Method Article

인간화 효모 모델을 이용한 α-시뉴클레인 독성 및 응집을 연구하는 방법

DOI:

10.3791/64418

⸱

November 25th, 2022

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Ajou University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

α-시누클레인의 생체 내 생리학적 모델은 파킨슨병의 발병기전을 연구하고 이해하는 데 필요합니다. 인간화 효모 모델을 사용하여 α-synuclein의 세포 독성 및 응집체 형성을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

Abstract

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파킨슨 병은 두 번째로 흔한 신경 퇴행성 질환이며 잘못 접히고 응집 된 α- 시누 클레인을 포함하는 Lewy 체의 형성으로 인한 진행성 세포 사멸을 특징으로합니다. α-시누클레인은 시냅스 소포 트래피킹을 조절하는 풍부한 시냅스 전 단백질이지만 단백질성 개재물의 축적은 신경독성을 초래합니다. 최근 연구에 따르면 박테리아 샤페론을 포함한 다양한 유전적 요인이 시험관 내에서 α-시누클레인 응집체의 형성을 감소시킬 수 있음이 밝혀졌습니다. 그러나, 이를 환자에 대한 잠재적인 치료법으로 적용하기 위해 세포에서 항응집 효과를 모니터링하는 것도 중요하다. 신경 세포를 사용하는 것이 이상적이지만 이러한 세포는 다루기가 어렵고 응집 방지 표현형을 나타내는 데 오랜 시간이 걸립니다. 따라서, 생체내 항응집 활성의 추가 평가를 위해 신속하고 효과적인 생체내 도구가 필요하다. 여기에 설명된 방법은 인간 α-시누클레인을 발현하는 인간화 효모 사카로마이세스 세레비시아에에서 항응집 표현형을 모니터링하고 분석하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜은 α-시누클레인 유도 세포 독성과 세포에서 α-시누클레인 응집체 형성을 모니터링하는 데 사용할 수 있는 생체 내 도구를 보여줍니다.

Introduction

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파킨슨병(PD)은 전 세계적으로 고령화 사회에 심각한 문제입니다. α-시누클레인의 응집은 PD와 밀접한 관련이 있으며, α-시누클레인의 단백질 응집체는 질병진단을 위한 분자 바이오마커로 널리 사용됩니다1. α- synuclein은 3 개의 도메인, 즉 N 말단 지질 결합 α- 나선, 아밀로이드 결합 중심 도메인 (NAC) 및 C- 말단 산성 꼬리2를 갖는 작은 산성 단백질 (길이 140 아미노산)이다. α-synuclein의 잘못 접힘은 자발적으로 발생할 수 있으며 결국 Lewybody3라고하는 아밀로이드 응집체의 형성으로 이어집니다. α-시누클레인은 여러 면에서 PD의 발병기전에 기여할 수 있다. 일반적으로, 프로토피브릴이라고 하는 그의 비정상적이고 용해성 올리고머 형태는 시냅스 기능3을 포함한 다양한 세포 표적에 영향을 주어 신경 세포 사멸을 유발하는 독성 종으로 생각된다.

신경 퇴행성 질환을 연구하는 데 사용되는 생물학적 모델은 게놈 및 세포 생물학과 관련하여 인간과 관련이 있어야합니다. 가장 좋은 모델은 인간 신경 세포주입니다.....

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Protocol

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1. 매체 및 용액 준비

  1. 미디어 준비
    1. YPD 배지를 제조하기 위해, 50 g의 YPD 분말을dH2O에 용해시켜 1 L의 최종 부피를 만든다. 실온(RT)에서 보관하십시오.
    2. YPD 한천 배지를 만들려면 YPD 분말 50g과 한천 20g을 dH2O. 오토 클레이브 1L에 녹여 멸균하십시오. 식힌 후 페트리 접시에 붓습니다. 4 °C에서 보관하십시오.
    3. 라피노스 (SRd) -Ura 배지로 SC를 만들려면 효모 질소 염기 6.7g을 황산 암모늄과 아미노산없이 dH2O 795mL에 녹입니다. 사용하기 전에 20% 라피노스 100mL, 20% 포도당 5mL, 10x -Ura 드롭아웃 100mL를 추가합니다.
    4. SD-Ura 한천 배지를 만들기 위해, 효모 질소 염기 6.7g을 황산 암모늄과 아미노산 및 한천 20g을 800mL의 dH 2O에 녹인다. 2L 이상의 부피를 갖는 플라스크에 오토 클레이브.20% 포도당 100mL와 10x -Ura 드롭 아웃 100mL를 첨가한다. 잘 섞어 페트리 접시에 붓습니다. 4 °C에서 보관하십시오.
    5. 갈락토오스 (SG)-우라 한천 배지로 SC를 만들려면 효모 ....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

