인간 관절 연골 외식물에 대한 원자력 현미경 기반 미세 압입의 실제 문제 해결

Summary

원자력 현미경 미세 압입과 관련된 가장 일반적인 문제를 식별하고 해결하기 위한 단계별 접근 방식을 제시합니다. 우리는 다양한 정도의 골관절염 유발 퇴행을 특징으로 하는 토착 인간 관절 연골 외식에 대한 새로운 문제를 예시합니다.

Abstract

의심할 여지 없이 원자력 현미경(AFM)은 현재 생물학 분야에서 마이크로 및 나노 신호를 평가하는 가장 강력하고 유용한 기술 중 하나입니다. 그러나 다른 미시적 접근 방식과 마찬가지로 방법론적 문제가 발생할 수 있습니다. 특히, 시료의 특성, 시료 전처리, 기기 유형 및 압흔 프로브로 인해 원치 않는 아티팩트가 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 건강한 관절염 관절 연골 외식에 대한 이러한 새로운 문제를 예시합니다. 이를 위해 먼저 전체 조직 이식물의 대형 2D 모자이크 형광 이미징을 통해 다양한 변성 단계에 따라 생체 외 관절 연골 디스크를 생성, 등급 지정 및 시각적으로 분류하는 방법을 단계별 접근 방식으로 보여줍니다. ex vivo 모델의 가장 큰 강점은 골관절염 초기 발병부터 진행까지 골관절염 관련 변화를 조사할 수 있는 노화된 천연 인간 연골로 구성되어 있다는 것입니다. 또한 조직 준비의 일반적인 함정과 후속 데이터 분석과 함께 실제 AFM 절차도 제시됩니다. 시료 전처리 및 처리, 고급 변성으로 인한 지형학적 시료 특성, 시료-팁 상호 작용과 같은 기본적이지만 중요한 단계가 데이터 수집에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 보여줍니다. 또한 AFM에서 가장 일반적인 문제를 면밀히 조사하고 가능한 경우 이를 극복하는 방법을 설명합니다. 이러한 한계에 대한 지식은 올바른 데이터 수집, 해석 및 궁극적으로 광범위한 과학적 맥락에 결과를 포함시키는 데 가장 중요합니다.

Introduction

전자 장치 및 시스템의 크기가 계속 줄어들면서 마이크로 및 나노 기반 기술 및 장비의 급속한 발전이 탄력을 받았습니다. 그러한 장치 중 하나는 원자력 현미경 (AFM)으로, 생물학적 표면을 스캔하고 나노 및 마이크로 미터 규모 ^1,2에서 지형 또는 생체 역학 정보를 검색 할 수 있습니다. 그것의 광대한 특징 중에서, 이 공구는 각종 생물학 체계 3,4,5,6의 기계적 성질에 관하여 정보를 얻기 위하여 마이크로 뿐 아니라 nano indenter로 운영될 수 있다. 데이터는 기계적 프로브를 통해 표면과의 물리적 접촉에 의해 수집되며, 이는 팁⁷에서 약 1nm만큼 작을 수 있습니다. 샘플의 결과 변형은 캔틸레버 팁의 압흔 깊이와 샘플⁸에 가해지는 힘을 기반으로 표시됩니다.

