2D 세포 배양 모델에서 Verteporfin 세포 독성을 향상시키기 위한 자체 제작 및 발광 다이오드 기반 광역학 치료 장치

요약

여기에서는 2차원 HeLa 세포 배양 및 베르테포르핀을 감광제로 사용하여 체외 광역학 치료(PDT) 분석을 성공적으로 수행할 수 있는 새롭고 간단하며 저렴한 장치에 대해 설명합니다.

초록

이 백서에서는 PhotoACT라는 체외 광역학 치료(PDT) 분석을 수행하기 위한 새롭고 간단하며 저렴한 장치에 대해 설명합니다. 이 장치는 기존의 프로그래밍 가능 발광 다이오드(LED), 액정 디스플레이(LCD) 모듈 및 상용 마이크로 컨트롤러 기판에 연결된 광 센서 세트를 사용하여 제작되었습니다. 프로토 타입의 박스 기반 구조는 중간 밀도 섬유판 (MDF)으로 만들어졌습니다. 내부 구획은 4개의 세포 배양 멀티웰 마이크로플레이트를 동시에 할당할 수 있습니다.

개념 증명으로 2차원(2D) 배양에서 HeLa 세포주에 대한 광민감제(PS) 베르테포르핀의 세포독성 효과를 연구했습니다. HeLa 세포를 24 시간 동안 증가하는 농도의 베르테 포르핀으로 처리했습니다. 약물-함유 상청액 배지를 버리고, 부착성 세포를 인산완충식염수(PBS)로 세척하고, 약물-없는 배지를 첨가하였다. 이 연구에서, 세포에 대한 베르테 포르 핀의 효과는 255, 255 및 255의 적색-녹색-청색 (RGB) 값 (평균 플루언스 49.1 ± 0.6 J / cm²)을 사용하여 빛에 노출되지 않거나 1 시간 동안 노출된 후 조사되었습니다. 24시간 후, 세포 생존율을 3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT) 분석에 의해 평가하였다.

실험 결과는 베르테 포르 핀으로 처리 된 세포를 장치의 빛에 노출시키는 것이 활성 산소 종 (ROS)에 의해 매개되는 메커니즘을 통해 약물의 세포 독성 효과를 향상시키는 것으로 나타났습니다. 또한이 작업에 설명 된 프로토 타입의 사용은 결과를 상용 PDT 장치와 비교하여 검증되었습니다. 따라서이 LED 기반 광 역학 치료 프로토 타입은 PDT의 체외 연구를위한 좋은 대안을 나타냅니다.

서론

가장 치명적인 비전염성 질병 중 암은 조기 사망의 세계적인 주요 원인입니다. 2020년에는 거의 1,000만 명이 사망했으며^{, 이는 전} 세계적으로 사망자 6명 중 1명에 해당합니다1. 또한 다제 내성(MDR) 현상은 승인된 화학 요법 프로토콜이 이^{임상 상태에 대한} 완화 단계에 도달하지 못하기 때문에 엄청난 공중 보건 위협을 나타냅니다2. 암세포는 여러 메커니즘을 통해 화학 요법에 대한 내성을 개발할 수 있습니다. 그러나, 일부 ATP-결합 카세트 (ABC) 수송체(ATP-의존성 유출 펌프)의 과발현은 종양 미세환경 내에서 MDR 발달의 주요 원인으로 간주된다³. MDR 외에도 재발 및 전이와 같은 다른 암 합병증은 이러한 종양학적 문제를 극복하기 위한 치료 접근법을 개발하고 개선해야 하는 긴급한 요구를 강화합니다.

