벤치탑 기기를 사용한 전체 게놈 시퀀싱(WGS) 전략의 실현 가능성은 실험실 환경에서 공중 보건과 관련된 모든 미생물의 게놈 조사를 단순화했습니다. 박테리아 WGS에 대한 워크 플로우의 방법 론적 적응이 설명되고 분석을위한 생물 정보학 파이프 라인도 제시됩니다.
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방법 논문
전체 게놈 시퀀싱을 사용하는 Oreochromis spp. 농장에서 파생된 병원성 대장균 균주의 특성 분석
이 논문에서
정오 공지
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요약
초록
양식업은 전 세계적으로 가장 빠르게 성장하는 식품 생산 분야 중 하나이며 틸라피아 (Oreochromis spp.) 양식은 양식되는 주요 민물 고기 품종을 구성합니다. 양식 관행은 인위적 원인에서 파생 된 미생물 오염에 취약하기 때문에 광범위한 항생제 사용이 필요하며, 이로 인해 양식 시스템은 대장균 (E. coli)과 같은 임상 적 관련성의 항생제 내성 및 병원성 박테리아의 중요한 공급원이됩니다. 여기에서 내륙 양식 Oreochromis spp.에서 회수된 병원성 대장균 균주의 항균 내성, 독성, 동원체 특징은 전체 게놈 시퀀싱(WGS) 및 인실리코 분석을 통해 해명되었습니다. 항균 감수성 시험 (AST) 및 WGS를 수행하였다. 또한, 계통발생기, 혈청형, 다중위치 서열형(MLST), 획득된 항균 내성, 독성, 플라스미드 및 프로파지 함량을 다양한 사용 가능한 웹 도구를 사용하여 측정했습니다. 분리 된 대장균은 암피실린에 대한 중간 감수성만을 나타 냈으며 WGS 기반 타이핑에 의해 ONT : H21-B1-ST40 균주로 특성화되었습니다. 단일 항생제 내성 관련 유전자 만 검출되었지만 [mdf (A)], 비정형 장 병원성 대장균 (aEPEC) 병리학 형에서 여러 독성 관련 유전자 (VAG)가 확인되었습니다. 추가적으로, 큰 플라스미드 그룹 및 18개의 프로파지 관련 영역으로부터의 플라스미드 레플리콘의 화물이 검출되었다. 결론적으로, 멕시코 시날로아의 양식장에서 회수된 분리균주(aEPEC)의 WGS 특성 분석을 통해 병원성 잠재력과 무가공 양식 제품 섭취의 인체 건강 위험에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 환경 미생물을 연구하기 위해 차세대 염기서열분석(NGS) 기술을 활용하고 건강 문제가 어떻게 발생하는지 알아보기 위해 하나의 건강 프레임워크를 채택해야 합니다.
서론
양식업은 전 세계적으로 가장 빠르게 성장하는 식량 생산 분야 중 하나이며, 그 생산 관행은 인간 소비에 대한 증가하는 식량 수요를 충족시키기위한 것입니다. 전 세계 양식 생산량은 1997년 3,400만 톤(Mt)에서 2017년 112Mt로 3배 증가했습니다1. 생산량의 거의 75 %를 차지하는 주요 종 그룹은 해초, 잉어, 이매패 류, 메기 및 틸라피아 (Oreochromis spp.) 1. 그러나 집중적 인 어류 양식으로 인해 미생물 개체로 인한 질병의 출현은 불가피하여 잠재적 인 경제적 손실을 초래합니다2.
어류 양식 관행에서 항생제 사용은 생산성의 주요 제한 요소 인 박테리아 감염을 예방하고 치료하는 것으로 잘 알려져 있습니다 3,4. 그럼에도 불구하고 잔류 항생제는 양식 퇴적물과 물에 축적되어 선택적 압력을 가하고 물고기 관련 및 상주 박테리아 군집 5,6,7,8을 변형시킵니다.
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프로토콜
참고: 대장균 균 주 ACM5는 분변 대장균군(FC) 결정을 위해 어류 샘플을 처리 및 배양하여 회수되었습니다12. 어류 샘플링 동안 물고기는 질병, 박테리아 또는 곰팡이 감염의 임상 징후를 보이지 않았으며 평균 기온은 22.3 ° C였습니다. 분리 후, 분리 대장 균 을 생화학 적 테스트를 거쳐 DMSO (8 % v / v)를 냉동 보호제로 사용하여 뇌 심장 주입 (BHI) 배양액에서 동결 보존했습니다.
1. 냉동 대장균 ACM5 주식 배양의 재활성화
- 냉동 박테리아 스톡에서 튜브를 열고 멸균 루프, 피펫 팁 또는 이쑤시개를 사용하여 냉동 박테리아 배양의 표면을 긁어냅니다.
- 박테리아를 Luria-Bertani (LB) 한천 플레이트에 뿌리고 37 ± 2 ° C에서 24 시간 동안 배양하십시오.