골관절염(OA)은 관절과 주변 조직의 관절 연골이 악화되어 뼈 표면이 완전히 노출될 수 있는 장기적인 퇴행성 만성 질환입니다. OA의 부담은 상당합니다. 현재 65세 이상 여성의 절반과 남성의 1/3이 골관절염⁹을 앓고 있습니다. 외상, 비만, 그리고 그로 인한 관절(¹⁰)의 변형된 생체역학이 관절 연골 퇴행을 결정하며, 이는 일반적인 최종 결과로 간주된다. Ganz et al.의 선구적인 연구는 OA 과정의 초기 단계가 연골¹¹의 생체역학적 특성과 관련이 있을 수 있다고 가정했으며, 그 이후로 연구자들은 이 가설^{을 확인했습니다 12}. 마찬가지로, 조직의 생체역학적 특성은 세포-세포 및 세포-기질 누화뿐만 아니라 초구조적 조직에 의해 기능적으로 조정된다는 것이 일반적으로 받아들여지고 있습니다. 모든 변화는 전체 조직의 생체역학적 기능에 극적인 영향을 미칠 수 있다¹³. 현재까지 OA 진단은 임상적이며 일반 필름 방사선 촬영을 기반으로 한다¹⁴. 이 접근법은 양면성을 가지고 있다: 첫째, 골관절염의 진단을 공식화하기 위한 정의된 퇴행성 컷오프 역치가 없기 때문에 상태를 정량화하기 어렵고, 둘째, 영상 기법은 감도와 표준화가 부족하고 국소 연골 손상을 감지할 수 없다^15,16,17. 이를 위해 연골의 기계적 성질 평가는 골관절염의 병인과 무관하게 골관절염 진행 과정에서 변하는 파라미터를 설명하고, 매우 초기 단계에서 조직 기능에 직접적인 영향을 미친다는 결정적인 장점이 있습니다. 압흔 기구는 조직이 압흔에 저항하는 힘을 측정합니다. 사실 이것은 새로운 개념이 아닙니다. 가장 초기의 연구는 1980년대와 1990년대로 거슬러 올라간다. 이 기간 동안 수많은 연구에서 관절 연골의 관절경 측정을 위해 설계된 압흔 기구가 연골의 퇴행성 변화를 감지하는 데 적합할 수 있음을 시사했습니다. 30년 전에도 일부 연구에서는 압흔 기구가 관절경 검사 중 압축 강성 측정을 수행하여 조직 퇴화 중 연골 표면의 생체 내 변화를 감지할 수 있음을 입증할 수 있었습니다^18,19,20.

관절 연골의 AFM 압흔(AFM-IT)은 조직의 중추적인 기계적 특성, 즉 강성에 대한 정보를 제공합니다. 이것은 인가된 비파괴 하중과 압입된 조직 영역(²¹)의 결과적인 변형 사이의 관계를 기술하는 기계적 파라미터이다. AFM-IT는 거시적으로 영향을 받지 않는 콜라겐 네트워크에서 연령에 따른 강성 변화를 정량화할 수 있는 것으로 나타났으며, 따라서 골관절염 발병과 관련된 병리학적 변화(관절 연골의 Outerbridge 척도에서 0등급)를 구별할 수 있습니다²². 우리는 이전에 AFM-IT가 초기 연골 퇴행에 대한 이미지 기반 바이오마커로서 공간 연골 세포 조직을 기반으로 정량화할 뿐만 아니라 실제로 초기 퇴행성 기계적 변화를 정확히 찾아낼 수 있음을 보여주었습니다. 이러한 발견은 이미 다른 사람들에 의해 확인되었다^23,24. 따라서 AFM-IT는 초기 퇴행성 변화를 진단하고 식별하는 흥미로운 도구 역할을 합니다. 이러한 변화는 이미 세포 수준에서 측정될 수 있으며, OA 병태생리학적 과정에 대한 이해를 재구성할 수 있습니다.

이 프로토콜에서는 천연 연골 외식물 준비부터 AFM 데이터 수집 및 처리에 이르기까지 관절 연골 외식의 완전한 조직학적 및 생체역학적 등급 지정 절차를 보여줍니다. 단계별 접근 방식을 통해 2D 대형 모자이크 이미징 및 마이크로 AFM 압흔을 통해 다양한 퇴행 단계에 따라 관절 연골 조직을 생성, 등급 지정 및 시각적으로 분류하는 방법을 보여줍니다.

현재 AFM-IT는 연골의 생체역학적 변화를 측정하는 가장 민감한 도구 중 하나^{이지만7 다른} 도구 기법과 마찬가지로 잘못된 데이터 수집으로 이어질 수 있는 한계와 실용적인 특성²⁵이 있다. 이를 위해 연골 외출부의 심방세동 측정 중에 발생하는 가장 일반적인 문제를 면밀히 조사하고 가능한 경우 이를 최소화하거나 극복하는 방법을 설명합니다. 여기에는 샘플의 지형적 측면과 AFM 호환 환경에서 안정화하기 어려운 점, 조직 표면의 물리적 특성, 이러한 표면에서 AFM 측정을 수행하는 데 따른 어려움이 포함됩니다. 잘못된 힘-거리 곡선의 예도 제시되어 이를 유발할 수 있는 조건을 강조합니다. 캔틸레버 팁의 형상에 내재된 추가 제한 사항과 데이터 분석을 위한 Hertz 모델 사용도 논의됩니다.

