여기에서 우리는 전방 난포에서 난소 세포를 식별하고 정제하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 피질 스트립의 냉동 보존을 위해 전체 난소를 처리하는 동시에 과립구, 테카, 내피, 조혈 및 기질 세포를 포함한 여러 난포 상주 세포 유형을 유리하기 위해 효소로 처리되는 온전한 전방 난포를 수확하는 방법에 대해 자세히 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
난모세포의 활성화, 성장, 발달 및 성숙은 난소의 여러 세포 유형뿐만 아니라 시상하부/뇌하수체/난소 회로 내의 여러 제어 지점에 걸쳐 조정되는 복잡한 과정입니다. 난소 내에서 여러 특수 세포 유형이 난소 난포 내의 난모세포와 밀접하게 연관되어 성장합니다. 이 세포의 생물학은 보조 생식 치료의 부산물로 쉽게 회수되는 후기 단계에서 잘 설명되었습니다. 그러나 난소에서 직접 분리된 작은 전방 난포에 대한 심층 분석은 인간 난소 조직의 부족과 보조 생식 치료를 받는 환자의 난소에 대한 제한된 접근으로 인해 일반적으로 수행되지 않습니다.
난소 상주 세포의 동시 식별/분리와 함께 피질 스트립의 냉동 보존을 위해 전체 난소를 처리하는 이러한 방법은 전방 난포 발달의 초기 단계에 대한 고해상도 분석을 가능하게 합니다. 우리는 전방 난포를 효소로 처리하고 과립구, 테카, 내피, 조혈 및 기질 세포를 분리하여 개별 세포 유형을 분리하는 프로토콜을 보여줍니다. 다양한 크기와 발달 단계에서 전방 난포에서 세포를 분리하면 난포 성장과 난소 생리학을 유도하는 세포 및 분자 메커니즘에 대한 포괄적인 분석이 가능하며 난포 미세 환경을 요약하기 위해 시험관 내에서 배양할 수 있는 생존 가능한 세포의 공급원을 제공합니다.
서론
인간 난소의 주요 기능 요소는 난모세포의 성장과 발달을 관장하는 난포입니다. 난포 세포 분리를 위한 프로토콜은 체외 수정과 관련하여 잘 확립되어 있지만, 이는 난모세포 회수 시점의 황 체 화 난포에서 세포를 채취하는 데만 적합하다1. 우리는 천연 난소 또는 이종 이식된 난소 조직에서 발생하는 다양한 발달 단계의 전방 난포에서 분리된 세포 집단을 분리할 수 있는 프로토콜을 개발했습니다2. 난모세포 배양에 대한 난포 상주 세포의 기여가 매우 중요하다는 데 동의하지만, 전향적 난포에 존재하는 독특한 표현형 아형을 전향적으로 확인하고 추출한 연구는 거의 없습니다. 다양한 발달 단계에서 특수 세포 간의 분화 계층 구조와 신호 전달에 대한 더 깊은 이해는 항상성 및 병리학적 조건에서 난소 생리학에 대한 이해를 넓힐 수 있습니다. 또한, 분리된 세포 아형의 구별 및 난포 성장/성숙에 대한 분자적 기여는 난모세포 성숙을 촉진하고 및/또는 내분비 기능 장애를 치료하기 위해 난소 기능을 재구성하는 생체 외 대리모를 생성하는 수단을 제공할 수 있습니다.
난소 내의 각각의 고유한 세포 유형은 난포의 복잡한 기능에 기여하며, 난포는 난포에 포함된 ....
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프로토콜
마우스와 관련된 모든 절차는 Weill Cornell Medicine의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 난소 조직을 이용한 모든 이종 이식 실험은 관련 지침 및 규정에 따라 수행하였다. 두 난소 모두 방사선/화학 요법의 병력이 없고 내분비 또는 생식 질환의 문서화된 병력이 없는 14세의 뇌사 장기 기증자로부터 분리되었습니다. Weill Cornell Medicine의 IRB(Institutional Review Board) 위원회는 조직 수집을 승인했으며 조직 사용에 대한 정보에 입각한 동의에 따라 장기 기증자 가족의 승인을 받았습니다.
1. 난소 조직 수집 및 취급
- 전체 난소와 관련 조직을 수집하고 멸균 식염수로 헹굽니다.
- 멸균 핀셋을 사용하여 난소를 멸균 용기에 넣으십시오. 멸균되고 완충된 차가운 용액(예: Leibovitz의 L-15 배지)을 용기에 붓습니다. 조직이 액체로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오.
- 용기를 닫고 멸균 비닐 봉지를 사용하여 두 번 봉지하십시오. 격리된 상자(예: 스티로폼) 안에 얼음 위에 용기를 운반합니다. 가능한 한 빨리, 가급적이면 5시간
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결과
우리는 난소 표면에서 난포를 분리하고 효소로 처리하여 GC와 전두강을 둘러싼 테카 및 기질 세포를 분리했습니다. 세포를 수집하고, 세포 분획을 FACS에 의해 전방 난포(직경 0.5mm에서 4mm 사이)에서 >95% 순도로 분류했습니다(그림 1).
인간 전방 난포 내의 고유한 세포 분획을 표지하고 정제하기 위해 우리는 효소 분해와 유세포 분석 분류를 결합했습니다. 우리는 이전에 난포에 상주하는 분획2를 특이적으로 표시하는 표면 단백질을 확인했습니다. 우리는 CD99(그림 1A의 빨간색)가 GC를 구체적으로 표지하고 PVRL1(그림 1A의 노란색)이 전방 난포의 크기가2로 증가함에 따라 난소 GC 구획에 점점 더 국한된다는 것을 보여.......
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토론
난소 난포 내의 세포 다양성의 더 나은 분해능은 여러 가지 이유로 임상적으로 중요합니다. 위의 프로토콜을 전방 단계 난포 내에 존재하는 고유한 표현형 아형의 분리에 적용할 때 몇 가지 요소를 고려해야 합니다. 첫째, 전방 난포가 유래된 난소 조직의 건강과 생존력은 세포의 품질과 다운스트림 적용의 성공을 결정하는 데 중요합니다. 이것은 허혈 간격을 최소화하고, 신속하게 (바람직하게는 쌍으로) 작업하고, 조직 처리 및 FACS에 사용될 실험실 공간을 준비함으로써 최적화 될 수 있습니다. 둘째, 이러한 프로토콜은 난소에서 쉽게 식별하고 추출하여 전두강에 효율적으로 접근할 수 있기 때문에 전단 난포에 매우 적합합니다. 초기 단계 및 전항 난포 연구를 위한 유사한 접근 방식은 훨씬 더 큰 이질성을 가진 세포 집단을 생성할 것입니다. 마지막으로, 난포에서 얻은 세포의 수와 질은 난포가 발달적으로 얼마나 진행되었는지, 난포가 폐쇄증 상태에 들어갔는지 여부에 따라 크게 달라집니다. 이러한 한계로 인해 난포 형성의 재건에 대한 연구가 어려워지지.......
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공개 사항
모든 저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
저자는 Queenie Victorina Neri Research Scholar Award (DJ)와 Hung-Ching Liu Research Scholar Award (LM)의 지원을 인정합니다. NLG는 NYSTEM 줄기 세포 및 재생 의학 박사후 과정 교육 보조금의 지원을 받습니다.
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참고문헌
- Aghadavod, E., et al. Isolation of granulosa cells from follicular fluid; Applications in biomedical and molecular biology experiments. Advanced Biomedical Research. 4, 250(2015).
- Man, L., et al.
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