인간 관절 연골 외식물에 대한 원자력 현미경 기반 미세 압입의 실제 문제 해결

Summary

원자력 현미경 미세 압입과 관련된 가장 일반적인 문제를 식별하고 해결하기 위한 단계별 접근 방식을 제시합니다. 우리는 다양한 정도의 골관절염 유발 퇴행을 특징으로 하는 토착 인간 관절 연골 외식에 대한 새로운 문제를 예시합니다.

Abstract

의심할 여지 없이 원자력 현미경(AFM)은 현재 생물학 분야에서 마이크로 및 나노 신호를 평가하는 가장 강력하고 유용한 기술 중 하나입니다. 그러나 다른 미시적 접근 방식과 마찬가지로 방법론적 문제가 발생할 수 있습니다. 특히, 시료의 특성, 시료 전처리, 기기 유형 및 압흔 프로브로 인해 원치 않는 아티팩트가 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 건강한 관절염 관절 연골 외식에 대한 이러한 새로운 문제를 예시합니다. 이를 위해 먼저 전체 조직 이식물의 대형 2D 모자이크 형광 이미징을 통해 다양한 변성 단계에 따라 생체 외 관절 연골 디스크를 생성, 등급 지정 및 시각적으로 분류하는 방법을 단계별 접근 방식으로 보여줍니다. ex vivo 모델의 가장 큰 강점은 골관절염 초기 발병부터 진행까지 골관절염 관련 변화를 조사할 수 있는 노화된 천연 인간 연골로 구성되어 있다는 것입니다. 또한 조직 준비의 일반적인 함정과 후속 데이터 분석과 함께 실제 AFM 절차도 제시됩니다. 시료 전처리 및 처리, 고급 변성으로 인한 지형학적 시료 특성, 시료-팁 상호 작용과 같은 기본적이지만 중요한 단계가 데이터 수집에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 보여줍니다. 또한 AFM에서 가장 일반적인 문제를 면밀히 조사하고 가능한 경우 이를 극복하는 방법을 설명합니다. 이러한 한계에 대한 지식은 올바른 데이터 수집, 해석 및 궁극적으로 광범위한 과학적 맥락에 결과를 포함시키는 데 가장 중요합니다.

Introduction

전자 장치 및 시스템의 크기가 계속 줄어들면서 마이크로 및 나노 기반 기술 및 장비의 급속한 발전이 탄력을 받았습니다. 그러한 장치 중 하나는 원자력 현미경 (AFM)으로, 생물학적 표면을 스캔하고 나노 및 마이크로 미터 규모 ^1,2에서 지형 또는 생체 역학 정보를 검색 할 수 있습니다. 그것의 광대한 특징 중에서, 이 공구는 각종 생물학 체계 3,4,5,6의 기계적 성질에 관하여 정보를 얻기 위하여 마이크로 뿐 아니라 nano indenter로 운영될 수 있다. 데이터는 기계적 프로브를 통해 표면과의 물리적 접촉에 의해 수집되며, 이는 팁⁷에서 약 1nm만큼 작을 수 있습니다. 샘플의 결과 변형은 캔틸레버 팁의 압흔 깊이와 샘플⁸에 가해지는 힘을 기반으로 표시됩니다.

골관절염(OA)은 관절과 주변 조직의 관절 연골이 악화되어 ....

Protocol

독일 튀빙겐 대학병원에서 무릎 인공관절 전치환술을 받은 환자로부터 채취한 대퇴골 과두를 사용했다. 이 연구에는 퇴행성 및 외상 후 관절 병리가 있는 환자의 관절 연골 샘플만 포함되었습니다. 연구 시작 전에 부서, 기관 및 지역 윤리 위원회의 승인을 받았습니다(프로젝트 번호 674/2016BO2). 참여하기 전에 모든 환자로부터 서면 동의서를 받았습니다.

참고: 실험 단계의 시간순 순서도는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 조직 처리 및 연골 디스크 생성

1. 조직 준비
   1. 수술 후 절제 후 연골 샘플을 5%(v/v)의 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)으로 채워진 용기에 넣습니다. 샘플이 매체에 완전히 잠겼는지 확인하십시오. 외과적 절제와 연골의 추가 처리 사이의 시간은 24시간을 초과해서는 안 됩니다. 전체 공정에서 샘플이 건조되지 않도록 미디어에 완전히 잠기도록 합니다.
   2. 메스를 사용하여 뼈에서 연골을 잘라냅니다.
2. 연골 디스크 생성
   1. 생검 펀치를 사용하....

