설치류 눈의 미세 해부

Summary

이 논문은 설치류의 안구 미세 해부에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이 과정에는 니티팅 멤브레인(즉, 세 번째 눈꺼풀)과 함께 안구의 적출술이 포함됩니다. 그런 다음 후방 안구 컵과 전방 안구 컵을 분리합니다.

Abstract

설치류 눈의 안구 미세 박리는 전방 및 후방 안구를 얻기 위해 부착된 니티팅 막 또는 세 번째 눈꺼풀과 함께 적출된 안구를 분할하는 것을 포함합니다. 이 기술을 사용하면 각막 조직, 신경 조직, 망막 색소 상피(RPE) 조직 및 수정체를 포함한 눈의 하위 부분을 특정 안구 조직의 전체 마운트, 냉동 절개 및/또는 단일 세포 현탁액에 대해 얻을 수 있습니다. 세 번째 눈꺼풀의 존재는 눈의 방향 유지에 도움이 되기 때문에 독특하고 중요한 이점을 제공하며, 이는 국소 개입 후 또는 눈의 공간 지형과 관련된 안구 분석과 관련된 연구에서 눈 생리학을 이해하는 데 중요합니다.

이 방법에서는 외안근을 조심스럽게 천천히 절단하고 시신경을 절단하여 세 번째 눈꺼풀과 함께 소켓의 안구를 적출했습니다. 안구는 마이크로 블레이드를 사용하여 각막 윤부를 관통했습니다. 절개 부위를 진입 지점으로 사용하여 절개 지점을 통해 미세 가위를 삽입하여 각막-공막 접합부를 따라 절단할 수 있었습니다. 컵이 분리될 때까지 원주를 따라 작고 연속적인 절단이 이루어졌습니다. 이들은 신경 망막 및 RPE 층을 얻기 위해 Colibri 봉합 겸자를 사용하여 신경 망막의 반투명 층을 부드럽게 벗겨냄으로써 추가로 해부할 수 있습니다. 또한, 시신경에 도달 할 때까지 주변부에서 시신경에 수직으로 3/4 개의 등거리 절단이 이루어졌습니다. 이렇게 하면 반구형 컵이 작은 꽃 모양으로 열려 평평하게 떨어지고 쉽게 장착할 수 있습니다. 이 기술은 각막 전체 마운트 및 망막 섹션에 대해 실험실에서 사용되었습니다. 세 번째 눈꺼풀의 존재는 비강-측두엽 방향을 묘사하여 이식 후 다양한 세포 치료 개입을 연구할 수 있으므로 이러한 연구에서 시각화 및 정확한 표현에 필수적인 표적 생리학적 검증을 가능하게 합니다.

Introduction

안구 박리는 안과 연구에서 중요한 기술이며 연구자가 표적 연구를 위해 눈의 부분에 접근할 수 있도록 했습니다. 이전에 안구 연구자들은 연구를 위해 병에 걸린 개인의 안구 조직에 의존했습니다. 그러나, 수년에 걸쳐 점진적으로 증가하는 안과용 설치류 모델¹ 균주의 수는 인간 안구 조직에 대한 필요성을 감소시켰다. 이러한 마우스 균주는 안구 질환 및 중재에 대한 더 깊은 이해를 가능하게 했습니다. 그러나 그들은 또한 안구 미세 해부의 혁신적인 기술에 대한 필요성을 불러일으켰습니다. 작은 크기와 제한된 작동 영역은 안구 하위 부분에 대한 효과적인 접근을 심각하게 제한합니다. 또한, 후방 및 전방 안구재의 균질한 세포 조립으로 인해 해부 후 표적 중재를 수행하기 어렵습니다. 레이저² 및 외과 미세 해부 ^3,4의 현재 미세 해부 기술은 안구 연구의 이러한 요구 사항을 충족시키기에 부적절합니다. 레이저 미세 해부는 단일 세포 분석에 매우 효과적이지만 레이저 시술 전에 특정 조직을 미세 해부해야 합니다². 이 기술은 분자 분석을 위해 사전 해부된 조직에서 작은 관심 영역을 분리할 수 있습니다. 따라서 이 기술은 전체 마운트를 준비하거나 최적의 시각화를 위해 축 방향으로 채워진 안구 층을 분리하는 데 적합하지 않습니다.

