방법 논문

성숙한 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 단층을 사용한 고처리량 심장 독성 스크리닝

DOI:

10.3791/64364

⸱

2023년 3월 24일

 ,  ,  ,  , 
1Frankel Cardiovascular Regeneration Core Laboratory, Cardiovascular Medicine-Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 2CAIRN Research, 3StemBioSys, Inc.

이 논문에서

요약

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인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포(hiPSC-CM)는 전임상 심장 독성 스크리닝을 위해 동물을 사용하는 것에 대한 대안을 제공합니다. 전임상 독성 스크리닝에서 hiPSC-CM의 광범위한 채택에 대한 한계는 세포의 미성숙하고 태아와 유사한 표현형입니다. hiPSC-CM의 견고하고 신속한 성숙을 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.

초록

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인간 유도 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CMs)는 전임상 심장 독성 시험을 위해 동물 및 동물 세포에 대한 의존도를 대체하고 감소시키는 데 사용됩니다. 2차원 단층 형식에서 hiPSC-CM은 최적의 세포외 기질(ECM)에서 배양할 때 성인 인간 심장 근육 세포의 구조와 기능을 요약합니다. 인간 주산기 줄기세포 유래 ECM(성숙유도 세포외 기질-MECM)은 도금 후 7일 만에 hiPSC-CM의 구조, 기능 및 대사 상태를 성숙시킵니다.

성숙한 hiPSC-CM 단층은 또한 부정맥 및 심장 독성을 유발할 위험이 있는 알려진 임상적으로 관련된 약물에 예상대로 반응합니다. hiPSC-CM 단층의 성숙은 지금까지 규제 과학 및 안전성 스크리닝을 위해 이러한 귀중한 세포를 널리 채택하는 데 걸림돌이었습니다. 이 기사에서는 hiPSC-CM 전기생리학적 및 수축 기능의 도금, 성숙 및 고처리량, 기능적 표현형에 대한 검증된 방법을 제시합니다. 이러한 방법은 상업적으로 이용 가능한 정제된 심근 세포뿐만 아니라 매우 효율적인 챔버 특이적 분화 프로토콜을 사용하여 사내에서 생성된 줄기 세포 유래 심근 세포에도 적용됩니다.

고처리량 전기생리학적 기능은 전압에 민감한 염료(VSD, 방출: 488nm), 칼슘 민감성 형광단(CSF) 또는 유전적으로 암호화된 칼슘 센서(GCaMP6)를 사용하여 측정됩니다. 고처리량 광학 매핑 장치는 각 기능 매개변수의 광학 기록에 사용되며 맞춤형 전용 소프트웨어는 전기생리학적 데이터 분석에 사용됩니다. MECM 프로토콜은 양성 수축 촉진제(이소프레날린) 및 인간 에테르-고-고-고-관련 유전자(hERG) 채널 특이적 차단제를 사용하여 약물 스크리닝에 적용됩니다. 이러한 리소스를 통해 다른 연구자는 고처리량, 전임상 심장 독성 스크리닝, 심장 약물 효능 테스트 및 심혈관 연구를 위해 성숙한 hiPSC-CM을 성공적으로 활용할 수 있습니다.

서론

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인간 유도만능줄기세포 유래 심근세포(hiPSC-CMs)는 국제적 규모로 검증되었으며, 체외 심장독성 스크리닝에 사용할 수 있다1. 고순도 hiPSC-CM은 거의 무제한으로 생성, 냉동 보존 및 해동할 수 있습니다. 다시 도금 할 때, 그들은 또한 인간의 심장 2,3을 연상시키는 리듬으로 다시 살아 움직이고 수축하기 시작합니다. 놀랍게도, 개별 hiPSC-CM은 서로 결합되어 단일 조직으로 뛰는 기능적 세포융합을 형성합니다. 오늘날, hiPSC는 일상적으로 환자의 혈액 샘플에서 추출되므로, 시험관 내 hiPSC-CM 심장독성 스크리닝 분석법을 사용하여 모든 사람을 대표할 수 있다 4,5. 이를 통해 "Clinical Trials in a Dish"를 수행할 수 있는 기회가 주어지며, 다양한 집단을 대표하는 비율이 높아진다6.

