방법 논문

성숙한 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 단층을 사용한 고처리량 심장 독성 스크리닝

DOI:

10.3791/64364

⸱

2023년 3월 24일

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1Frankel Cardiovascular Regeneration Core Laboratory, Cardiovascular Medicine-Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 2CAIRN Research, 3StemBioSys, Inc.

이 논문에서

요약

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인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포(hiPSC-CM)는 전임상 심장 독성 스크리닝을 위해 동물을 사용하는 것에 대한 대안을 제공합니다. 전임상 독성 스크리닝에서 hiPSC-CM의 광범위한 채택에 대한 한계는 세포의 미성숙하고 태아와 유사한 표현형입니다. hiPSC-CM의 견고하고 신속한 성숙을 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.

초록

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인간 유도 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CMs)는 전임상 심장 독성 시험을 위해 동물 및 동물 세포에 대한 의존도를 대체하고 감소시키는 데 사용됩니다. 2차원 단층 형식에서 hiPSC-CM은 최적의 세포외 기질(ECM)에서 배양할 때 성인 인간 심장 근육 세포의 구조와 기능을 요약합니다. 인간 주산기 줄기세포 유래 ECM(성숙유도 세포외 기질-MECM)은 도금 후 7일 만에 hiPSC-CM의 구조, 기능 및 대사 상태를 성숙시킵니다.

성숙한 hiPSC-CM 단층은 또한 부정맥 및 심장 독성을 유발할 위험이 있는 알려진 임상적으로 관련된 약물에 예상대로 반응합니다. hiPSC-CM 단층의 성숙은 지금까지 규제 과학 및 안전성 스크리닝을 위해 이러한 귀중한 세포를 널리 채택하는 데 걸림돌이었습니다. 이 기사에서는 hiPSC-CM 전기생리학적 및 수축 기능의 도금, 성숙 및 고처리량, 기능적 표현형에 대한 검증된 방법을 제시합니다. 이러한 방법은 상업적으로 이용 가능한 정제된 심근 세포뿐만 아니라 매우 효율적인 챔버 특이적 분화 프로토콜을 사용하여 사내에서 생성된 줄기 세포 유래 심근 세포에도 적용됩니다.

고처리량 전기생리학적 기능은 전압에 민감한 염료(VSD, 방출: 488nm), 칼슘 민감성 형광단(CSF) 또는 유전적으로 암호화된 칼슘 센서(GCaMP6)를 사용하여 측정됩니다. 고처리량 광학 매핑 장치는 각 기능 매개변수의 광학 기록에 사용되며 맞춤형 전용 소프트웨어는 전기생리학적 데이터 분석에 사용됩니다. MECM 프로토콜은 양성 수축 촉진제(이소프레날린) 및 인간 에테르-고-고-고-관련 유전자(hERG) 채널 특이적 차단제를 사용하여 약물 스크리닝에 적용됩니다. 이러한 리소스를 통해 다른 연구자는 고처리량, 전임상 심장 독성 스크리닝, 심장 약물 효능 테스트 및 심혈관 연구를 위해 성숙한 hiPSC-CM을 성공적으로 활용할 수 있습니다.

서론

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인간 유도만능줄기세포 유래 심근세포(hiPSC-CMs)는 국제적 규모로 검증되었으며, 체외 심장독성 스크리닝에 사용할 수 있다1. 고순도 hiPSC-CM은 거의 무제한으로 생성, 냉동 보존 및 해동할 수 있습니다. 다시 도금 할 때, 그들은 또한 인간의 심장 2,3을 연상시키는 리듬으로 다시 살아 움직이고 수축하기 시작합니다. 놀랍게도, 개별 hiPSC-CM은 서로 결합되어 단일 조직으로 뛰는 기능적 세포융합을 형성합니다. 오늘날, hiPSC는 일상적으로 환자의 혈액 샘플에서 추출되므로, 시험관 내 hiPSC-CM 심장독성 스크리닝 분석법을 사용하여 모든 사람을 대표할 수 있다 4,5. 이를 통해 "Clinical Trials in a Dish"를 수행할 수 있는 기회가 주어지며, 다양한 집단을 대표하는 비율이 높아진다6.

기존 동물 및 동물 세포 심장 독성 스크리닝 접근법에 비해 한 가지 중요한 이점은 hiPSC-CM....

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프로토콜

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이 프로토콜에서 hiPSC 사용은 미시간 대학 HPSCRO 위원회(Human Pluripotent Stem Cell Oversight Committee)에 의해 승인되었습니다. 재료 및 장비 목록은 재료 표를 참조하십시오. 미디어와 그 구성에 대해서는 표 1 을 참조하십시오.

1. 성숙 유도 세포외 기질(MECM)에서 성숙을 위해 상업적으로 이용 가능한 냉동 보존된 hiPSC-CM의 해동 및 도금

  1. 모든 시약을 실온으로 데우고 심근 세포 도금 전 1시간 동안 Hank's balanced salt solution(HBSS) 또는 칼슘과 마그네슘을 함유한 인산염 완충 식염수(PBS)로 MECM 플레이트를 재수화합니다(96웰 플레이트의 웰당 완충액 200μL).
  2. 심근세포 플레이팅(96웰 플레이트의 웰당 완충액 200μL) 전에 1시간 동안 칼슘 및 마그네슘을 함유하는 HBSS 또는 PBS로 MECM 플레이트를 2배 세척하고 웰을 수화 상태로 유지합니다.
  3. 37°C 수조를 준비합니다.
  4. 액체 질소 탱크에서 심근 세포 튜브를 제거하고 튜브를 드라이 아이스로 옮긴 다음 튜브 캡을 약간 열어 압력을 ....