Protocol

독일 튀빙겐 대학병원에서 무릎 인공관절 전치환술을 받은 환자로부터 채취한 대퇴골 과두를 사용했다. 이 연구에는 퇴행성 및 외상 후 관절 병리가 있는 환자의 관절 연골 샘플만 포함되었습니다. 연구 시작 전에 부서, 기관 및 지역 윤리 위원회의 승인을 받았습니다(프로젝트 번호 674/2016BO2). 참여하기 전에 모든 환자로부터 서면 동의서를 받았습니다.

참고: 실험 단계의 시간순 순서도는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 조직 처리 및 연골 디스크 생성

1. 조직 준비
   1. 수술 후 절제 후 연골 샘플을 5%(v/v)의 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)으로 채워진 용기에 넣습니다. 샘플이 매체에 완전히 잠겼는지 확인하십시오. 외과적 절제와 연골의 추가 처리 사이의 시간은 24시간을 초과해서는 안 됩니다. 전체 공정에서 샘플이 건조되지 않도록 미디어에 완전히 잠기도록 합니다.
   2. 메스를 사용하여 뼈에서 연골을 잘라냅니다.
2. 연골 디스크 생성
   1. 생검 펀치를 사용하여 직경 4mm의 연골 디스크를 생성합니다.
      참고: 연골층 두께가 1mm를 초과하는 과두 부위를 선택하여 절제하는 것이 중요합니다. 이는 특히 연골층이 마모 과정이나 변성으로 인해 일반적으로 두께를 잃는 하중 지지 영역 주변에서 문제가 될 수 있습니다.
   2. 기존에 생성된 4mm 연골 디스크를 맞춤형 절단 장치에 놓고 주걱으로 연골 디스크를 고정하고 안정적으로 고정합니다. 절단 장치에 연골 디스크를 놓을 때 주의를 기울여야 합니다. 연골의 최상층(관절 연골의 표피 영역)이 칼날을 향하지 않도록 샘플을 배치합니다
   3. 면도날로 연골 디스크를 자릅니다. 따라서 4mm x 1mm의 디스크 모양의 연골 샘플이 생성됩니다. 샘플 건조를 방지하려면 가능한 한 빨리 조직 절단을 수행하십시오.
   4. 주걱을 사용하여 각 디스크를 수집하고 생성된 연골 디스크를 5%(v/v) 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 1mL의 DMEM이 들어 있는 1.5mL 튜브에 넣습니다. 하나의 튜브에 약 15개의 디스크를 넣습니다.
3. 연골 디스크의 극저온 절편(수직 절편용)
   참고: 이 단계는 선택 사항이며 연골 디스크 내 세포 패턴 분포의 측면 시각화가 필요한 경우 사용할 수 있습니다. 세포 패턴의 분포는 관절 연골²⁶의 3D 특징이므로 검증 방법으로 사용할 수 있습니다. 컨포칼 현미경을 사용하여 전체 연골 디스크의 광학 절편 및 3D 재구성도 사용할 수 있으므로 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 절편할 필요가 없습니다.
   1. 연골 디스크를 수용성 임베딩 배지로 덮고 냉동 절개 손잡이의 가장자리에 놓습니다(디스크 표면이 손잡이 표면에 수직이 되도록). cryotome 장치에서 매립 매체는 저온에서 동결됩니다.
   2. 표준 빙정 토메를 사용하여 디스크 중간에 도달할 때까지(즉, 동결 절편이 4mm 길이에 도달할 때까지) 60μm 두께로 조직을 옆으로 절편하고 슬라이스를 수집합니다. 디스크 외피물을 수직으로 절편하여 연골의 모든 영역(표재, 중간, 심부)을 시각화할 수 있습니다.
   3. 유리 슬라이드에서 섹션을 수집하고 인산염 완충 식염수(PBS)로 3회 세척하여 수용성 임베딩 매체를 제거합니다.