기존 동물 및 동물 세포 심장 독성 스크리닝 접근법에 비해 한 가지 중요한 이점은 hiPSC-CM이 전체 인간 게놈을 활용하고 인간 심장과 유전적 유사성을 가진 시험관 내 시스템을 제공한다는 것입니다. 이는 약물유전체학 및 개인 맞춤 의학에 특히 매력적이며, 약물 및 기타 치료법 개발에 hiPSC-CM을 사용하면 보다 정확하고 정확하며 안전한 약물 처방을 제공할 것으로 예상됩니다. 실제로, 2차원(2D) hiPSC-CM 단층 분석은 부정맥을 유발할 위험이 있는 것으로 알려진 임상적으로 사용되는 약물 패널을 사용하여 약물 심장 독성을 예측하는 것으로 입증되었습니다 1,7,8,9. hiPSC-CM의 방대한 잠재력과 약물 개발을 간소화하고 더 저렴하게 만들겠다는 약속에도 불구하고 이러한 새로운 분석법을 사용하는 것을 꺼려했습니다10,11,12.

지금까지 hiPSC-CM 스크리닝 분석의 광범위한 채택 및 수용의 주요 한계 중 하나는 미성숙하고 태아와 유사한 외관과 기능입니다. hiPSC-CM 성숙의 중요한 문제는 과학 문헌 광고 메스꺼움13,14,15,16에서 검토되고 논의되었습니다. 마찬가지로, 2D 단층의 세포외 기질(ECM) 조작 및 3D 공학 심장 조직(EHT)의 개발을 포함하여 hiPSC-CM 성숙을 촉진하기 위해 많은 접근 방식이 사용되었습니다17,18. 현재 3D EHT를 사용하면 2D 단층 기반 접근 방식에 비해 우수한 성숙도를 제공할 것이라는 믿음이 널리 퍼져 있습니다. 그러나 2D 단층은 3D EHT에 비해 셀 활용 효율이 높고 도금 성공률이 높습니다. 3D EHT는 더 많은 수의 셀을 사용하며, 종종 결과를 혼란스럽게 할 수 있는 다른 셀 유형을 포함해야 합니다. 따라서 이 기사에서는 전기적 및 기계적으로 결합된 세포의 2D 단층으로 배양된 hiPSC-CM을 성숙시키는 간단한 방법을 사용하는 데 중점을 둡니다.

ECM을 사용하여 2D 단층에서 고급 hiPSC-CM 성숙을 달성할 수 있습니다. hiPSC-CM의 2D 단층은 Engelbreth-Holm-Swarm 마우스 육종 세포(마우스 ECM)에서 분비되는 기저막 매트릭스로 코팅된 부드럽고 유연한 폴리디메틸실록산 커버슬립을 사용하여 성숙할 수 있습니다. 2016년 보고서에 따르면 이 부드러운 ECM 조건에서 배양된 hiPSC-CM은 기능적으로 성숙하여 성인 심장 값(~50cm/s)에 가까운 활동 전위 전도 속도를 나타냅니다18. 또한, 이러한 성숙한 hiPSC-CM은 과분극 휴지막 전위 및Kir2.1의 발현을 포함하여 성인 심장을 연상시키는 많은 다른 전기생리학적 특성을 나타냈습니다. 보다 최근에, 보고된 바에 따르면, 2차원 hiPSC-CM의 구조적 성숙을 촉진하는 인간 주산기 줄기세포 유래 ECM 코팅이 확인되었다19. 여기에서는 고처리량 전기생리학적 스크린에 사용하기 위해 구조적으로 성숙한 2D hiPSC-CM 단층에 사용하기 쉬운 방법을 제시합니다. 또한 전압에 민감한 염료(VSD)와 칼슘에 민감한 프로브 및 단백질을 사용하여 2D hiPSC-CM 단층 전기생리학적 기능의 자동 획득 및 분석을 위한 광학 매핑 기기의 검증을 제공합니다.