빛의 치료 적 활용은 수세기 동안 실행되어 왔으며 4 광역학 요법 (PDT)은 고형 종양에 대해 임상 적으로 승인 된 치료 접근법을 나타냅니다. PDT는 광감작제(PS) 투여 후 광 조사를 결합하여 활성 산소 종(ROS)을 생성하여 종양 세포에서 선택적 세포 독성을 발휘합니다. 이 치료 접근법은 수술, 방사선 및 화학 요법을 포함한 기존의 방법보다 우수합니다⁵; 결합 조직에서 더 낮은 세포 독성을 나타내는 최소 침습적 기술입니다⁶. 종양 또는 그 미세 환경에 직접 가벼운 적용과 PS 축적은 정확한 표적화를 보장하고, 결과적으로 경미하고 바람직하지 않은 전신 부작용⁷ 및 동일한 부위에서의 반복 치료 가능성을 보장합니다. 또한 비용은 다른 접근 방식보다 저렴합니다. 그의 유망한 특징으로 인해, PDT는 단일, 특히 수술불가능한 종양의 경우 또는 보조 암 치료⁷ 모두에 적합한 옵션으로 간주될 수 있으며, 화학요법 ^8,9와 관련된 MDR에 대한 대안을 나타낸다.

PDT를 사용하여 높은 객관적 반응률을 보여주는 첫 번째 보고서는 1975 년 마우스 및 래트 모델¹⁰에서 설명되었습니다. 그 이후로, 2D 세포 배양^11,12에서 인간 종양 세포주와 함께 생체 내 및 시험관 내 모두에서 긍정적 인 결과⁷를 가진 PDT를 사용하여 연구가 수행되었습니다. 임상 적으로 승인 된 PS의 광범위한 적용 가능성을 고려할 때, 특정 축적 경로 및 흡수 피크의 파장 범위에 관계없이 일반적인 프로세스는 다음과 같습니다 : (i) PS 흡수, (ii) 종양 또는 미세 환경에서 PS 농도의 피크, (iii) 광 적용, (iv) PS- 광 상호 작용, (v) PS 여기 상태 에너지를 조직 기질 또는 주변 산소 분자로 전달, (vi) 일중항 산소 또는 슈퍼옥사이드 음이온을 수반하는 ROS 생산, (vii) 본질적으로 괴사 또는 세포자멸사멸(직접 사망), 자가포식(세포 보호 메커니즘), 조직 허혈(혈관 손상), 면역 조절 또는 이러한 메커니즘의 중첩을 통한 종양 세포 사멸⁷. 이 마지막 단계에서, 특정 세포 사멸 경로의 활성화는 세포 특성, 실험 설계 및 가장 중요하게는 PS 세포 내 국소화 및 PDT 관련 표적 손상과 같은 많은 인자에 의존한다¹³.

Verteporfin은 연령 관련 황^{반 변성을} 치료하기 위해 노르웨이와 중국에서 임상 사용을 위해 규제 기관의 승인을 받은 2세대 PS입니다7. 용량 전달 후, 이 전구약물은 미토콘드리아¹⁴에 부분적으로 축적되고 세포 단백질 티로신 인산화 및 DNA 단편화를 유도하여 종양 세포 세포사멸^15,16을 유도하는 것으로 보고되었습니다. 베르테포르핀 내재화를 위한 24시간 배양 후, 인접한 분자 ^7,17로의 전자기 방사선 전달의 효과적인 수준을 달성하기 위해 690nm 파장 셋업을 사용하는 PDT 프로토콜이 권장됩니다.

PDT의 광원과 관련하여 클래식 다이오드 레이저 시스템은 일반적으로 비싸고 기술적으로 복잡하며 크기가 커서 휴대 할 수 없습니다^18,19. LED 기반 PDT 장비에서도 관찰할 수 있는 단일 파장 프로파일의 결과로 각 감광제 응용 분야에 대한 독립적인 장치에 대한 요구로 인해 다이오드 레이저 시스템의 활용이 훨씬 더 복잡하고 경제적으로 실현 불가능해집니다^20,21. 따라서 LED 기계의 활용은 비용⁽²²) 및 유지 보수 문제뿐만 아니라 높은 전력 출력과 덜 유해한 23 및 더 넓은 조명 기능(^24,25,26,27)을 제공하는 가장 유망한 대안으로 간주됩니다.