수술 방법은 가장 널리 사용되는 기술입니다. 이 방법은 시신경⁽⁵)을 통해 눈을 고정시킨 다음 해부를 수행하는 것이다. 이 연습은 힘들고 해부 중에 구형 눈이 계속 움직이기 때문에 깨지기 쉬운 조직을 손상시킬 수 있습니다. 망막층의 다양한 부분을 분리하는 데 유익함에도 불구하고 이 기술은 해부 시 조직의 공간적 방향을 구분할 수 없습니다.

해부하는 동안 부착된 니티팅 멤브레인 또는 세 번째 눈꺼풀(그림 1)의 존재를 유지하면 독특하고 중요한 이점이 있습니다. 이 방법에서는 먼저 세 번째 눈꺼풀로 안구를 적출합니다. 그 후, 세 번째 눈꺼풀을 사용하여 눈(6)을 고정시킨다⁽도 2A). 그런 다음 각막 윤부를 통해 안구를 뚫고 절개 부위를 진입 지점으로 사용합니다(그림 2B, C). 그런 다음 아이컵을 앞뒤로 원주를 따라 절단하여 분리합니다(그림 2D-G). 후방 아이컵을 더 해부하면 신경 망막의 반투명 층을 식별하고 부드럽게 벗겨낼 수 있습니다. 그런 다음 얻어진 반구형 전방 및 후방 컵에 3개 또는 4개의 등거리 절단이 이루어지며, 이를 통해 이 꽃 모양의 컵이 슬라이드에 평평하게 떨어질 수 있습니다(그림 2H).

세 번째 눈꺼풀은 해부 중 쉽고 효율적인 취급을 지원하므로 다양한 안구층에 접근하고 전체 마운트를 생성할 때 조직의 손상을 최소화합니다. 또한, 세 번째 눈꺼풀의 존재는 시각화 중에 국소 적 개입을 찾고 검사하는 데 도움이됩니다.

우리 실험실에서 절차는 모든 성별의 P28에서 CBA/J 또는 rd1 마우스 균주에 대해 수행되었습니다. 이 절차는 동물의 모든 균주, 연령 또는 성별에 대해 수행 할 수 있으며 이러한 특성에 따라 편견이 없습니다.

동물들은 상업적 공급원으로부터 조달되었고( 재료의 표 참조) 국립 면역학 연구소(NII)의 소동물 시설(SAF)에서 유지되었습니다. 그들은 개별 환기 케이지(IVC)에 보관되었고 산성화된 오토클레이브 물과 음식에 대한 임의로 접근했습니다. 그들은 21-23 ° C에서 14 시간 / 10 시간 명암 주기로 유지되었습니다.

아래는 마우스 눈의 미세 절개를 위한 수정된 수술 방법입니다.

Protocol

이 절차는 뉴 델리 국립 면역학 연구소 (National Institute of Immunology)의 기관 동물 윤리위원회 (Institutional Animal Ethics Committee)의 승인을 받았습니다. 승인의 일련 참조 번호는 IAEC#480/18입니다. 실험은 SAF, NII의 전문 수의사의 감독하에 인도 정부 수산, 축산 및 낙농부 동물 실험 통제 및 감독 위원회의 규정 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 준비