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프로토콜

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이 프로토콜에서 hiPSC 사용은 미시간 대학 HPSCRO 위원회(Human Pluripotent Stem Cell Oversight Committee)에 의해 승인되었습니다. 재료 및 장비 목록은 재료 표를 참조하십시오. 미디어와 그 구성에 대해서는 표 1 을 참조하십시오.

1. 성숙 유도 세포외 기질(MECM)에서 성숙을 위해 상업적으로 이용 가능한 냉동 보존된 hiPSC-CM의 해동 및 도금

  1. 모든 시약을 실온으로 데우고 심근 세포 도금 전 1시간 동안 Hank's balanced salt solution(HBSS) 또는 칼슘과 마그네슘을 함유한 인산염 완충 식염수(PBS)로 MECM 플레이트를 재수화합니다(96웰 플레이트의 웰당 완충액 200μL).
  2. 심근세포 플레이팅(96웰 플레이트의 웰당 완충액 200μL) 전에 1시간 동안 칼슘 및 마그네슘을 함유하는 HBSS 또는 PBS로 MECM 플레이트를 2배 세척하고 웰을 수화 상태로 유지합니다.
  3. 37°C 수조를 준비합니다.
  4. 액체 질소 탱크에서 심근 세포 튜브를 제거하고 튜브를 드라이 아이스로 옮긴 다음 튜브 캡을 약간 열어 압력을 해제합니다.
    알림: 튜브의 압력을 해제하는 것은 매우 중요합니다! 튜브 내부에 너무 많은 압력이 가해지면 폭발할 수 있습니다.
  5. 튜브 캡을 다시 밀봉하고 수조에 넣어 4분 동안 해동합니다.
    알림: 부분 해동으로 인한 세포 손상을 방지하기 위해 완전히 해동하십시오.
  6. 세포가 해동된 후 튜브를 열기 전에 70% 에탄올을 분사합니다. 1mL 피펫을 사용하여 세포를 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 8mL의 도금 배지를 천천히 떨어뜨리고 1mL를 첨가할 때마다 튜브를 교반하여 세포가 삼투압 변화에 적응할 수 있도록 합니다.
    1. 1 mL 유리 피펫을 사용하여 1 mL의 도금 매체로 cryovial을 세척합니다. 그런 다음 세척액을 15mL 원뿔형 튜브에 천천히 떨어뜨립니다.
  7. 튜브를 ~300 × g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 펠릿을 1mL의 도금 매체에 재현탁합니다. 분취량을 제거하고 혈구계로 생세포 계수를 수행합니다. 7.5 × 105 cells/mL를 얻기 위해 추가 도금 매체를 추가합니다.
    참고: 96개의 웰을 준비하려면 약 10mL의 세포 현탁액이 필요합니다.
  8. 멀티채널 피펫을 사용하여 MECM 코팅된 96웰 플레이트의 웰당 100μL의 세포 현탁액을 분주합니다.
    알림: 도금하는 동안 세포 침전을 피하고 모든 웰에서 균일한 세포 밀도를 얻으십시오.
  9. 배지를 유지 배지(200 μL/웰)로 변경하기 전에 세포를 37°C, 5%CO2에서 2일 동안 배양합니다. 해동 후 5일째에 유지 매체를 교체하십시오. 앞서 설명한 바와 같이 7일 또는 그 이후에 EP 분석을 수행한다 8,9. 세포 배양을 연장하기로 선택할 때 격일로 배지를 교체하십시오.

