 결합 레이저의 전체 내부 반사에 의해 달성됩니다. 커버슬립(coverslip)과 사분면 포토다이오드(QPD)에 대한 후속 높이 감지 감지에서. QPD 신호는 대물 렌즈 피에조 마운트의 폐쇄 루프 제어를 제공했습니다.
이 현미경에 대한 액세스는 https://www.embl.org/about/info/imaging-centre 참조하거나
단일 모드 광섬유 결합 다중 레이저 엔진TopticaiCHROME MLE-LFA-HP405, 488, 561, 640nm에서 100mW의 광시야 에피 조명을 제공합니다
. 분할 이색성AHF AnalysentechnikF48-665SG665nm 긴 패스
스퀘어 커버 유리 22 x 22 mm No.1Menzel-Gl ä 세르; VWR630-2882
STAR 635P, NHS 에스테르AbberiorST635P-0002-1MGDMSO에 용해되어 1mM 용액에 분주하고 일회용 부피로 분주하고 냉동 및 -80°도로 유지했습니다. C
실체 현미경 Stemi 305 Stand K LABZeissN/A
Tetramisole hydrochlorideSigma-Aldrich/MerckT1512-2G1%(w/v) 용액을 Milli-Q 물에서 제조했습니다. 냉동 분취량은 -20 °C.
해동 분취량은 4 ° C이며 몇 달 동안 사용됩니다.
TetraSpeck 마이크로스피어ThermoFischer ScientificT7279  0.1 & 마이크로; m, 형광 청색/녹색/주황색/진한 빨간색
트리스 식염수 완충액(TBS 10x)N/A200mM Tris-HCl, 1.5m NaCl, pH 7.5
TWEEN 20Sigma-Aldrich/MerckP9416-50ML원래 포장으로 실온에 보관합니다.
WormStuff 웜 픽Kisker789277
XY 현미경 스테이지  SmaractN/A맞춤형 디자인
Zeba Micro Spin Desalting ColumnThermoFischer Scientific89877  7K MWCO, 75 &마이크로; 엘
ic-contact@embl.de

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