2. 세포 공간 패턴의 함수로서의 연골 디스크 분류

1. 원반 모양의 연골 샘플의 염색
   1. 96웰 플레이트의 각 웰에 연골 디스크(섹션 1.2) 1개를 놓고 각 웰에 1:1,000으로 희석하여 130μL의 세포 투과성 형광 염료를 추가합니다.
   2. 전체 플레이트를 육안으로 검사하고 각 웰에 하나의 디스크만 배치되었는지 확인합니다. 37°C의 표준 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 30분 동안 배양합니다.
2. 60μm 연골 절편의 염색
   1. 연골 디스크 섹션(섹션 1.3)을 겸자를 사용하여 유리 현미경 슬라이드에 부드럽게 놓습니다.
   2. 핵 DAPI 대조염색이 포함된 장착 배지로 연골 부분을 덮고 형광 현미경 검사에 적합한 커버슬립을 조심스럽게 놓습니다.
   3. 각 커버슬립의 가장자리를 일반 투명 매니큐어로 밀봉하고 3분 동안 건조시킵니다.
3. 하향식(top-down) 및 측면(side-view) 연골 분류 및 이미징
   알림: 각 디스크는 형광 현미경으로 검사해야 합니다. 이 단계의 목적은 주요 셀룰러 패턴(단일 스트링, 이중 스트링, 작은 클러스터, 큰 클러스터 또는 확산)을 기반으로 디스크를 정렬하는 것입니다.
   1. 형광 현미경의 플레이트 홀더에 96웰 플레이트를 놓습니다.
   2. Em 495 nm/Ex 515 nm(섹션 2.1에서 준비한 연골 디스크의 하향식 이미징용) 또는 Em 358 nm/Ex 461nm(섹션 2.2에서 준비한 연골 절편의 측면 이미징용)와 10x 대물렌즈의 적절한 형광 필터를 선택합니다.
      참고: 10x 대물렌즈를 사용하면 디스크의 전체 둘레를 검사할 수 있으며 불균일하거나 부적절한 염색이 있는 샘플을 제외할 수 있습니다. 그러나, 하향식 관점만을 사용하는 것은 표면 침식에 의해 하향식 관찰에 가시화된 더 깊은 조직층의 분석 결과로서 세포 조직의 변화를 인식하는 결과를 초래할 수 있습니다. 예를 들어, 콜라겐 아케이드를 따르는 오름차순 문자열은 단일 세포 또는 흩어진 세포(확산 패턴)로 인식될 수 있습니다(확산 패턴)²⁶. 결과적으로, 적절한 세포 패턴 선택을 보장하기 위해 디스크의 양면을 검사해야 합니다.
   3. 각 연골 디스크에 표시되는 세포 패턴을 시각적으로 확인합니다. 디스크에 한 가지 유형의 셀룰러 패턴만 있을 가능성은 거의 없습니다. 연골세포 배열이 관심있는 패턴과 일치하지 않는 디스크 부분의 경우, 원하지 않는 패턴이 AFM 측정이 일어나지 않는 바로 주변부에 있는 경우(즉, 디스크 경계로부터 최대 0.5mm), 이것이 디스크(²⁷)의 전체 표면의 10%를 초과하지 않도록 하고^{, 28}입니다.
4. 전체 연골 디스크의 이미지 획득
   1. 현미경의 10x 대물렌즈를 선택하고 개별 연골 디스크가 포함된 미리 선택된 웰 아래에 배치합니다. 디스크에 초점을 맞추면 세포 패턴을 볼 수 있습니다.
   2. 탐색기 기능을 선택하여 전체 우물에 대한 개요를 확인합니다. 마우스 왼쪽 버튼을 사용하고 드래그하여 다른 스테이지 위치로 이동합니다. 마우스 휠을 사용하여 확대 및 축소합니다.
      참고: 이 시점에서, 전체 샘플이 있는 웰의 미리보기는 각 관심 영역을 순차적으로 두 번 클릭하여 볼 수 있습니다.
   3. 스캔할 관심 영역을 포함하는 사각형을 선택합니다. 이 시점에서 모자이크를 구성하는 모든 단일 타일이 표시됩니다.
   4. 배경에서 세포를 명확하게 시각화할 수 있도록 노출/조명 강도를 조정합니다. 이 시점에서 그림의 밝기/대비는 모든 타일에 대해 조정되었으며 더 이상 각 타일에 대해 개별적으로 사용자 지정할 수 없습니다.
      알림: 디스크 가장자리 근처의 셀은 중앙의 셀보다 더 높은 형광 신호를 방출하는 경우가 많으므로 노출/광도 설정을 조정해야 합니다.
      1. 노출 시간이 특정 채널에 적합한지 평가하려면 히스토그램에서 신호의 분포를 검토하십시오. 현미경의 이미지 소프트웨어에 포함된 자동 노출 메커니즘을 사용하여 디스크 내에 있는 모든 세포를 시각화합니다.
   5. 소프트웨어의 포커스 맵 포인트 옵션을 선택한 다음 중앙을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 각 개별 타일을 선택합니다.
   6. 포커스 맵 옵션을 선택합니다. 이전에 선택한 모든 타일이 있는 창이 표시됩니다. 목록에서 타일을 두 번 클릭하여 표시하고 적절한 초점을 맞춥니다.
   7. Z 설정을 클릭하여 초점 계획을 저장하고 다음 타일로 진행합니다. 각 개별 타일에 대한 초점 평면도를 조정한 후 스캔 시작을 눌러 이미지 획득을 시작합니다.
      1. 스캔에 더 어두운 수평 및/또는 수직 막대가 표시되는 경우 이는 단일 프레임의 부적절하고 고르지 않은 조명 때문일 수 있습니다. 실제 스캔 전에 소프트웨어에 통합된 Linked Shading 옵션을 사용하여 이 문제를 해결하십시오.
   8. 이미지를 저장하고, 내보내고, 올바르게 주석을 달 수 있습니다.