2. hiPSC 심장 지향 분화 및 hiPSC-CM 정제

  1. 시중에서 판매되는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액 1개, 칼슘 및 마그네슘이 없는 HBSS(HBSS--) 및 Engelbreth-Holm-Swarm 마우스 육종 세포(마우스 ECM)에 의해 분비된 가용화된 기저막 매트릭스로 코팅된 6웰 플레이트를 실온으로 따뜻하게 합니다.
  2. 위상차 현미경으로 분화된 콜로니를 표시하고 흡인/절제합니다. 각 웰을 HBSS 1mL로 세척합니다--. >10 개의 분화 지점이 들어있는 웰에서 두 번의 세척을 수행하십시오.
  3. HBSS를 흡인하고 각 웰에 EDTA 용액 1mL를 추가합니다. 플레이트를 37°C에서 최대 5분 동안 인큐베이션합니다. 3 분 후에 플레이트를 확인하고 반투명 한 흰색의 눈에 보이는 콜로니를 찾으십시오.
  4. EDTA 용액을 흡인하고 단일 웰에 1mL를 추가합니다. 현탁액을 위아래로 반복적으로 피펫팅하여 2mL의 hiPSC 배지로 세포를 제거하고 10mL 유리 피펫을 사용하여 웰에서 모든 줄기 세포를 분리하고 세포 현탁액을 수집 튜브로 옮깁니다. 후속 우물로 흡인과 제거를 반복하십시오.
    알림: 유리 피펫 끝으로 집락을 들어올리기 어렵게 제거합니다.
  5. 줄기 세포를 세고 부피를 8.0 × 105 세포/웰로 조정합니다. 줄기 세포가 90% 합류에 도달할 때까지 hiPSC 배지(2mL/웰)에서 세포를 배양합니다(이 시간은 지금부터 D0이라고 함).
  6. 4μM의 CHIR99021이 보충된 2mL의 기본 분화 배지를 준비합니다.
  7. D0 상에서, 줄기 세포의 6-웰 플레이트의 각 웰을 웰 당 1 mL의 HBSS로 세척한다. HBSS를 4μM의 CHIR99021이 보충된 기저 분화 배지로 교체합니다.
  8. D1에서는 아무 작업도 수행하지 않습니다.
  9. D2 상에서, 4 μM의 IWP4로 보충된 염기 분화 배지를 준비한다.
  10. 배지를 웰당 IWP4가 보충된 기저 분화 배지 2mL로 교체합니다.
  11. D3에서는 심실 특이적 분화를 위해 아무 것도 하지 않습니다. 심방 특이적 분화를 위해 배지를 흡인하고 웰당 4μM의 IWP4 및 1μM 레티노산(RA) 용액이 보충된 기본 배지 2mL를 추가합니다.
  12. D4에서 배지를 흡인하고 심실 분화를 위해 웰당 2mL의 기본 배지를 추가합니다. 심방 분화를 위해 배지를 흡인하고 웰당 1μM RA 용액이 보충된 기본 배지 2mL를 추가합니다.
  13. D5에서는 아무 작업도 수행하지 않습니다.
  14. D6에서 배지를 흡인하고 웰당 2mL의 기본 배지를 추가합니다(심방 및 심실 분화 모두).
  15. D7에서는 아무 작업도 수행하지 않습니다.
  16. D8에서 배지를 흡인하고 심근 세포 유지 배지 2mL를 추가합니다. 세포가 분리될 때까지 격일로 배지를 교체하거나 만성 약물 노출 계획을 따르십시오.