1. 각 눈에 0.8 % tropicamide와 5 % phenylephrine 점과 용액을 떨어 뜨려 설치류의 눈을 확장시킵니다. 시술 전에 동물을 어두운 곳에 30 분 동안 두십시오.
   참고: 동물은 30분을 마친 직후 안락사되므로 진통제가 필요하지 않습니다. 동물의 눈을 어둡게 적응시키고 확장하면 관찰자가 시술 전에 안구 눈물과 손상을 확인할 수 있습니다. 또한, 팽창은 색소 안구 조직으로 작업하는 동안 유리합니다.
2. 5x 용량의 마취를 복강 내 투여하여 동물을 안락사시킵니다. 일반적인 용량은 10mg의 케타민과 1mg의 자일라진을 포함하는 PBS 200μL입니다.
   참고: 동물을 안락사시키기 위한 용량은 400-500mg/kg 체중의 케타민과 50mg/kg 체중의 자일라진을 복강 주사합니다. 체중이 20g인 일반적인 마우스의 경우 용량은 케타민 10mg(100mg/mL 케타민 원액 100μL)과 자일라진 1mg(자일라진 원액 100μL)을 포함하는 PBS 200μL입니다.
3. 페달 반사를 검사하여 자극에 대한 반응이 완전히 부족한지 확인하십시오. 심장 박동과 호흡의 부재도 중요한 지표입니다.
4. 눈에 완전히 접근할 수 있도록 마우스를 옆으로 누운 상태로 놓습니다.
5. Colibri 봉합 집게, 곡선 집게, 마이크로 블레이드(15°, 3mm 크기), 스프링 마이크로 가위 및 각진 스프링 마이크로 가위를 준비하여 시술 준비를 합니다.

2. 세 번째 눈꺼풀과 함께 마우스 눈의 적출

1. 눈에 완전히 접근할 수 있도록 마우스를 옆으로 누운 자세로 놓습니다. 집게로 바깥 쪽 눈꺼풀을 열어 세 번째 눈꺼풀을 최적으로 시각화합니다.
   참고: 니티팅 멤브레인이라고도 하는 세 번째 눈꺼풀은 비강 접선의 위쪽 모서리를 향해 위치합니다(그림 1A).
2. 세 번째 눈꺼풀을 색소 경계가 있는 작은 반투명 돌출부로 식별합니다(그림 1B).
3. 구부러진 집게를 안구 주위에 놓고 꼬집어 외부 부착물로부터 눈을 떼십시오. 이렇게하면 주변 조직에서 눈으로 출혈하는 것을 최소화 할 수 있습니다.
4. 구부러진 집게를 스프링 마이크로 가위로 교체하고 세 번째 눈꺼풀이 부착된 안구 주위를 자릅니다. 작은 연속 절단을 사용하여 주변 조직 부착물에서 안구를 분리합니다.
5. 구부러진 스프링 마이크로 가위를 안구 아래에 놓아 시신경을 절단하여 눈을 자유롭게 합니다. 안구가 안구에서 완전히 분리되었는지 확인하십시오.

3. 외부 조직 제거

1. 안락사된 마우스의 적출된 눈을 pH 7.4의 인산염 완충 식염수(PBS) 완충액이 있는 페트리 접시에 넣고 안구가 PBS에 잠기도록 페트리 접시를 채웁니다.
2. 집게를 사용하여 부착된 세 번째 눈꺼풀이 부착된 마우스의 적출된 안구를 한 손으로 고정합니다.
3. 보다 효율적인 취급을 위해 안구를 액체 매체에 매달아 두십시오. 일부 외안근이나 조직이 안구에서 떠오르기 시작합니다. 스프링 마이크로 가위를 사용하여 안구에서 잘라내어 제거하십시오.
4. 마이크로 가위를 사용하여 안구 기저부에서 시신경을 잘라내어 제거하여 전체 마운트 준비를 위해 망막을 더 잘 분리할 수 있도록 합니다.
   참고: 조직 절편을 위해 시신경을 제거할 필요는 없습니다.
5. PBS로 안구를 세척하고 조직 고정을 위해 4°C에서 최소 2시간 동안 4% 파라포름알데히드(PFA) 1mL가 들어 있는 1.5mL 튜브에 옮깁니다.
   참고: 이 단계에서 조직을 12°C에서 최대 4시간 동안 PFA에 그대로 두어 절차를 일시 중지할 수 있습니다. 그러나 살아있는 세포의 분리를 위해서는 고정 단계를 수행해서는 안되며 전체 절차를 일시 중지없이 수행해야합니다.