3. 연골 외식의 생체역학적 접근

1. AFM 측정을 위한 시료 전처리
   1. 생체 적합성 접착제를 사용하여 페트리 접시에 세포 패턴(섹션 2)이 포함된 미리 선택된 각 연골 디스크를 고정합니다. 디스크의 위쪽, 아래쪽, 왼쪽 및 오른쪽에 충분한 샘플 접착제를 추가합니다.
   2. L-글루타민이 없는 Leibovitz의 L-15 배지 2.5mL로 디스크를 덮습니다. Leibowitz 배지를 샘플에 부드럽게 추가하여 샘플이 매체에 의해 생성된 파동으로 인해 표면에서 분리되는 것을 방지합니다.
2. AFM에 샘플 로드
   1. AFM 장치의 샘플 홀더에 페트리 접시를 놓고 37°C로 설정된 페트리 식기 히터를 켭니다. 조직 배양 접시가 원하는 온도에 도달하도록 합니다. 이는 온도 변화로 인해 발생할 수 있는 아티팩트를 배제하기 위해 수행됩니다.
3. AFM-캔틸레버 캘리브레이션
   1. 이전에 Danalache et ^al.29에서 설명한 대로 소프트웨어 설정을 초기화합니다.
   2. 액체 측정에 적합한 유리 블록 캔틸레버 홀더를 선택하고 AFM 헤드에 조심스럽게 놓습니다. 잠금 장치가 유리 블록을 AFM 헤드에 고정합니다. 유리 블록의 반사면이 AFM 홀더와 직선이고 평행한지 확인하십시오.
   3. 캔틸레버를 유리 블록 캔틸레버 홀더 표면에 조심스럽게 놓습니다. 캔틸레버 자체는 유리 블록의 중앙에 있는 광택 처리된 광학 평면에 있어야 합니다.
   4. AFM 헤드에 중간 응결을 방지하기 위해 캔틸레버 홀더 바닥에 실리콘 스커트(실리콘 멤브레인)를 조심스럽게 놓습니다.
   5. 캔틸레버가 매체에 완전히 잠길 때까지 스테퍼 모터 기능을 사용하여 캔틸레버를 100μm 단위로 내립니다.
   6. Danalache et ^al.29에서 설명한 접근 매개변수를 사용하여 스캐너 접근 방식을 실행합니다. 페트리 접시의 바닥에 도달하면 캔틸레버를 100μm 후퇴시킵니다.
   7. 정확한 단계를 사용하여 캔틸레버를 보정하고 Danalache et ^al.29에서 설명한 매개변수를 실행합니다. 교정이 끝나면 수직 편향이 저장되고 광 다이오드 검출기에 의한 원래 등록 단위인 볼트(V)가 아닌 뉴턴(N) 힘 단위로 표시됩니다. 여기의 실험에서 보정 후 4.47nN의 설정점이 발생했습니다.
   8. 스테퍼 모터 기능을 사용하여 캔틸레버를 1,000μm로 후퇴시킵니다.
4. AFM에서 원하는 연골 측정 부위 확인
   참고: 연골 디스크의 두께가 1mm이기 때문에 캔틸레버는 샘플을 탐색하는 동안 시야에서 보이지 않습니다.
   1. 현미경의 CCD 카메라를 사용하여 캔틸레버를 식별합니다. AFM 캔틸레버는 샘플이 없는 페트리 접시 영역에 위치해야 합니다.
   2. Danalache et ^al.29에서 설명한 것과 동일한 매개변수를 사용하여 페트리 접시의 깨끗하고 샘플이 없는 영역에서 캔틸레버로 스캐너 접근 방식을 시작합니다.
   3. 스테퍼 모터 제어를 사용하여 캔틸레버를 플레이트 바닥에서 1.5mm 더 후퇴시킵니다. 이 단계는 캔틸레버와 샘플 사이의 직접적인 충돌을 피하기 위해 매우 중요합니다.
   4. 명시야(brightfield) 보기에서 형광 보기(fluorescence view)로 전환하고 디스크 상단을 시각적으로 식별할 수 있습니다.
   5. AFM s를 이동합니다.amp디스크 중앙을 향해 정확히 2mm 홀더를 놓습니다. 이 지점은 연골 디스크의 중심으로 간주됩니다.