3. MACS(자기 활성화 세포 분류) 를 통한 hiPSC-CM 정제

  1. 세포 배양 배지를 흡인하고 각 웰을 1mL의 HBSS로 세척합니다--. 0.25% 트립신/EDTA 1mL를 첨가하고 37°C, 5%CO2 에서 10분 동안 배양하여 세포를 해리합니다. 트립신/EDTA를 비활성화하기 위해 2mL의 도금 배지로 각 웰의 세포를 재현탁하고 특이화합니다.
  2. 6개의 웰에서 70μm 스트레이너가 있는 50mL 원뿔형 튜브에 세포를 수집합니다. 그런 다음 3mL의 도금 매체로 여과기를 세척합니다. 세포를 세십시오.
  3. 현탁액을 ~300 × g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 20mL의 얼음처럼 차가운 MACS 분리 완충액으로 세포를 세척합니다. 그런 다음 ~300 × g 에서 5분 동안 다시 원심분리합니다.
  4. 펠릿을 5 ×6 세포 당 80 μL의 차가운 MACS 분리 완충액에 재현탁합니다. 5 ×10 6 세포 당 20 μL의 차가운 비 심근 세포 고갈 칵테일 (인간)을 추가하십시오. 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하고 10분 동안 얼음에서 배양합니다.
  5. 5 ×10 6 세포 당 4 mL의 차가운 MACS 분리 완충액을 첨가하여 샘플을 세척한다. ~300 × g 에서 5분 동안 샘플을 원심분리하고 상층액을 흡인합니다.
  6. 펠릿을 5 ×6 세포 당 80 μL의 차가운 MACS 분리 완충액에 재현탁합니다. 5 ×10 6 세포 당 20 μL의 차가운 항비오틴 마이크로 비드를 추가합니다. 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하고 얼음에서 10분 동안 배양합니다.
  7. 샘플이 배양되는 동안 MACS 분리기에 포지티브 공핍 컬럼(30μm 사전 분리 필터 장착)을 놓고 라벨이 부착된 15mL 수집 튜브를 컬럼 아래에 놓습니다. 5 × 106 셀마다 하나의 열이 필요합니다.
  8. 3mL의 저온 MACS 분리 완충액으로 각 컬럼을 프라이밍합니다. 항체 처리된 세포 현탁액을 5 ×10 6 세포당 2 mL의 MACS 분리 완충액과 혼합하고, 컬럼에 첨가한다.
    알림: 원심분리하지 마십시오! 이 단계에서의 원심분리는 심근세포 수율에 해로운 영향을 미친다.
  9. 각 컬럼에 2mL의 MACS 분리 완충액을 추가하고 12mL의 유동 심근 세포 현탁액이 수집될 때까지 유동을 수집합니다.
    알림: 컬럼이 완전히 건조되지 않도록 하십시오.
  10. 심근 세포를 ~ 300 × g 에서 5 분 동안 원심 분리하고 상층액을 버리고 심근 세포를 1mL의 도금 배지에 현탁시킵니다.
  11. 세포를 세어 농도를 결정하고, 원하는 파종 밀도로 부피를 조정하고, 세포를 플레이트합니다. 정제된 심근세포를 상기 1.9-1.11 단계(7.5 ×10 5 세포/웰)에서 설명한 바와 같이 MECM 96-웰 플레이트에 플레이트한다.