LED 기반 장비가 PDT 실험(²⁸)에 제공할 수 있는 잠재적인 기여에도 불구하고, 대부분의 상업적 옵션은 여전히 휴대성 부족, 높은 비용, 및 복잡한 건설 프로젝트 및 운영⁽²⁹)과 같은 단점을 가지고 있다. 이 연구의 주요 목적은 체외 PDT 분석을 위한 간단하고 신뢰할 수 있는 도구를 제공하는 것이었습니다. 이 백서에서는 저렴하고 사용자 친화적이며 휴대가 가능한 자체 내장 LED 기반 PDT 장치인 PhotoACT에 대해 설명합니다. 개념 증명으로이 장치는 2D 세포 배양 모델에서 베르테 포르 핀의 세포 독성을 향상시키는 것으로 나타 났으므로 PDT 실험에서 연구 도구로 사용할 수 있습니다.

프로토콜

참고: 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 시약 및 소프트웨어와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 장치 구성

1. 3mm 두께의 중밀도 섬유판(MDF)을 톱질하여 그림 1A에 표시된 치수의 조각을 얻었습니다.
   알림: 컴퓨터 수치 제어(CNC) 절단을 위해 벡터 파일(보충 파일 1)을 사용하십시오.
2. 큰 상자의 경우 330mm x 235mm x 225mm, 작은 상자의 경우 300mm x 220mm x 150m의 치수(길이 x 너비 x 높이)로 두 개의 상자를 만듭니다(그림 1B).
3. 더 큰 상자의 뒷면을 뚫어 배럴 잭 커넥터를 설치합니다. 큰 상자의 상단과 작은 상자의 상단과 하단을 뚫어 전기 케이블을 위한 통로를 제공합니다(그림 1C).
4. 균일한 광 입사를 촉진하기 위해 모든 내부 표면을 검은색 잉크로 칠합니다(그림 1D).
5. 작은 상자의 내부 상단 표면에 각각 10개의 LED가 있는 3개의 LED 테이프를 병렬로 연결합니다(그림 1E).
6. 작은 상자의 내부 바닥 표면 중앙에 밝기 센서를 설치합니다(그림 1F).
7. 3D 프린팅 파일(보충 파일 2)을 사용하여 제어 장치(그림 1G)의 구조를 인쇄합니다.
8. 제어 장치 내부에 장착된 ESP32 제어 보드의 포트에 모든 구성 요소(전원 단추, 전위차계, 시간/시작 터치패드, LED, 밝기 센서, LCD, 부저 및 전원 공급 장치)를 설치합니다(그림 2).
9. 프로그래밍 코드(보충 파일 3, 보충 파일 4 및 보충 파일 5)를 업로드하고 테스트를 실행하여 모든 연결이 작동하는지 확인합니다(그림 1H).
10. 상자를 조립하고 함께 고정하여 틈을 방지하고 결과적으로 외부 광 간섭 및 방출되는 광 손실을 방지하십시오. 장착된 제어 장치를 프로토타입 상단의 드릴 영역에 부착합니다(그림 1I).
11. 동일한 재질과 330mm x 225mm(길이 x 너비) 치수의 전면 도어를 두 개의 작은 경첩이 있는 더 큰 상자에 고정합니다. 또한 벨크로 테이프를 더 큰 상자에 옆으로 부착하여 프로토타입 폐쇄를 강화합니다(그림 1J). 장비의 전면 도어를 조작하기 위해 핸들을 설치하십시오.
12. 프로토타입 하단에 고무 풋 패드 4개를 부착하여 작업 중 안정성을 높입니다(그림 1K).