   6. 스캐너 접근 방식을 실행하고 연골 디스크의 표면에 도달하면 캔틸레버를 100μm 후퇴시킵니다.
5. 힘-거리 곡선 측정
   1. 원하는 측정 부위에 위치한 세포에 초점을 맞춥니다. Run 버튼을 클릭하여 측정 및 목표 위치에서 힘-거리 곡선 생성을 시작합니다.
   2. 각 측정 사이트에서 5개의 힘-거리 곡선을 수집합니다. 캔틸레버를 500μm 후퇴시키고 캔틸레버를 다음 측정 장소로 이동합니다.
      알림: 캔틸레버의 수축은 연골 디스크 표면이 균일하지 않고 불규칙성이 있기 때문에 중요한 단계입니다. 시료 표면의 높은 경사면은 급격한 충돌을 일으켜 원치 않는 캔틸레버 팁/시료 손상으로 이어질 수 있습니다. 디스크 표면에 분산된 최소 5개의 서로 다른 측정 부위를 선택하고 각 부위에서 최소 5개의 힘-거리 곡선을 획득하는 것이 좋습니다.
   3. 힘-거리 곡선을 검사하고 저장합니다.
6. Hertz 피팅 모델을 사용한 영률 추정
   1. Open a Batch of Spectroscopy Curves 옵션을 사용하여 데이터 분석 소프트웨어에서 분석할 생성된 힘-거리 곡선(.jpk 파일)을 엽니다.
   2. Hertz 피팅 모델을 선택한 다음 탄성 피팅 옵션을 선택합니다.
      1. 탄성 맞춤 옵션은 선택한 힘-거리 곡선에 대해 다음 계산을 자동으로 수행합니다: 기준선을 계산하고 전체 곡선에서 빼서 기준선 오프셋을 제거합니다(기준선은 y축에서 0으로 되돌려짐). 힘-거리 곡선이 0 힘-선과 교차하는 지점을 감지하여 접촉점을 결정합니다(접촉점은 x축에서 0으로 설정됨). 팁-샘플 분리를 계산합니다(캔틸레버의 굽힘을 설명하는 피에조의 높이 신호를 뺍니다). 힘-거리 곡선을 선택한 모델에 자동으로 맞춥니다. 원하는 경우 이러한 각 단계를 독립적으로 수행할 수도 있습니다.
   3. 다음 피팅 파라미터(포아송 비율 0.5 및 적절한 캔틸레버 팁 반경)를 사용하여 조정합니다.
      알림: 구형 캔틸레버 팁이 있는 캔틸레버를 사용할 때는 Hertz 핏 모델을 사용해야 합니다. 이 연구에 사용된 캔틸레버는 반경이 5μm인 구형 팁을 가지고 있었습니다. 적용된 최대 힘(설정값)에 도달할 때까지 힘-거리 곡선을 맞추는 것이 좋습니다.
   4. 힘-거리 곡선 맞춤을 육안으로 확인하여 정확성을 확인합니다. 이 단계는 분석된 각 힘-거리 곡선에 대해 수행해야 합니다.
7. 압흔 깊이 측정
   참고: 사용 중인 데이터 분석 도구에 따라 이 프로세스가 다를 수 있습니다. 실험자는 데이터 분석 프로그램에 포함된 일련의 단계에 따라 압입 깊이를 쉽게 읽을 수 있습니다.
   1. 데이터 분석 소프트웨어에서 생성된 각 힘-거리 곡선을 열고 해석 프로세스로 Hertz 적합 모델을 선택합니다.
   2. 기준선 오프셋 빼기 옵션을 적용하여 수직 처짐 축(y축)을 0으로 만들고 오프셋 + 기울기 기능을 선택합니다.
   3. 접점 찾기 기능을 사용하여 접점을 자동으로 식별하면 자동으로 x 좌표가 0이 됩니다.
   4. Vertical Tip Position 기능을 사용하여 압입 중 원시 피에조 높이에서 캔틸레버 처짐만을 고려한 거리를 뺍니다.
   5. 탄성 맞춤(Elasticity Fit) 옵션을 선택하여 처리된 힘-거리 곡선을 표시하고 수직 팁 위치 축(x축)에서 가장 음의 값과 정렬되도록 그래프 영역을 선택합니다.
   6. 매개 변수 탭의 X Min 상자에서 들여쓰기를 읽고 문서화합니다. 결과를 저장하고 문서화합니다.