4. 전압에 민감한 염료(VSD)와 칼슘에 민감한 형광단(CSF)을 사용한 광학 매핑

  1. HBSS mL당 1μL의 VSD 염료와 HBSS mL당 10μL의 로딩 보조제를 추가하여 칼슘과 마그네슘이 포함된 HBSS에서 적절한 양의 VSD를 준비합니다.
    참고: 일반적으로 96웰 플레이트에는 10mL의 VSD 용액이 필요합니다.
  2. 또는 5μM의 CSF가 보충된 칼슘과 마그네슘으로 HBSS를 준비합니다. 심근 세포 유지 배지를 흡인하고 96웰 플레이트의 웰당 100μL의 VSD 또는 CSF로 교체합니다. 세포 배양 배양기에서 30분 동안 세포를 배양한다.
  3. 염료를 제거하고 분석 배지 또는 HBSS로 교체합니다. 37°C에서 평형을 이루어 고처리량 광학 매핑 장치를 사용하여 기본 데이터 광학 매핑을 수집합니다.
  4. 급성 노출 테스트를 위해 약물을 사용하여 세포를 처리하거나 관심 약물에 만성적으로 노출된 세포를 매핑합니다.
  5. 96웰 플레이트에서 심장 독성 테스트를 하려면 용량당 최소 6웰이 있는 화합물을 4회 용량으로 사용하십시오. 임상적으로 효과적인 치료 혈장 농도의 투여량을 포함하는, 효과적인 치료 혈장 농도 이하 내지 이상의 범위의 투여량을 사용한다.
  6. 약물을 디메틸 설폭사이드에 희석하고 -20°C에서 원액으로 저장한 다음 HBSS에서 원하는 농도로 희석합니다.
  7. 섹션 5에 설명된 대로 약물 적용 전에 기본 전기 생리학 측정을 수행합니다. 약물이 적용되면 만성 연구를 위해 최소 30분 후에 전기생리학 기록을 합니다. 광학 매핑 데이터 수집 및 분석 절차에 대해서는 다음 섹션을 참조하십시오.

5. 유전적으로 암호화된 칼슘 지표(GECI)를 사용한 광학 매핑

  1. MECM 코팅된 96웰 플레이트를 사용하여 성숙한 hiPSC-CM을 만들기 위해 위에서 설명한 바와 같이 시판되거나 MACS 정제된 hiPSC-CM을 플레이트합니다. 합류 단층을 형성하기 위해 각 96웰 플레이트의 웰당 7.5 ×10 4 CM을 플레이트합니다. 도금 매체를 사용하십시오.
  2. 도금 매체에서 48시간 후 심근세포 유지 매체로 전환합니다.
  3. 해동 및 재도금 후 4일째에 GCaMP6m(AdGCaMP6m)을 발현하기 위한 재조합 아데노바이러스를 감염 다중성(MOI) = 5로 세포에 추가합니다. CM 분석 배지를 사용하여 바이러스를 추가합니다.
    참고: 여기서, GCaMP6m을 사용한 실험은 상용 판매업체의 iCell2 심근세포에서 수행되었습니다.
  4. 5일째에 adGCaMP6m 배지를 제거하고 새로운 RPMI+B27(심근세포 유지 배지)로 교체합니다.
  5. 7일째에 현미경 또는 광학 매핑 이미저를 사용하여 CM을 관찰하여 자발적인 수축과 해당 칼슘 과도 현상을 시각화합니다.
  6. 7일 또는 그 이후, 약물 스크리닝을 위해 기준선 데이터 수집을 위해 GCaMP6m을 발현하는 성숙한 hiPSC-CM 단층의 96웰 플레이트를 인큐베이터에서 광학 매핑 이미저로 직접 옮깁니다.
  7. 전기생리학 데이터 수집 후 CM의 플레이트를 조직 배양 인큐베이터로 반환하여 후속 시점에서 측정합니다.
  8. 기준선 기록에 따라 각 약물을 최소 4회 투여하고 투여량당 최소 6웰을 사용하여 약물을 적용합니다. 데이터 수집 전에 최소 30분 동안 세포에서 약물을 평형화합니다. 데이터를 수집하기 전과 수집하는 동안 우물 온도를 ~37°C로 따뜻하게 합니다.
  9. 전체 플레이트의 기준선 기록에 따라 모든 웰에 이소프로테레놀(500nM)을 추가하여 강력한 약물 반응 데이터를 가능하게 합니다. 섹션 6에 설명된 대로 단층 박동률, 수축 진폭(칼슘 과도 진폭) 및 칼슘 과도 기간( 그림 5 참조)에 대한 이소프로테레놀의 효과를 정량화합니다.