4. 전방 및 후방 안구를 얻기 위해 적출된 눈의 해부

1. PFA 고정 후(살아있는 세포를 채취하는 경우 안구 고정 없이 진행) 안구를 PBS가 들어 있는 페트리 접시에 옮기고 해부 현미경 아래에 두어 후속 절차를 수행합니다.
2. Colibri 봉합 집게로 세 번째 눈꺼풀을 단단히 눌러 안구를 고정합니다.
3. 마이크로 블레이드를 사용하여 윤부를 뚫어 윤부에 작은 절개를 합니다. 윤부는 각막-공막 접합부입니다. 세 번째 눈꺼풀 반대쪽에 절개를 하여 스프링 마이크로 가위의 접근 지점을 만듭니다.
   알림: 15° 및 3mm 크기의 마이크로블레이드를 사용하면 이 절개 깊이를 더 잘 제어할 수 있습니다.
4. 다음으로,이 절개를 시작점으로 사용하여 한 쌍의 미세 가위로 각막 공막 윤부의 둘레를 따라 작고 연속적인 절단을합니다. 먼저 절개 지점에서 세 번째 눈꺼풀까지 반원형의 절단을 완료합니다. 그런 다음 반대쪽에 나머지 반원 컷을 완성합니다. 마지막으로 세 번째 눈꺼풀 주위를 잘라 뒤쪽 컵과 앞쪽 컵을 분리합니다.
   알림: 관심 있는 아이컵에 따라 니티팅 멤브레인은 전방 또는 후방 아이컵에 부착된 상태로 둘 수 있습니다.
5. 집게를 사용하여 후방 컵에서 렌즈를 제거하여 신경 망막 및 망막 색소 상피(RPE) 층을 포함하는 후방 컵을 얻습니다. 따라서 수정체, 후안컵, 눈의 앞쪽 컵이 분리됩니다.
   참고: 고정되지 않은 조직으로 작업하는 경우 전방 및 후방 컵을 효소로 소화하여 각막 또는 망막 단일 세포 현탁액을 얻을 수 있습니다.
6. 조직을 고정하기 위해 이 컵을 4°C에서 12시간 동안 4% PFA 1mL가 들어 있는 1.5mL 튜브에 옮깁니다.
   참고: 고정 후 조직을 적절한 배지에 삽입할 수 있으며 각막 또는 망막 절편을 얻기 위해 냉동 절편 또는 파라핀 절편을 수행할 수 있습니다.

5. 신경 망막 및 RPE 층의 분리

1. PBS 완충액이 들어 있는 페트리 접시에 후방 컵을 다시 넣어 조직을 잠급니다.
2. 신경 망막의 존재를 확인하십시오. 이것은 컵의 주변 둘레에 부착된 착색된 RPE 층의 불투명한 층으로 시각화할 수 있습니다.
3. 집게로 세 번째 눈꺼풀을 잡고 뒤쪽 컵을 고정하고 두 번째 집게를 사용하여 주변부에서 시작하여 신경 망막을 떼어냅니다.
   알림: 조직을 손상시키지 않도록 손을 매우 부드럽고 약간 움직이는 것이 좋습니다. 시신경 출구에서 구부러진 스프링 가위를 신경 망막 아래에 삽입할 수 있으며, 그림 3과 같이 신경 망막이 부착된 상태로 남아 있는 경우 층을 완전히 해제하기 위해 절단할 수 있습니다. 선택적으로 부드러운 브러시를 사용하여 부드러운 스트로크로 망막을 풀거나 분리합니다. 그러나 조직학을 위해 망막을 수집하는 경우에는 그렇게 하는 것이 적절하지 않습니다.
   참고: 따라서 세 번째 눈꺼풀이 있는 신경 망막과 색소 RPE 층이 얻어집니다.