α-시누클레인의 높은 발현은 PD의 모델 시스템에서 신경 세포 사멸 및 PD와 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다. 이 연구는 α- 시누 클레인의 세포 독성과 효모에서 응집 된 α- 시누 클레인의 초점 형성을 모니터링하는 세 가지 방법을 설명합니다. 여기에서는 효모에서 α-시누클레인이 과발현되었고, 야생형 α-시누클레인의 표현형과 PD의 가족성 돌연변이체로 알려진 α-시누클레인의 3가지 변이체를 조사했습니다(그림 1 및 재료 표).

pRS426 벡터에서 GAL1 프로모터 하의 α-시누클레인 발현은 유도제로 갈락토오스를 함유하는 한천 플레이트에서 상당한 성장 지연을 보였다(그림 2). α-시누클레인 발현에 의한 성장의 차이는 액체 배양에서도 관찰되었습니다(그림 3). 두 배양 .......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간의 다양한 세포 시스템의 복잡성을 감안할 때, 인간 신경 퇴행성 질환을 연구하기위한 모델로서 효모를 사용하는 것이 유리하다. 효모를 사용하여 인간 뇌의 복잡한 세포 상호 작용을 조사하는 것은 거의 불가능하지만, 단일 세포 관점에서 효모 세포는 게놈 서열 상 동성 및 근본적인 진핵 세포 과정 8,13 측면에서 인간 세포와 높은 수준의 유사성을 갖는다. 또한, 유전자 조작의 용이성을 감안할 때, 효모는 복잡하고 까다로운 인간 시스템의 연구를 용이하게 할 수 있습니다. 따라서 효모는 진핵 세포 과정과 다양한 질병의 발병 기전을 이해하는 모델 시스템으로 널리 사용되어 왔습니다14,15,16. 특히, α-시누클레인17을 포.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

α-시누클레인을 함유한 플라스미드를 친절하게 공유해 주신 James Bardwell과 Tiago F. Outeiro에게 감사드립니다. 이창한은 한국 정부(MSIT)가 후원하는 한국연구재단(NRF)(보조금 2021R1C1C1C1011690), 교육부가 후원하는 NRF를 통한 기초과학 연구 프로그램(보조금 2021R1A6A1A10044950), 아주대학교 신임 교수 연구비로부터 자금을 지원받았다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96 웰 플레이트SPL30096
AgaroseTAESHIN0158
Bacto AgarBD Difco214010
호흡이 쉬운다양한 생명 공학BEM-1마이크로 타이터 플레이트 커버 안경 용 가스 투과성 밀봉 멤브레인
Marienfeld24 x 60 mm
배양 튜브SPL40014
큐벳ratiolab2712120
D-(+)-갈락토스시그마G0625
D-(+)-글루코스시그마G8270
D-(+)-라피노스 펜타하이드레이트대정6638-4105
인큐베이터 (쉐이킹)랩트론모델: SHI1
인큐베이터 (정적)비전 사이언티픽모델: VS-1203PV-O
LiAc시그마L6883
마이크로플레이트 리더Tecan30050303 01모델: Infinite 200 pro
멀티채널 피펫 20-200 &마이크로; LgilsonFA10011
멀티채널 피펫 2-20 &마이크로; LgilsonFA10009
올림푸스 현미경올림푸스IX-53
PEG시그마P4338평균 mol wt 3,350
PetridishSPL10090
pRS426Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. 다기능 효모 고 복제 수 셔틀 벡터. 유전자. 110 (1), 119-122 (1992).
pRS426 GAL1 promoter α - synuclein A30POuteiro, T.F. & Lindquist, S. 효모 세포는 알파 synuclein 생물학 및 병리생물학에 대한 통찰력을 제공합니다. 과학. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 프로모터 &알파;-synuclein A53TOuteiro, T.F. & Lindquist, S. 효모 세포는 알파 synuclein 생물학 및 병리생물학에 대한 통찰력을 제공합니다. 과학. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α -synuclein E46KOuteiro, T.F. & Lindquist, S. 효모 세포는 알파 synuclein 생물학 및 병리생물학에 대한 통찰력을 제공합니다. 과학. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α -synuclein WTOuteiro, T.F. & Lindquist, S. 효모 세포는 알파 synuclein 생물학 및 병리생물학에 대한 통찰력을 제공합니다. 과학. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
ReservoirSPL23050
분광 광도계eppendorf6131 05560
W303aJames Bardwell
효모 질소 베이스 w/o 아미노산Difco291940
효모 합성 드롭아웃 매체 보충제 우라실시그마Y1501
YPD콘달랩1547.00

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker's yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
  2. Surguchov, A. Intrac....

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Alpha Synuclein AggregationYeast ModelParkinson s DiseaseSynuclein ToxicityHumanized YeastProtein AggregationFluorescence MicroscopyWestern BlottingGenetic ScreeningSynaptic Vesicle Trafficking

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