6. 광학 매핑 데이터 수집 및 분석

  1. 광학 매핑 장치 카메라, 트랜스일루미네이터 및 플레이트 히터가 켜져 있는지 확인하십시오.
  2. 수집 소프트웨어를 열고 파일 저장 위치를 결정합니다.
  3. 전면 서랍을 열고 플레이트 히터에 플레이트를 놓습니다.
  4. Dark Frame 버튼을 클릭하여 어두운 프레임을 획득합니다.
  5. 지속 시간(10-30초) 및 획득 프레임 속도(예: 100fps, 더 높은 시간 해상도의 경우 250fps)를 선택하고 획득 시작을 클릭합니다.
  6. 해석 소프트웨어를 열고 가져오기/필터 탭에서 단일 파일 찾아보기 또는 다중 배열 을 선택하여 플레이트를 재구성합니다.
  7. 매개변수 모드(APD 또는 CaTD)를 선택하고, 픽셀당 거리를 입력하고, 웰 마법사를 사용하여 이미지에서 웰의 위치를 확인합니다. 저장 처리를 클릭하여 다음 탭으로 이동합니다.
  8. ROI(관심 영역) 탭을 열고 ROI를 수동, 자동 또는 전혀 사용하지 않도록 선택하여 분석을 위해 전체 웰을 고려합니다. ROI를 선택한 후 처리/저장 버튼을 클릭하여 다음 단계로 이동합니다. 웰 숨기기 및 필터링된 항목만 표시 상자를 선택하여 ROI를 시각화합니다.
  9. 분석 탭을 열고 화면 오른쪽 상단에서 각 웰 또는 ROI를 선택하여 자동 비트 감지의 정확도를 확인합니다. Add Beat/Save Beats를 누르거나 개별 Beat를 선택하고 키보드에서 Delete 키를 눌러 추적에서 Beats를 추가하거나 제거합니다.
  10. 선택적으로 평균 히트 맵 기능을 사용하여 플레이트에 대해 선택한 매개변수의 히트맵을 생성합니다.
  11. 분석 탭에서 시공간 플롯 버튼을 클릭하여 각 웰 또는 ROI에 대한 데이터를 시각화합니다. 비트 감지가 정확한지 확인한 후 내보내기 탭으로 이동하여 파일 형식을 선택합니다. 내보내기를 누르고 내보낼 데이터의 폴더를 만듭니다. 계속해서 데이터 파일을 열고 선택한 통계 분석 루틴을 실행합니다.
    참고: .xlxs 파일은 모든 매개 변수를 단일 파일로 내보내는 것이 좋습니다. 다른 형식(.csv 또는 .tsv)은 매개 변수당 하나의 파일을 생성합니다.

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결과

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위상차 및 면역형광 공초점 이미징을 특징으로 하는 hiPSC-CM 성숙
MECM 코팅된 96웰 플레이트를 사용하여 상업적으로 이용 가능한 hiPSC-CM의 ECM 매개 성숙에 대한 타임라인은 그림 1A에 나와 있습니다. 이러한 데이터는 냉동 보존된 세포 바이알로 실험실에 도착하는 상업적으로 이용 가능한 심근 세포를 사용하여 수집됩니다. 각 바이알에는 >5 × 106 개의 생존 가능한 심근 세포가 들어 있습니다. 세포는 ~ 98 % 순수하고 품질 관리를 위해 엄격한 테스트를 거쳤습니다 (분석 인증서는 각 바이알과 함께 제공됨). CM 수가 많기 때문에 동일한 셀 배치를 사용하여 CM을 다른 ECM 조합에 해동 및 도금할 수 있습니다. 그림 1에서 hiPSC-CM은 마우스 ECM 코팅 플레이트 또는 MECM 코팅 플레이트에 도금되어 있습니다. MECM에 도금된 hiP...