2. 세포주 : 재배, 파종 및 처리

1. 화학 물질
   1. 포르피린을 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 용해시켜 100 mM의 농도를 달성한다.
      주의 : DMSO는 조심스럽게 조작해야합니다 (개인 보호 장비를 사용하고 통풍이 잘되는 곳에서 취급). 과도한 빛 노출을 피하기 위해 스톡 용액과 희석 용액을 조심스럽게 조작하십시오.
2. 세포주
   1. Dulbecco의 변형 독수리 배지 (DMEM) 저혈당 배지에서 10 % 태아 소 혈청과 1 % 겐타 마이신이 보충 된 HeLa 세포주를 배양하십시오.
   2. 배양 플라스크를 37°C의 5%_CO2 세포 배양 배양기에 보관한다.
   3. 80%-90% 합류에 도달할 때까지 세포를 관리하고 검사합니다.
3. 시드 과정
   1. 플라스크로부터 배양 배지를 제거한다.
   2. 세포 단층을 PBS로 세척하십시오.
   3. 융합 세포 배양물을 트립신-EDTA(0.5%) 1x로 37°C에서 5분 동안 분리합니다. 10% 태아 소 혈청과 1% 겐타마이신이 보충된 배양 배지로 세포를 재현탁시켜 트립신의 작용을 중지시킨다.
   4. 혈구계로 재현 된 세포를 세고 2.0 × 10⁴ 세포 / 웰에서 96 웰 플레이트에 시드합니다.
   5. 어둡고 밝은 조건을 위해 두 개의 판을 준비하십시오.
   6. 세포 부착을 위해 플레이트를 24시간 동안 배양합니다.
4. 치료 과정
   1. 두 96웰 플레이트에서 배지를 제거합니다.
   2. 세포를 100 μL의 증가하는 농도의 베르테포르핀(0.045 내지 24 μM, 연속 희석)으로 처리한다.
   3. 베르테포르핀 내재화를 허용하기 위해 24시간 동안 약물 치료로 세포를 배양합니다.
   4. 24시간 후, 약물을 함유하는 배지를 버리고, 세포의 단층을 PBS(100 μL)로 세척하고, 약물이 없는 배지(100 μL)를 첨가한다.
   5. 하나의 마이크로 플레이트를 알루미늄 호일로 덮어 빛 노출로부터 보호하고 24 시간 동안 배양하십시오. 이 플레이트는 PDT 결과(어두운 상태)에 대한 제어 데이터를 제공합니다. 다른 마이크로플레이트는 장치 내의 광 노출 조건에서 활용될 것이다.

3. 장치 작동

1. PDT 장치를 전기 콘센트에 꽂고 전원 단추를 눌러 켭니다.
2. 다른 마이크로플레이트(조명 상태)를 PDT 장치에 넣고 전면 도어를 벨크로 테이프로 고정하여 장비를 닫습니다.
3. 전위차계를 사용하여 RGB 구성을 조정하고(RGB 255 , 255, 255 실험) 발광 색상을 설정합니다.
   참고: 각 RGB 조합에는 특정 방출 스펙트럼이 있으며, 이는 다른 감광제 및 결과적으로 다른 흡광도 곡선을 사용한 실험을 위해 조정되어야 합니다.
4. (+)/(-) 터치패드를 눌러 시간 구성(여기서는 60분 실험)을 조정하고 분석 기간을 설정합니다.
   참고: 시간 구성은 방사 조도 값과 관련하여 공정의 플루언스(분석에 적용된 광량)를 결정합니다.
5. 디스플레이에서 설정 정보를 확인하십시오.
6. 시작 버튼을 눌러 분석을 시작합니다. 분석 시작 시 한 번의 비프음 부저가 들리는지 확인합니다.
7. 실험 과정에서 방사 조도 및 남은 시간과 같은 디스플레이의 실시간 정보를 관찰하십시오.
8. PDT 분석 중에 전면 도어를 열거나 구성을 변경하지 마십시오.
9. 분석이 끝나면 4 번의 경고음이 울리고 전자 시스템이 모든 LED를 끌 때까지 기다립니다. 디스플레이에서 실험 중에 Finished 메시지와 소비된 에너지의 최종 양(플루언스)을 관찰합니다.
   참고: 플루언스 최종 값은 방정식 (1)을 사용하여 계산됩니다.
   (1)
   여기서 F는 J/cm2이고 I는 mW/cm2 또는 mJ/s·^cm2와 같습니다. 방사 조도 값은 LED (방출원)의 효능과 어두운 챔버 (660cm 2)의 균일하게 조사 된 영역을 고려합니다 (식 [²]).
   (2)
   이론적 방사 조도 값은 전체 PDT 분석에 걸쳐 장치 디스플레이에 표시됩니다. 작업이 끝나면 방정식 (3)을 사용하여 플루언스를 계산하십시오.
   플루언스 (F) = 방사 조도 (I, 상수 값) × 작동 시간 (s ) (3)