4. 통계 분석

1. 통계 소프트웨어를 엽니다. 드롭다운 메뉴에서 새 데이터 세트를 선택합니다.
2. 데이터 세트 파일을 선택한 후 변수 보기 탭을 엽니다. 각 세포 패턴 범주에 대한 수치 변수를 정의합니다: 단일 문자열 = SS, 이중 문자열 = DS, 작은 클러스터 = SC, 큰 클러스터 = BC, 확산 및 영 계수.
3. 데이터 보기 탭에서 해당 세포 패턴 범주 각각에 대해 측정된 영률 데이터를 입력합니다. 메뉴 모음에서 분석을 선택한 다음 예비 데이터 분석을 선택하여 데이터 분포를 분석합니다.
4. 영률(Young's Moduli)을 종속 변수로, 세포 패턴(Cellular Pattern)을 요인 목록으로 선택합니다. 결과 섹션에 사용된 상자 그림이 출력 파일의 결과 사이에 표시됩니다.
5. 통계 분석을 수행하려면 분석 메뉴 모음 탭의 비모수 검정 섹션에서 종속 표본 을 선택합니다. fields(필드) 탭에서 Young's Moduli(영 계수 )를 Test Fields(테스트 필드 )로, Cellular Pattern(셀룰러 패턴 )을 Groups(그룹 )로 선택합니다. Run(실행)을 누릅니다.
   참고: 결과는 출력 파일에 표시됩니다. 통계 분석을 위해 Friedman 검정이 수행됩니다.
6. 비모수 검정의 p-값을 4.4단계에서 만든 상자 그림에 통합합니다. 메뉴 모음에서 File( 파일 )을 클릭하고 Save(저장)를 선택하여 결과를 저장합니다.