6. 전체 마운트를 위한 망막 및 RPE 층의 분할

1. PBS 완충액이 들어 있는 페트리 접시에 앞쪽 및 뒤쪽 컵을 다시 넣고 접시를 해부 현미경 아래에 놓습니다.
2. 세 번째 눈꺼풀을 눌러 앞쪽 컵을 고정합니다.
3. 각진 스프링 마이크로 가위를 사용하여 세 번째 눈꺼풀 옆에 있는 아이컵 직경의 약 3/4을 절단하고 주변에서 광학 중심을 향해 수직으로 절단합니다.
4. 세 번째 눈꺼풀을 잡고 첫 번째 눈꺼풀 옆에 자릅니다.
5. 두 번째 컷과 세 번째 눈꺼풀 사이에 비슷한 컷을 만듭니다.
   알림: 이러한 등거리 컷을 3개 또는 4개 하면 반구형 컵이 꽃 모양으로 열리며 평평하게 떨어지고 쉽게 장착할 수 있습니다.
6. 세 번째 눈꺼풀을 눌러 뒤쪽 컵을 고정합니다.
7. 앞쪽 컵에서 절단할 때 주어진 것과 동일한 단계(6.3-6.5단계)에 따라 뒤쪽 컵에서 3개 또는 4개의 등거리 절단을 합니다.
   참고: 5단계에서 분리된 신경 망막의 조직학을 위해 유사한 절단을 하여 표면에 평평하게 떨어지도록 합니다. 컵 중앙을 너무 깊게 자르면 잎 부분이 쉽게 떨어져 나가거나 분리될 수 있습니다.
8. 염색을 수행하고, 효과적인 시각화를 위해 조직을 전체적으로 장착한다 ^7,8.
   참고: 니티팅 멤브레인의 존재는 전체 마운트에서 아이컵의 비강 쪽에 대한 지속적인 물리적 지표 역할을 합니다. 아이컵의 세 번째 눈꺼풀이 비강/복부 방향을 나타내기 때문에 아이컵의 등쪽/복부 쪽을 구분하는 데 도움이 됩니다.

Results

병든 상태의 전방/각막 조직에서 잠재적인 림프 혈관 신생을 연구하기 위해 rd1 마우스 눈/각막 조직의 전체 마운트를 준비했습니다. 세 번째 눈꺼풀에서 부착 된 결막 조직은 각막에 림프관이 없기 때문에 양성 대조군으로 작용했습니다. 연구를 위해 각막 조직을 결막으로 해부하고 4% PFA로 고정한 후 투과화 및 차단했습니다. 그런 다음 조직을 림프 내피 마커(LYVE1)⁹에 대한 1차 항체로 염색했습니다. 그 후 Alexa Fluor 488(녹색)로 표지된 2차 항체로 인큐베이션했습니다. 대표적인 이미지(그림 4)는 형광 현미경을 사용하여 4x 및 10x에서 캡처되었습니다.

망막 형태학적, 구조적, 기능적 연구를 위해 망막 맥관 구조를 시각화하기 위해 후방 안구재의 신경 망막 전체를 준비했습니다⁷. 맥락막-RPE 층에서 신경 망막을 조심스럽게 ...

Discussion

설치류의 눈은 크기가 작고 구형이기 때문에 안구 미세 해부는 어려운 작업인 것으로 밝혀졌으며, 설치류의 눈은 효율적인 취급을 위한 혁신적인 기술이 필요하다⁸.

현재 시연된 방법에서, 적출된 마우스 안구는 효과적이고 쉬운 취급을 위해 세 번째 눈꺼풀이 부착된 상태에서 얻어집니다. 세 번째 눈꺼풀을 사용하면 안구를 완전히 고정시킬 수 있으므로 해부를 쉽고 오류를 최소화 할 수 있습니다. 또한, 제 3 눈꺼풀의 존재는 눈의 하위 부분의 방향을 묘사한다. 따라서 안구는 세 번째 눈꺼풀로 해부되어 전방 및 후방 안구를 얻습니다. 균일하고 깨끗한 절단을 허용하기 위해 가위 입구에 슬릿을 사용하면 눈의 구형 특성으로 작업하기가 더 쉬워집니다. 또한, 후방 아이컵을 추가로 해부하여 신경 망막의 반투명 층을 부드럽게 벗겨냄으로써 조직 특이적 연구를 위한 신경 망막 및 RPE 층을 얻을 수 있습니다.