4. 세포 생존율 분석

1. PDT 분석 후, 빛에 노출된 마이크로플레이트를 덮고 24시간 동안 배양한다.
2. 배양 기간 후, 양쪽 플레이트로부터 배양 배지를 제거하고, 세포의 단층을 PBS(100 μL)로 세척하고, MTT 용액(0.5 mg/ml, 100 μL)을 첨가한다. 포르마잔 결정 형성을 허용하기 위해 두 플레이트(어두운 조건과 밝은 조건)를 4시간 동안 배양합니다.
3. MTT 용액을 조심스럽게 제거하고 DMSO / 에탄올 (1 : 1) 용액으로 보라색 결정을 녹입니다.
4. 결정의 완전 용해 후, 595 nm에서 마이크로플레이트 리더를 이용하여 흡광도 측정을 수행한다.
   참고: 이 장치는 유세포분석법³⁰에 의한 광 노출 후 광감작제에 의해 유발된 ROS-매개 세포 사멸과 같은 다른 중요한 실험에 사용될 수 있다.

결과

PhotoACT라는 이름의 최종 PDT 장치에는 최대 4개의 멀티웰 마이크로플레이트를 할당할 수 있는 암실이 포함되어 있으며, 상부 내부 표면에는 가시광선의 뚜렷한 스펙트럼을 방출하도록 프로그래밍된 30개의 산란된 LED 세트가 장착되어 있습니다(그림 3 및 보충 파일 6). 이 장치는 PDT 분석을 위한 어두운 챔버로 설계된 내부 상자와 내부 챔버를 덮고 제어 장치를 고정하는 외부 상자의 두 가지 관련 상자를 사용하여 제작되었습니다(그림 1B). 내부 상자는 검은색으로 칠해졌고(그림 1D) 30개의 LED와 1m 길이(나중에 3개로 절단됨) 및 내장 프로세서가 있는 9와트의 LED RGB WS2812(또는 WS281B)의 테이프 모델로 구성되었습니다. 이 장치는보다 제어 된 활용도를 허용하고 결과적으로 더 정확한 색상 방출을 허용했습니다....

토론

최종 PhotoACT 장치는 총 50달러 미만의 비용으로 상업적으로 이용 가능한 저렴한 구성 요소로 구성하기에 편리했습니다. 추가적인 장점으로는 낮은 유지보수 요구, 여러 유형의 배양 플레이트를 조사할 수 있는 용량, 분석당 최대 4개의 장치를 동시에 사용할 수 있는 경량(2kg)/크기(44cm³), 휴대성, 정확하고 재현 가능한 조사(데이터는 표시되지 않음), 컴퓨터 또는 다른 기계에 연결할 필요가 없는 사용자 친화적이고 간단한 설정 인터페이스 등이 있습니다.