2. 항균 감수성의 결정
참고: 여기에 설명된 항균 감수성 테스트는 임상 및 실험실 표준 연구소(CLSI) 지침(M02 Ed13:2018)
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결과
항균 감수성은 디스크 확산 방법에 의해 결정되고 6 가지 별개의 항균 클래스, 즉 아미노 글리코 시드, β- 락탐, 플루오로 퀴놀론, 니트로 퓨란, 페니콜 및 엽산 경로 길항제에 걸친 12 가지 항생제에 대한 CLSI 중단 점 기준에 의해 해석되었습니다. 대장균 ACM5는 하나의 β-락탐 약물을 제외한 모든 항생제에 민감성을 나타냈다. 4 가지 β 락탐 약물이 테스트되었습니다 : 암피실린, 카르 베니 실린, 세 팔로 틴 및 세포 탁심. 이 중에서, 암피실린에 대한 14 mm 할로 억제를 측정하였다. 따라서, 암피실린에 대한 CLSI 해석 카테고리 (감수성 : ≥17 mm; 중간 : 14-16 mm; 내성 : ≤13 mm) 32에 따르면, 대장균 ACM5는 암피실린에 대한 중간 감수성을 나타낸다.
대장균 ACM5는 벤치탑 시퀀서를 사용하여 WGS를 실시하였다. 따라서, DNA 샘플을 제조하고.......
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토론
이 연구는 병원성 대장균 변이체의 게놈 특성화를 위한 벤치탑 시퀀서와 파이프라인을 사용하여 박테리아 WGS 워크플로우의 적응을 제시합니다. 사용된 염기서열분석 플랫폼에 따라 습식 실험실 절차(박테리아 배양, gDNA 추출, 라이브러리 준비 및 염기서열분석) 및 서열 분석의 처리 시간(TAT)이 달라질 수 있으며, 특히 느리게 성장하는 박테리아를 연구하는 경우 더욱 그렇습니다. 위에서 설명한 WGS에 대한 프로토콜에 따라 TAT는 4일 이내였으며 이는 현재 문헌에 명시된 것(<5일) 34와 유사합니다.
대장균 ACM5의 게놈 시퀀싱에 대한 이론적 적용 범위는 30x로 계산되었습니다. 그럼에도 불구하고 시퀀싱은 38x 깊이에서 게놈 어셈블리에 대한 경험적 데이터를 생성했습니다. 이전에 권장된바와 같이 35, 이것은 전체 게놈 표현을 얻고 E. coli.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
호세 안토니오 마가냐-리자라가 [No. 481143]에게 수여되는 박사 장학금을 위해 멕시코 국립 과학 기술위원회 (CONACyT)에 수여됩니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Accublock Mini 디지털 드라이 배스 | Labnet | D0100 | 튜브 인큐베이션용 드라이 배스 |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | DNA 라이브러리 정제용 용액의 마그네틱 비드 |
| DeNovix DS-11 | DeNovix Inc. | gDNA에서 추출한 DNA의 품질을 확인하기 위한 UV-Vis 분광 광도계 | |
| Eppendorf | 0030108418 | DNA 라이브러리 풀링용 1.5 mL PCR 튜브 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 12321D | 마그네틱 비드 기반 DNA 정제에 사용되는 마그네틱 마이크로튜브 랙 |
| Gram-negative Multibac I.D. | 진단용 리서치(멕시코) | 항균 감수성 검사를 위한 | PT-35 |
| MiniSeq Mid Output Kit (300-cycles) | Illumina | FC-420-1004 | paired-end sequencing용 시약 카트리지(2x150) |
| MiniSeq 시스템 기기 | |||
| Eppendorf | 5452000816 | 튜브용 표준 원심분리기 | |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | 염기서열분석을 위한 DNA 라이브러리 수행용 시약. 24개 시료를 위한 Box 1 및 Box 2 시약 포함 |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 | Index set A, B, C, D |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | DNA 라이브러리 염기서열분석 용 DNA 라이브러리 제어 |
| 정밀 수조 | LabCare America | 51221081 | 세균 배양에 사용되는 수조 쉐이커 |
| Qubit 1X dsDNA HS 어세이 키트 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Q33231 | 형광 기반 DNA 정량 분석 시약 |
| Qubit 2.0 형광측정기 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Q32866 | 형광 분석기는 형광 분석에 사용됩니다. |
| Qubit 어세이 튜브 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Q32856 | 형광 기반 DNA 정량 어세이용 0.5 mL PCR 튜브 |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific | A24811 | DNA 라이브러리 증폭에 사용되는 Thermocycler |
| Spectronic GENESYS 10 Vis | Thermo | 335900 | 항균제 감수성 테스트에서 박테리아 현탁액에 사용되는 분광 광도계 |
| ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit | Zymo Research Inc. | 게놈 DNA 추출을 위한 | D4300 |
참고문헌
- Naylor, R. L., et al. A 20-year retrospective review of global aquaculture. Nature. 591 (7851), 551-563 (2021).
- Quesada, S. P., Paschoal, J. A. R., Reyes, F. G. R. Considerations on the aquaculture development and on the use....
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing
Posted by JoVE Editors on 2/02/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. The Authors section was updated from:
José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental
to:
José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental