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결과

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위상차 및 면역형광 공초점 이미징을 특징으로 하는 hiPSC-CM 성숙
MECM 코팅된 96웰 플레이트를 사용하여 상업적으로 이용 가능한 hiPSC-CM의 ECM 매개 성숙에 대한 타임라인은 그림 1A에 나와 있습니다. 이러한 데이터는 냉동 보존된 세포 바이알로 실험실에 도착하는 상업적으로 이용 가능한 심근 세포를 사용하여 수집됩니다. 각 바이알에는 >5 × 106 개의 생존 가능한 심근 세포가 들어 있습니다. 세포는 ~ 98 % 순수하고 품질 관리를 위해 엄격한 테스트를 거쳤습니다 (분석 인증서는 각 바이알과 함께 제공됨). CM 수가 많기 때문에 동일한 셀 배치를 사용하여 CM을 다른 ECM 조합에 해동 및 도금할 수 있습니다. 그림 1에서 hiPSC-CM은 마우스 ECM 코팅 플레이트 또는 MECM 코팅 플레이트에 도금되어 있습니다. MECM에 도금된 hiP.......

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토론

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hiPSC-CM을 사용한 체외 심장 독성 스크리닝에는 여러 가지 접근 방식이 있습니다. hiPSC-CM의 사용에 관한 최근의 "모범 사례" 논문은 다양한 체외 분석법, 1차 판독값, 그리고 중요하게는 인간 심장 전기생리학적 기능을 정량화하기 위한 각 분석의 세분성을 제시했다20. 멤브레인 피어싱 전극을 사용하는 것 외에도 인간의 심장 전기생리학적 기능에 대한 가장 직접적인 측정은 VSD에 의해 제공됩니다. VSD 분석 판독을 통해 활동 전위 지속 시간, 활동 전위 전파 속도, 활동 전위 업스트로크, 활동 전위 삼각 측량, 박동률, 박동 규칙성 및 활동 전위 지속 시간 이질성을 포함한 중요한 전기생리학적 파라미터를 직접 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 마찬가지로, 칼슘에 민감한 프로브는 hiPSC-CM 단층 리듬, 속도 및 이벤트 기간에 대한 정보를 제공합니다. 형광 프로브를 사용하여 수행된 hiPSC-CM 칼슘 과도 측정은 각 수축의 수축성 및 수축 강.......

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TJH는 StemBioSys, Inc.의 컨설턴트이자 과학 고문입니다. TB는 StemBioSys, Inc.의 직원입니다. AMR과 JC는 StemBioSys, Inc.의 전 컨설턴트입니다. TJH, TB, AMR 및 JC는 StemBioSys, Inc.의 주주입니다.

감사의 글

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이 작업은 NIH 보조금 HL148068-04 및 R44ES027703-02(TJH)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.25% 트립신 EDTAGibco25200-056
0.5 mg/mL BSA (7.5 µ mol/L)Millipore SigmaA3294
2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)Millipore SigmaH4034
AdGCaMP6mVector biolabs1909
알부민 humanSigmaA9731-1G
alpha actinin 항체ThermoFisherMA1-22863
B27Gibco17504-044
BlebbistatinSigmaB0560
CalBryte 520AMAAT Bioquest20650
CELLvo MatrixPlus 96wpStemBiosysN/A
https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus CHIR99021LC Laboratoriesc-6556
Clear Assay medium (fluorobrite)ThermoFisherA1896701아데노바이러스용 transduction
DAPIThermoFisher62248
DMEM:F12Gibco11330-032
FBS (Fetal Bovine Serum)SigmaF4135-500ML
FluoVoltThermoFisherF10488
HBSSGibco14025-092
iCell CM 유지 보수 매체FUJIFILM/Cellular DynamicsM1003
iCell2 CMs후지필름1434
인큐사이트 줌 싸토리우스
iPS DF19-9-11T. HWiCell
IsoproterenolMilliporeSigmaCAS-51-30-9
IWP4Tocris5214
L-아스코르브산 2-인산 세스키마그네슘 염 수화물SigmaA8960-5g
L-글루타민GibcoA2916801
LS 컬럼Miltenyii Biotec130-042-401
MACS 버퍼 (autoMACS Running Buffer)Miltenyii Biotec130-091-221
MatrigelCorning354234
MitoTracker RedThermoFisherM7512
Nautilus HTS 광학 매핑 CuriBiohttps://www.curibio.com/products-overview
Nikon A1R 컨포칼 현미경Nikon
비필수 아미노산Gibco11140-050
사전 분리 필터Miltenyii Biotec130-041-407
PSC 유래 심근 세포 분리 키트, 인간Miltenyii Biotec130-110-188
PulseCuriBiohttps://www.curibio.com/products-overview
Quadro MACS 분리기 (자석)Miltenyii Biotec130-091-051
레티노산SigmaR2625
RPMI 1640 Gibco11875-093
RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine)Gibco22400-089
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyii Biotec130-107-086
TnI 항체 (pan TnI)Millipore SigmaMAB1691 
Versene (에틸렌 디아민 테트라 아세트산 - EDTA 용액)Gibco15040-066
Y-27632 dihydrochlorideTocris1254
β - 메르 캅토 에탄올Gibco21985023

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  2. Ma, J., et al.

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재인쇄 및 허가

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