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토론

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hiPSC-CM을 사용한 체외 심장 독성 스크리닝에는 여러 가지 접근 방식이 있습니다. hiPSC-CM의 사용에 관한 최근의 "모범 사례" 논문은 다양한 체외 분석법, 1차 판독값, 그리고 중요하게는 인간 심장 전기생리학적 기능을 정량화하기 위한 각 분석의 세분성을 제시했다20. 멤브레인 피어싱 전극을 사용하는 것 외에도 인간의 심장 전기생리학적 기능에 대한 가장 직접적인 측정은 VSD에 의해 제공됩니다. VSD 분석 판독을 통해 활동 전위 지속 시간, 활동 전위 전파 속도, 활동 전위 업스트로크, 활동 전위 삼각 측량, 박동률, 박동 규칙성 및 활동 전위 지속 시간 이질성을 포함한 중요한 전기생리학적 파라미터를 직접 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 마찬가지로, 칼슘에 민감한 프로브는 hiPSC-CM 단층 리듬, 속도 및 이벤트 기간에 대한 정보를 제공합니다. 형광 프로브를 사용하여 수행된 hiPSC-CM 칼슘 과도 측정은 각 수축의 수축성 및 수축 강...

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공개 사항

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TJH는 StemBioSys, Inc.의 컨설턴트이자 과학 고문입니다. TB는 StemBioSys, Inc.의 직원입니다. AMR과 JC는 StemBioSys, Inc.의 전 컨설턴트입니다. TJH, TB, AMR 및 JC는 StemBioSys, Inc.의 주주입니다.

감사의 글

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이 작업은 NIH 보조금 HL148068-04 및 R44ES027703-02(TJH)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
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0.25% 트립신 EDTAGibco25200-056
0.5 mg/mL BSA (7.5 µ mol/L)Millipore SigmaA3294
2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)Millipore SigmaH4034
AdGCaMP6mVector biolabs1909
알부민 humanSigmaA9731-1G
alpha actinin 항체ThermoFisherMA1-22863
B27Gibco17504-044
BlebbistatinSigmaB0560
CalBryte 520AMAAT Bioquest20650
CELLvo MatrixPlus 96wpStemBiosysN/A
https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus CHIR99021LC Laboratoriesc-6556
Clear Assay medium (fluorobrite)ThermoFisherA1896701아데노바이러스용 transduction
DAPIThermoFisher62248
DMEM:F12Gibco11330-032
FBS (Fetal Bovine Serum)SigmaF4135-500ML
FluoVoltThermoFisherF10488
HBSSGibco14025-092
iCell CM 유지 보수 매체FUJIFILM/Cellular DynamicsM1003
iCell2 CMs후지필름1434
인큐사이트 줌 싸토리우스
iPS DF19-9-11T. HWiCell
IsoproterenolMilliporeSigmaCAS-51-30-9
IWP4Tocris5214
L-아스코르브산 2-인산 세스키마그네슘 염 수화물SigmaA8960-5g
L-글루타민GibcoA2916801
LS 컬럼Miltenyii Biotec130-042-401
MACS 버퍼 (autoMACS Running Buffer)Miltenyii Biotec130-091-221
MatrigelCorning354234
MitoTracker RedThermoFisherM7512
Nautilus HTS 광학 매핑 CuriBiohttps://www.curibio.com/products-overview
Nikon A1R 컨포칼 현미경Nikon
비필수 아미노산Gibco11140-050
사전 분리 필터Miltenyii Biotec130-041-407
PSC 유래 심근 세포 분리 키트, 인간Miltenyii Biotec130-110-188
PulseCuriBiohttps://www.curibio.com/products-overview
Quadro MACS 분리기 (자석)Miltenyii Biotec130-091-051
레티노산SigmaR2625
RPMI 1640 Gibco11875-093
RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine)Gibco22400-089
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyii Biotec130-107-086
TnI 항체 (pan TnI)Millipore SigmaMAB1691 
Versene (에틸렌 디아민 테트라 아세트산 - EDTA 용액)Gibco15040-066
Y-27632 dihydrochlorideTocris1254
β - 메르 캅토 에탄올Gibco21985023

참고문헌

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