인간 Antral Follicles에서 계통 특이적 세포의 추출, 표지 및 정제

인간 난소의 주요 기능 요소는 난모세포의 성장과 발달을 관장하는 난포입니다. 난포 세포 분리를 위한 프로토콜은 체외 수정과 관련하여 잘 확립되어 있지만, 이는 난모세포 회수 시점의 황 체 화 난포에서 세포를 채취하는 데만 적합하다¹. 우리는 천연 난소 또는 이종 이식된 난소 조직에서 발생하는 다양한 발달 단계의 전방 난포에서 분리된 세포 집단을 분리할 수 있는 프로토콜을 개발했습니다². 난모세포 배양에 대한 난포 상주 세포의 기여가 매우 중요하다는 데 동의하지만, 전향적 난포에 존재하는 독특한 표현형 아형을 전향적으로 확인하고 추출한 연구는 거의 없습니다. 다양한 발달 단계에서 특수 세포 간의 분화 계층 구조와 신호 전달에 대한 더 깊은 이해는 항상성 및 병리학적 조건에서 난소 생리학에 대한 이해를 넓힐 수 있습니다. 또한, 분리된 세포 아형의 구별 및 난포 성장/성숙에 대한 분자적 기여는 난모세포 성숙을 촉진하고 및/또는 내분비 기능 장애를 치료하기 위해 난소 기능을 재구성하는 생체 외 대리모를 생성하는 수단을 제공할 수 있습니다.

난소 내의 각각의 고유한 세포 유형은 난포의 복잡한 기능에 기여하며, 난포는 난포에 포함된 난모세포의 성장과 성숙을 촉진하는 별개의 미니 기관으로 효과적으로 기능합니다. 난포의 중심인 난모세포는 과립구 세포(GC)의 연속적인 층으로 직접 둘러싸여 있으며, 테카 세포(TC)는 난모세포 및 GC와 결합하여 난포 단위를 구성하는 세포의 2차 층을 형성합니다. 두 그룹으로 분류되지만 GC와 TC에는 수많은 하위 유형이 포함되어 있습니다. GC는 난포 내의 위치에 따라 분류됩니다. 난모세포를 둘러싸고 있는 GC와 기저막에 인접한 GC는 각각 난모세포 및 벽화 GC로 지정되며 이러한 아형은 고유한 전사체 시그니처를 나타냅니다. TC에는 스테로이드 생성, 대사 및 구조적 지원을 제공하는 기능을 하는 수많은 하위 유형이 있습니다. 내피, 혈관주위 및 면역 세포는 정상적인 난소 생리를 유지하는 데 중심적인 역할을 합니다. 난소 기질은 난포 성장의 기질 역할을 할 뿐만 아니라 TC를 유발하는 전구체의 공급원을 제공할 가능성이 높습니다. 난소 내의 세포 아형의 다층 복합체는 내분비 및 생식 기관으로서의 기능을 가능하게합니다.

이 논문은 전방 난포에서 과립구, 테카, 간질, 내피 및 조혈 세포의 식별 및 정제를 위한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 이 프로토콜을 사용하여 이러한 난소 세포를 분리하고 단일 세포 시퀀싱을 사용하여 분석한 다음 다양한 발달 단계의 난포에서 특정 염색을 수행했습니다. 이 프로토콜은 복제 가능한 간단한 방법론을 제공하며 난소의 생리학 및 병리학 모두에 대한 고해상도 분석을 가능하게 합니다.

마우스와 관련된 모든 절차는 Weill Cornell Medicine의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 난소 조직을 이용한 모든 이종 이식 실험은 관련 지침 및 규정에 따라 수행하였다. 두 난소 모두 방사선/화학 요법의 병력이 없고 내분비 또는 생식 질환의 문서화된 병력이 없는 14세의 뇌사 장기 기증자로부터 분리되었습니다. Weill Cornell Medicine의 IRB(Institutional Review Board) 위원회는 조직 수집을 승인했으며 조직 사용에 대한 정보에 입각한 동의에 따라 장기 기증자 가족의 승인을 받았습니다.

1. 난소 조직 수집 및 취급

1. 전체 난소와 관련 조직을 수집하고 멸균 식염수로 헹굽니다.
2. 멸균 핀셋을 사용하여 난소를 멸균 용기에 넣으십시오. 멸균되고 완충된 차가운 용액(예: Leibovitz의 L-15 배지)을 용기에 붓습니다. 조직이 액체로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오.
3. 용기를 닫고 멸균 비닐 봉지를 사용하여 두 번 봉지하십시오. 격리된 상자(예: 스티로폼) 안에 얼음 위에 용기를 운반합니다. 가능한 한 빨리, 가급적이면 5시간 ^3,4를 초과하지 않는 시간에 난소를 처리할 실험실로 표본을 옮깁니다.

2. 난소 조직 처리

알림: 허혈 간격을 최대한 줄이기 위해 조직이 실험실에 도착하기 전에 모든 시약과 도구가 준비되었는지 확인하십시오. 완충액은 냉동 1주일 전까지 준비할 수 있으며 사용할 때까지 냉장 보관할 수 있습니다.

1. 난소 처리 및 동결 준비
   1. 조직 처리를 준비하기 위해 생물 안전 캐비닛에 멸균 된 수술 도구를 설정하십시오 : 1 번 21 메스; 하나의 번호 11 메스; 날카로운 미세한 곡선 가위; 하나의 긴 집게 (~ 150mm 길이); 및 두 개의 중간 집게(~110mm 길이).
   2. 100 mL의 조직 처리 배지를 준비한다 ( 재료 표 참조) : 항생제 - 항 진균 용액을 함유 한 Leibovitz의 L-15 배지를 0.2 μm 필터를 사용하여 여과한다. 매체를 차갑게 유지하십시오.
   3. 극저온 액체에 라벨을 붙이고 각 바이알에 1.5mL의 냉동 용액( 재료 표 참조)을 넣고 4°C에서 보관합니다.
   4. 사용할 수 있는 6웰 플레이트를 준비하십시오.
2. 조직 도착 시
   1. 용기에 70% 에탄올 용액을 뿌리고 철저히 닦은 다음 생물 안전 캐비닛 안에 넣습니다.
   2. 멸균 장갑을 끼고 용기를 엽니 다. 난소를 멸균 된 페트리 접시에 넣고 차가운 배지 (2.1.2 단계)를 부어 조직을 수화시킵니다. 난소가 배지에 반쯤 잠겨 있는지 확인하십시오.
   3. 봉합사 또는 기타 물질을 제거하고 잔여 주변 조직을 난소에서 해부합니다.

3. 전방 모낭의 격리

1. 격리를 위해 개별 모낭을 식별하십시오. 건강한 모낭을 선택할 때 혈액이 채워져 있거나 어둡거나 대칭이 아닌 모낭은 폐쇄적일 가능성이 있으므로 제외하십시오.
2. 메스를 사용하여 전체 난소에서 선택한 전방 난포를 분리하고 난포를 둘러싸고 있는 피질 조직을 절제하여 전두부를 온전하게 유지합니다.
3. 절제된 각각의 온전한 전방 난포를 6-웰 플레이트의 한 웰에 놓습니다. 설명 목적으로 필요한 경우 접시 아래에 있는 자를 사용하여 모낭 직경을 결정합니다.
4. 메스를 사용하여 손상되지 않은 전방 난포를 이등분하여 전방강에 접근하고 4mL의 효소 세포 분리 배지를 추가합니다. 플레이트를 5%_CO2 및 37°C에서 10분 동안 가습된 인큐베이터에서 인큐베이션한다.
5. 필요에 따라 추가 antral follicles의 추출을 반복하십시오.

4. 난포 상주 세포의 분리

1. 배양 후, 20% FBS를 함유한 사용 가능한 배지 4mL를 추가하고, P1,000 마이크로피펫으로 이등분된 모낭 위에 배지를 반복적이고 격렬하게 피펫팅하여 플러시합니다.
2. 매체를 수집하고 100μm 필터를 통과시킵니다.
3. 여과된 상층액을 300 × g 및 4°C에서 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 흡인하고 라벨링 및 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 위해 세포 펠릿(GC가 풍부함)을 얼음 위에 보관합니다.
4. 균형 잡힌 식염수(예: 행크스)에 희석된 콜라게나제(100U/mL)와 디스파아제(1U/mL)의 혼합물에 나머지 조직을 넣고 5%_CO2 및 37°C에서 30분 동안 배양하고, 10분 및 20분 후에 두 번 분쇄 및 격렬한 피펫팅(즉, 10-15회 피펫 팁 통과)을 통해 조직을 기계적으로 파괴합니다.
5. 조직이 포함된 배지를 회수하고 P1,000 마이크로피펫 팁을 통해 피펫팅을 통해 세척하고 100μm 필터를 통해 걸러냅니다.
6. 300 × g 및 4 °C에서 3 분 동안 원심 분리. 상층액을 흡인하고 라벨링 및 FACS를 위해 얼음 위에 세포 펠릿(TC 및 기질 세포가 풍부함)을 따로 보관합니다.

5. 형광 활성화 세포 분류

1. 세포 펠릿을 블로킹 용액(PBS + 0.1% FBS)에 재현탁하고, 4°C에서 10분 동안 인큐베이션한다.
2. 300 × g 및 4°C에서 3분 동안 원심분리하고, 상층액을 흡인한다.
3. 직접 접합된 항체를 포함하는 블로킹 용액에 세포 펠릿을 재현탁하고(GC 및 TC를 식별하기 위한 적절한 항체 조합은 표 1 참조) 얼음에서 10분 동안 배양합니다.
4. 세포를 세척하고 300 × g 및 4°C에서 3분 동안 원심분리한다. 4′,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 함유하는 FACS 완충액에 세포를 재현탁하고 FACS 기기를 통해 세포 현탁액을 실행하여 게이팅을 위한 형광단 접합 항체의 형광 강도를 사용하여 작은 세포 집단(500-1,000)을 캡처합니다.
5. 고유한 하위 모집단을 식별하려면 다음 게이팅 전략을 활용합니다.
   1. GC의 정제를 위해 CD45+ 세포 주위에 게이트를 그리고(그림 1B), CD99⁺ 개체군에서 이 개체군을 제외합니다(그림 1A 및 그림 1C). 그런 다음 나머지 CD99⁺ 분획을 PVRL^+/- 분획으로 추가로 세분화합니다(그림 1A 및 그림 1C).
   2. TC 및 간질의 정제를 위해 총 ENG+(그림 1A) 또는 CD55+(그림 1D) 집단을 게이트하여 CD34+ 내피 분획(그림 1E)을 제외하고 스테로이드성(ANPEP⁺) 및 비스테로이드성(ANPEP^-) 세포를 구별합니다. 방출 스펙트럼에 가까운 형광단 사이의 블리드스루(bleed-through)를 보상하도록 주의하십시오.
6. 분류된 세포 분획의 순도를 검증하려면 FACS 기기를 통해 총 포획 부피의 5%를 실행하고 세포가 예상 게이트를 채우고 >95% 순도로 존재하는지 확인합니다.

6. 난소 피질 조직의 처리

1. 난소의 나머지 부분을 이등분하고 난소 피질이 손상되지 않도록 주의하면서 구부러진 가는 가위와 메스를 사용하여 수질을 절제합니다.
2. 최소한의 수질이 남을 때까지 부드럽게 긁어 난소 피질을 계속 처리하고 얇게 만듭니다. 필요한 최소한의 힘을 사용하십시오.
   참고: 피질 조직 두께는 1mm에서 1.5mm 사이여야 합니다.
3. 피질 조직을 난소 길이를 따라 2-3mm 너비의 스트립으로 나눕니다.