Results

자체 제작한 절단 장치를 사용하여 단일 스트링(SS, 그림 2A), 이중 스트링(DS), 작은 클러스터(SC), 큰 클러스터(BC; 그림 2A) 및 확산(그림 2B). 대표적인 연골 이식은 그림 3A에 묘사되어 있습니다. 한 가지 유형의 패턴만 표시하는 디스크 선택은 하향식 형광 이미징을 사용하여 수행되었습니다(그림 2). 연골 표면 디스크의 지형적 변화는 연골 디스크에서 생성된 60μm 두께의 단면을 측면 영상으로 촬영하여 추가로 설명되었습니다(그림 2C). 이식된 골관절염 연골 디스크의 표면에는 표재성 세동과 기질 갈라짐이 있었습니다(

Discussion

진행성 다인성 질환인 골관절염은 관절 연골의 구조적, 기능적 변화를 유발합니다. 골관절염이 진행되는 동안, 기계적 특징의 손상은 관절 연골 표면의 구조적 및 생화학적 변화를 동반한다^27,31. 골관절염에서 발생하는 가장 초기의 병리학적 사건은 프로테오글리칸 고갈과 콜라겐 네트워크 붕괴이다^32,33,34. 이러한 초기의 미묘한 표면 변화는 기계적 거동이 전체 조직 깊이에 걸쳐 평균화되기 때문에 벌크 테스트로 정확히 찾아내고 식별하기가 어렵습니다. 또한 장기 및 조직 수준의 기능적 변화가 마이크로 또는 나노 규모의 구조적 및 기능적 변화와 관련이 있는지 여부는 아직 해결되지 않은 질문입니다. 이를 위해 AFM은 OA 발병과 함께 발생하는 가장 초기의 생체역학적 변...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Merck KGaA, 다름슈타트, 독일	1397-89-3
원자력 마이크로스코프(AFM) 헤드	CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, 베를린, 독일	JPK00518
생체 적합성 시료 접착제	Bruker Nano GmbH, 베를린, 독일	H000033
Calcein AM	Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA	14948	세포막 투과성 염색, 연골 디스크 분류에 사용됨- 상단 이미지
Cantilever	Bruker Nano GmbH, 베를린, 독일	SAA-SPH-5UM	주파수 Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, 길이 nom: 115μ M, 폭 NoM: 40Μ 미디엄,  기하학: 5&mu가 있는 직사각형, 원통형 팁; M 끝 반경
연골 ctting 장치	자체 제작	n/a	에 통합된 4mmx1mm CDD 카메라의 사전 정의된 전체를 포함하는 절단 플라스틱 장치
	The Imaging Source Europe GmbH, 브레멘, 독일	DFK 31BF03
CDD 카메라 형광 현미경에 통합된	Leica Biosystems DFC3000G
Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	버전 5.0.86용	데이터 처리 소프트웨어는
Dulbecco의 Modified Eagle's medium(DMEM)https://customers.jpk.com	Gibco, Life Technologies, 독일 다름슈타트	41966052
형광 현미경(Leica DMi8)	Leica Biosystems, Wetzlar, 독일	11889113
유리 블록 캔틸리버 홀더	Bruker Nano GmbH, 독일 베를린	SP-90-05	JPK PetriDishHeaterTM(Bruker)와 함께 사용하도록 특별히 설계된 각진 면이 있는 매우 긴 유리 블록.
반전 위상차 현미경 (AFM에 통합됨)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
L-glutamine이 없는 Leibovitz의 L-15 매체	Merck KGaA, 다름슈타트, 독일	F1315
현미경 유리 슬라이드	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS294775X50
DAPI	ibidi GmbH, Grä을 사용한 장착 매체; felfing, Germany	50011	연골 디스크에 사용되는 핵 DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining이 있는 마운팅 미디어  측면 이미징
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P4333
AFM(Petri Dish Heater)과 관련된 페트리 식기 히터Bruker	Nano GmbH, Berlin, Germany	T-05-0117
메스	Feather Medical Products, Osaka, Japan	2023-01
실리콘 스커트	Bruker Nano GmbH, 베를린, 독일	보호	실리콘 막 (D55x0.25)은 유리 블록의 기본 부분에 배치되어 AFM 헤드의 중간 응축을 방지합니다.
통계 프로그램 - SPSS	IBM, Armonk, New York, USA	SPSS Statistics 22	Vesion 280.0.0.0 (190)
조직 배양 접시	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, 네덜란드	SA6255012	수용성 임베딩 매체