건설 및 운영 프로토콜의 특정 중요한 단계는 프로젝트 개념 중에 개선 기회를 야기했습니다. PDT 챔버는 균일한 발광과 일관된 에너지 측정이 필요하기 때문에 내부 및 외부 박스는 외부 광 간섭과 방출되는 광 손실을 모두 방지하기 위해 밀봉되었습니다. 추가 벨크로 테이프는 챔버 폐쇄를 강화하고 중단없는 실험을 보장하기 위해 전면 도어에 옆으로 고정되었습니다. 필요한 RGB 구성을 인증하기 위해 제어 장치...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.5% Trypsin-EDTA (10x)	Gibco	15400054	포유류 세포 배양 해리 시약
3D 프린터	Flashforge		Finder 모델
96웰 플레이트			2D 세포 배양에 사용되는 평평한 바닥 웰이 있는 비멸균, 폴리스티렌 및 고결합 표면 플레이트
Arduino
밝기 센서			0.1-40.000+ lux 감지 수준 및 I2C 인터페이스를 갖춘 TSL2561
모델 버튼
버저
세포 배양 플라스크			멸균, 폴리스티렌, 조직 배양(TC) 처리 표면이 있는 직사각형 바닥 플라스크, 경사진 넥 및 벤트 캡(크기)
원심분리기 튜브			분석
소프트웨어			SketchUp
			DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)은 다양한 포유류 세포의 성장을 지원하기 위해 널리 사용되는 기초 배지입니다.
DMSO	시그마-알드리치	D4540-500ML	디메틸 설폭사이드, ≥ 99.5% (GC), 식물 세포 배양에 적합
태아 소 혈청	Gibco		12657029 FBS는 시간 경과 계대 간에 세포 성장의 일관성을 유지하여 최고의 가치를 제공합니다.
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15750060	원래 곰팡이에서 정제된 수용성 항생제; Micromonospora purpurea. 겐타마이신은 세포 배양 오염을 방지하여 작용
Hemocytometer			Neubauer 패턴 챔버 분석의 파종 단계에서 세포 계수에 사용
Inverted Laboratory Microscope	Leica		DM IL
LED 층류 후드			작업 중에 HEPA 여과 공기의 일정한 단방향 흐름을 유지하여 오염 물질로부터 작업 환경을 보호하도록 설계된 캐빈 지역. 세포 배양 및 치료 절차의 여러 단계에서 사용되며
LCD 디스플레이
LED RGB WS2812			5050 RGB SMD 모델에 프로세서가 내장되어 있습니다. LED 30개, 길이 1m, 무게 9W,
MDF 섬유판			3mm 두께의 중간 밀도 섬유판
마이크로 원심분리기 튜브			안전 뚜껑이 있는 멸균 폴리프로필렌 튜브 및 1.5/2.0mL 용량. 분석 Microplate reader의 처리 단계에서 소량을 조작하기 위한 편리한 도구
	ThermoFischer		Multiskan FC Microplate Photometer는 넓은 파장 범위의 흡광도(340-850nm)를 검출하도록 설계되었습니다. 이 장비는 MTT 배양 후 세포 생존율을 평가하는 데 사용되었습니다.
MTT 시약	Invitrogen	M6494	3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. 세포 생존율 분석에 사용
: Operational System	, Real Time Engineers ltd.		FreeRTOS
P10 마이크 피펫			비전자식, 단일 채널, 1-10 μ L 용량
P1000 마이크로피펫			비전자, 단일 채널, 10-1000 μ L 용량
P200 마이크로피펫			비전자, 단일 채널, 20-200 μ L 용량
PDT 장비	LumaCare		모델 LC-122
인산염 완충 식염수 pH 7.4	Gibco	10010031	재배 및 분석 절차 중 세포를 세척하는 데 사용되는 균형 잡힌 소금 제형
전위차계
팁			비멸균, 유니버설 핏, 10/200/1000 μ L 최대 부피
Verteporfin	시그마-알드리치	SML0534-5MG	Verteporfin, ≥ 94%(HPLC)