7. 난소 조직이 천천히 얼어붙는다

1. 냉동 준비
   1. 냉동 용액이 들어 있는 각 냉장 극저온 바이알에 하나의 피질 스트립을 놓습니다.
   2. 피질 스트립을 함유하는 극저온 바이알을 4°C에서 20분 동안 회전 플레이트 상에서 흔든다.
2. 난소 조직의 느린 동결⁵
   1. 난소 조직이 포함된 cryovials를 0°C에서 시작하도록 설정된 프로그래밍 가능한 냉동고에 넣습니다.
   2. -7 °C까지 2 °C/min의 속도로 냉각합니다.
   3. 이 온도에서 10분 동안 극저온 난소를 유지합니다.
   4. 액체 질소(LN₂)에 잠깐 담근 면봉으로 각 극저온 부분을 만져 얼음 결정 형성을 핵화합니다.
   5. 샘플 온도가 -40°C에 도달할 때까지 0.3°C/min의 속도로 냉각합니다.
   6. 샘플 온도가 -140°C에 도달할 때까지 냉각 속도를 10°C/min으로 높입니다.
   7. LN₂에 보관하기 위해 극저온 이온을 옮깁니다.

우리는 난소 표면에서 난포를 분리하고 효소로 처리하여 GC와 전두강을 둘러싼 테카 및 기질 세포를 분리했습니다. 세포를 수집하고, 세포 분획을 FACS에 의해 전방 난포(직경 0.5mm에서 4mm 사이)에서 >95% 순도로 분류했습니다(그림 1).

인간 전방 난포 내의 고유한 세포 분획을 표지하고 정제하기 위해 우리는 효소 분해와 유세포 분석 분류를 결합했습니다. 우리는 이전에 난포에 상주하는 분획2를 특이적으로 표시하는 표면 단백질을 확인했습니다. 우리는 CD99(그림 1A의 빨간색)가 GC를 구체적으로 표지하고 PVRL1(그림 1A의 노란색)이 전방 난포의 크기가2로 증가함에 따라 난소 GC 구획에 점점 더 국한된다는 것을 보여주었습니다. 우리는 또한 엔도글린(ENG, 그림 1A의 녹색) 또는 CD55(그림 1D)에 대한 항체가 모든 간질과 TC를 특이적으로 구분하고 알라닌 아미노펩티다아제(ANPEP, 그림 1E)가 안드로겐 TC에 의해 특이적으로 발현된다는 것을 보여주었습니다 2,6.

세포는 GC를 식별하기 위해 CD99에 대한 항체로 표지되었고, CD45에 대한 항체는 조혈 세포를 배제하는 데 사용되었습니다(그림 1B, C). PVRL1에 대한 항체는 GC 집단을 난소 구획과 벽화 구획으로 분리할 수 있게 했습니다(그림 1C). 콜라게나제/디스파스를 사용한 효소 분해 후, CD55(또는 대안적으로 ENG), CD34 및 ANPEP에 대한 항체로 표지된 세포 제제는 모든 간질/TC(CD55+) 및/또는 안드로겐 TC(ANPEP+), TC 집단에서 내피 세포(CD34+)를 제외하고(그림 1D,E). 이 패널과 단계적 효소 해리 프로토콜을 사용하여 갓 절제된 난소의 전방 난포에서 조혈, 내피, 과립구(난소 및 벽화) 및 테카(기질 및 안드로겐) 세포를 표지하고 정제했습니다.

그림 1: 인간 전방 난포에서 계통 특이적 세포의 표지 및 정제. (A) 전방 단계에서 인간 난포 내의 GC(CD99+ PVRL+/-) 및 TC(ENG+) 구획을 보여주는 대표적인 현미경 사진; 흰색 획 상자는 오른쪽으로 확대됩니다. (B-E) GC를 CD45-CD99+ PVRL1+/- 세포(a 및 b)뿐만 아니라 일반(CD34-, CD55+) 및 안드로겐(CD34-, CD55+ANPEP+) TC(C,D)로 식별하는 대표적인 정렬 플롯. 게이트 인구는 (B, C)와 (D, E)간에 공유됩니다. 염색되지 않은 대조군은 (B-E)의 좌측에 나타내었다. 스케일 바 = (A) 100 μm. 약어: GC = granulosa cell; TC = theca 세포; PVRL = 넥틴; ANPEP = 알라닌 아미노펩티다제; Nuc = 핵; SSC = 측면 산란; PE = 피코에리트린; APC = 알로피코시아닌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: GC, TC 및 난소 기질을 식별하는 데 사용할 수 있는 항체 목록. 약어: GC = granulosa cell; TC = theca 세포.

모든 저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.