또...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
아세트아미노펜(Biocetamol)	EG Pharmaceuticals		특정 카탈로그 번호 없음(현지 조달)
알칼리성 포스파타아제 키트(DEA)	Coral Clinical System, 인도		특정 카탈로그 번호 없음(현지 구매)
자동화 분석기	Tulip, Alto Santracruz, India	Screen Maaster 3000	간 기능 검사용 생화학 분석기
베타딘( 포비돈-요오드 용액)	Win-Medicare;   인도		특정 카탈로그 번호 없음 (현지 조달)
생물 안전 캐비닛 (클래스 I)	카르토스 국제; 인도		특정 카탈로그 번호 없음 (현지 조달)
명시야 현미경	올림푸스, 일본	LX51
CBA / J 근친 마우스	The Jackson Laboratory	재고 번호 000654
Cefotaxime (Taxim)	AlKem ; 인도		cefotaxime sodium injection, 특정 카탈로그 번호 없음 (현지 조달)
Cell Strainer	Sigma ; US	CLS431752
콜라겐 분해 효소 유형 I	Gibco by Life Technologies	17100-017
면봉	순수 면봉 Pvt Ltd; 인도		특정 카탈로그 번호 없음 (현지 조달)
DPX Mountant	Sigma ; US	6522
Drape Sheet	JSD Surgicals, 델리, 인도		특정 카탈로그 번호 없음(현지 조달)
Eosin Y 솔루션, 알코올	시그마 ; 미국	HT110132
집게	주요 외과; 인도		특정 카탈로그 번호 없음 (현지 조달)
가스 마취 시스템	Ugo Basile; 이탈리아	211000
Glucose	Himedia, India	GRM077
헤어 리무딩 크림 (Veet)	Reckitt Benckiser , India		특정 카탈로그 번호 없음 (현지 조달)
Hematoxylin Solution, Mayer's	Sigma ; 미국	MHS16
헤파린 나트륨 염	Himedia; 인도	RM554
양 고환 시그마에서 히알루로니다아제	; US	H6254
I.V. 캐뉼라(Plusflon)	Mediplus, 인도	Ref 1732411420
인슐린 주사기	BD ; US	REF 303060
이소플루란(Forane)	Asecia Queenborough	No B506	흡입 마취
케타민(Ketamax)	Troikaa Pharmaceuticals Ltd.		케타민 염산염 IP, 특정 카탈로그 번호 없음 (현지 조달)
Meloxicam (Melonex)	Intas Pharmaceuticals Ltd; 인도		특정 카탈로그 번호 없음 (현지 조달)
마이크로 니들 홀더 스트레이트 & 곡선	Mercian ;   잉글랜드	BS-13-8
마이크로 니들 홀더 스트레이트 & 곡선	Mercian ;   영국	BS-13-8
Microtome	Histo-Line Laboratories, 이탈리아	MRS3500
나일론 스레드	마이티; 인도		특정 카탈로그 번호 없음 (현지 조달)
파라 포름 알데히드	Himedia; India	GRM 3660
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Refresh Tears/Eyemist Gel	Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India	P3060	특정 카탈로그 번호
없음 RPMI	Himedia; 인도		특정 카탈로그 번호 없음 (현지 조달)
메스	주요 외과; 인도		특정 카탈로그 번호 없음 (현지 조달)
가위	주요 외과; 인도		특정 카탈로그 번호 없음 (현지 조달)
SGOT (ASAT) KIT	Coral Clinical System, 인도		특정 카탈로그 번호 없음 (현지 구매)
SGPT (ALAT) KIT	Coral Clinical System, 인도		특정 카탈로그 번호 없음 (현지 구매)
Shandon Cryotome E Cryostat	Thermo Electron Corporation ; 미국		특정 카탈로그 번호 없음
설탕	시그마 ; US	S0389
Surgical Blade No. 22	La Medcare, India		특정 카탈로그 번호 없음 (현지 조달)
Surgical Board	현지에서 제작		특정 카탈로그 번호 없음 (현지 조달)
Surgical White Tape	3M India ; 인도	1530-1	미세공 수술 테이프
봉합	Ethicon, Johnson & Johnson, India	NW 5047
주사기 (1ml, 26 g)	Dispo Van; 인도		특정 카탈로그 번호 없음 (현지 구매)
트리머 (클리퍼)	Philips	NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005
계량 기계	Braun		특정 카탈로그 번호 없음 (현지 구매)
William's E Media	Himedia; 인도	AT125
자일라진(자일락신)	Indian Immunologicals Limited		진정제, 마취 전, 진통제 및 근육 이완제