Results

자체 제작한 절단 장치를 사용하여 단일 스트링(SS, 그림 2A), 이중 스트링(DS), 작은 클러스터(SC), 큰 클러스터(BC; 그림 2A) 및 확산(그림 2B). 대표적인 연골 이식은 그림 3A에 묘사되어 있습니다. 한 가지 유형의 패턴만 표시하는 디스크 선택은 하향식 형광 이미징을 사용하여 수행되었습니다(그림 2). 연골 표면 디스크의 지형적 변화는 연골 디스크에서 생성된 60μm 두께의 단면을 측면 영상으로 촬영하여 추가로 설명되었습니다(그림 2C). 이식된 골관절염 연골 디스크의 표면에는 표재성 세동과 기질 갈라짐이 있었습니다(

Discussion

진행성 다인성 질환인 골관절염은 관절 연골의 구조적, 기능적 변화를 유발합니다. 골관절염이 진행되는 동안, 기계적 특징의 손상은 관절 연골 표면의 구조적 및 생화학적 변화를 동반한다^27,31. 골관절염에서 발생하는 가장 초기의 병리학적 사건은 프로테오글리칸 고갈과 콜라겐 네트워크 붕괴이다^32,33,34. 이러한 초기의 미묘한 표면 변화는 기계적 거동이 전체 조직 깊이에 걸쳐 평균화되기 때문에 벌크 테스트로 정확히 찾아내고 식별하기가 어렵습니다. 또한 장기 및 조직 수준의 기능적 변화가 마이크로 또는 나노 규모의 구조적 및 기능적 변화와 관련이 있는지 여부는 아직 해결되지 않은 질문입니다. 이를 위해 AFM은 OA 발병과 함께 발생하는 가장 초기의 생체역학적 변.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Merck KGaA, 다름슈타트, 독일	1397-89-3
원자력 마이크로스코프(AFM) 헤드	CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, 베를린, 독일	JPK00518
생체 적합성 시료 접착제	Bruker Nano GmbH, 베를린, 독일	H000033
Calcein AM	Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA	14948	세포막 투과성 염색, 연골 디스크 분류에 사용됨- 상단 이미지
Cantilever	Bruker Nano GmbH, 베를린, 독일	SAA-SPH-5UM	주파수 Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, 길이 nom: 115μ M, 폭 NoM: 40Μ 미디엄,  기하학: 5&mu가 있는 직사각형, 원통형 팁; M 끝 반경
연골 ctting 장치	자체 제작	n/a	에 통합된 4mmx1mm CDD 카메라의 사전 정의된 전체를 포함하는 절단 플라스틱 장치
	The Imaging Source Europe GmbH, 브레멘, 독일	DFK 31BF03
CDD 카메라 형광 현미경에 통합된	Leica Biosystems DFC3000G
Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	버전 5.0.86용	데이터 처리 소프트웨어는
Dulbecco의 Modified Eagle's medium(DMEM)https://customers.jpk.com	Gibco, Life Technologies, 독일 다름슈타트	41966052
형광 현미경(Leica DMi8)	Leica Biosystems, Wetzlar, 독일	11889113
유리 블록 캔틸리버 홀더	Bruker Nano GmbH, 독일 베를린	SP-90-05	JPK PetriDishHeaterTM(Bruker)와 함께 사용하도록 특별히 설계된 각진 면이 있는 매우 긴 유리 블록.
반전 위상차 현미경 (AFM에 통합됨)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
L-glutamine이 없는 Leibovitz의 L-15 매체	Merck KGaA, 다름슈타트, 독일	F1315
현미경 유리 슬라이드	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS294775X50
DAPI	ibidi GmbH, Grä을 사용한 장착 매체; felfing, Germany	50011	연골 디스크에 사용되는 핵 DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining이 있는 마운팅 미디어  측면 이미징
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P4333
AFM(Petri Dish Heater)과 관련된 페트리 식기 히터Bruker	Nano GmbH, Berlin, Germany	T-05-0117
메스	Feather Medical Products, Osaka, Japan	2023-01
실리콘 스커트	Bruker Nano GmbH, 베를린, 독일	보호	실리콘 막 (D55x0.25)은 유리 블록의 기본 부분에 배치되어 AFM 헤드의 중간 응축을 방지합니다.
통계 프로그램 - SPSS	IBM, Armonk, New York, USA	SPSS Statistics 22	Vesion 280.0.0.0 (190)
조직 배양 접시	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, 네덜란드	SA6255012	수용성 임베딩 매체