전체 달팽이관을 이미지화하고 디지털화하기 위해 광시트 현미경이 개발되었습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
난청은 가장 흔한 감각 장애로, 세계보건기구(WHO)에 따르면 전 세계적으로 약 5%인 4억 3천만 명에게 영향을 미칩니다1. 노화 또는 노안은 감각신경성 난청의 주요 원인이며 유모 세포, 나선형 신경절 뉴런(SGN) 및 선조체 혈관의 손상을 특징으로 합니다. 이러한 구조는 달팽이관 내에 있으며, 달팽이관은 액체에 매달려 있고 뼈로 둘러싸인 막 조직의 복잡한 나선형 해부학적 구조를 가지고 있습니다. 이러한 특성으로 인해 조직병리학적 변화를 조사하고 정량화하는 것이 기술적으로 어렵습니다. 이러한 요구를 해결하기 위해 우리는 내이의 구조-기능 관계에 대한 연구를 용이하게 하기 위해 전체 달팽이관을 이미지화하고 디지털화할 수 있는 광시트 현미경(TSLIM)을 개발했습니다. 전체 달팽이관의 잘 정렬된 연속 절편은 3차원(3D) 볼륨 렌더링을 위한 이미지 스택과 3D 시각화 및 정량 분석(즉, 길이, 너비, 표면, 부피 및 수)을 위한 개별 구조의 분할을 생성합니다. 달팽이관은 최소한의 처리 단계(고정, 석회질 제거, 탈수, 염색 및 광학 투명화)가 필요하며, 이 모든 단계는 주사 및 투과 전자 현미경에 의한 후속 고해상도 이미징과 호환됩니다. 모든 조직이 스택에 존재하기 때문에 각 구조는 개별적으로 또는 다른 구조와 비교하여 평가할 수 있습니다. 또한 이미징은 형광 프로브를 사용하기 때문에 면역조직화학 및 리간드 결합을 사용하여 달팽이관 내의 특정 구조와 3D 부피 또는 분포를 식별할 수 있습니다. 여기에서 우리는 TSLIM을 사용하여 노화된 쥐의 달팽이관을 검사하여 유모 세포와 나선형 신경절 뉴런의 손실을 정량화했습니다. 또한 고급 분석(예: 클러스터 분석)을 사용하여 3D 부피를 따라 Rosenthal 운하에서 나선형 신경절 뉴런의 국소 감소를 시각화했습니다. 이러한 접근법은 달팽이관 내부 및 달팽이관 사이의 구조-기능 관계를 정량화하는 TSLIM 현미경의 능력을 보여줍니다.
서론
달팽이관은 포유류의 청각을 위한 말초 감각 기관입니다. 그것은 소리 진동을 감지하고 청각을 위해 뇌로 전달하도록 해부학적으로 특화된 감각 및 지지 세포를 반복하는 복잡한 나선형 해부학을 가지고 있습니다. 주요 감각 요소는 내부 및 외부 유모 세포와 세포체가 Rosenthal의 운하 내에 있는 나선형 신경절을 구성하는 신경 분포 신경 섬유입니다(그림 1). 이러한 감각 및 신경 구조는 고주파 소리가 달팽이관 기저부에서 전달되고 저주파 소리가 달팽이관 정점에서 전달되도록 강압적으로 배열되어 있습니다2. 지지 기저막의 나선형 길이를 따라 분포된 감각 세포 분포의 해부학적 지도를 세포달팽이관(cytocochleogram)3 이라고 하며, 청력도에 묘사된 바와 같이 주파수의 함수로서 청력 손실과 비교할 수 있습니다.
빽빽한 뼈로 둘러싸인 달팽이관의 막 미로는 한 번에 둘 이상의 달팽이관 구조를 검사하는 것을 기술적으로 어렵게 만듭니다. 따라서 광시트 현미경을 개발하는 이유는 3D 재구성에서 모든 달팽이관 구조를 서로에 대해 검사할 수 있도록 전체 달팽이관의 잘 정렬된 직렬 섹션을 생성하는 것입니다. Voie et ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
살아있는 동물의 모든 절차와 사용은 미네소타 대학 기관 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 검토 및 승인되었으며(프로토콜 ID #2010-38573A) 이러한 동물을 사용하는 조사관은 동물 시설에 접근하기 전에 연구 동물 자원(RAR) 수의사에 의해 철저히 훈련되고 테스트되었습니다. 이 연구에는 수컷과 암컷 마우스 모두 사용되었습니다.
1. 이미징을 위한 고정 및 조직 처리를 위한 달팽이관 제거
- CO2 흡입을 사용하여 마우스를 안락사시킵니다. 가위로 마우스의 목을 베고 뇌를 통해 등쪽 복부 절개를하여 두개골을 절개합니다. 뇌를 제거하고, 두개골의 기저복부 부분에서 둥근 수포를 식별하고, 롱거로 수포를 열고, 달팽이관을 시각화하고 제거합니다.
- 고정: 흄 후드 아래에서 5배 배율의 해부 현미경을 사용하여 이 절차를 수행합니다. 장갑과 보호복을 착용하십시오. 타원형 창에 구멍을 뚫고 날카로운 픽으로 등골을 제거하십시오. 둥근 창에 픽을 삽입하여 멤브레인에 구멍을 뚫습니다.
- 2mL의 포르말린으로 채워진 1mL 주사기에 부착된 주입 세트의 절단된 끝으로 열린 둥근 창을 덮습니다. 포르말린이 열린 타원형 창을 통해 달팽이관을 빠져나가고 있음을 확....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
이번 특집호의 주제는 달팽이관의 노화 효과를 영상화하는 것이기 때문에 어린 달팽이관(3개월령, HS2479, CBA 균주 마우스)과 노화된(23개월령, HS2521, C57 균주 마우스) 달팽이관을 예로 사용합니다. TSLIM은 인간, 포유류, 기타 설치류, 어류의 달팽이관뿐만 아니라 뇌와 같은 다른 기관의 달팽이관을 포함한 다양한 표본을 이미징할 수 있다는 점에 유의해야 합니다.
Johnson et al. 13 은 TSLIM을 사용하여 어린(3주령) CBA 마우스의 SGN에 대한 논문을 발표했습니다. 모든 SGN은 5마리의 마우스에서 계수되었으며 평균 Rosenthal의 길이가 2.0mm인 8,408-8,912개의 SGN 범위가 있었습니다. 본 연구에서, 우리는 2.0 mm의 Rosenthal의 운하 길이에 7,913 개의 SGN을 포함하는 3 개월 된 CBA 마우스에서 SGN을 계산했습니다. 23개월 된 C57BL6 마우스에는 Ros.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
달팽이관 구조 검사를 위한 광시트 현미경에 의한 광학 절편은 다른 전통적인 조직학적 방법처럼 기계적으로 파괴적이지 않으며 서로에 대한 달팽이관 구조에 대한 완전한 디지털 보기를 제공합니다. Corti14 기관의 표면 준비와 같은 이전 방법은 기저막의 길이를 따라 유모 세포 손실 지도를 제공했지만 조직이 해부되어 Corti 기관이 드러났기 때문에 SGN 손실을 평가할 수 없었습니다. 또는 달팽이관의 중간 모드 마이크로 톰 섹션은 Rosenthal 운하 전체에 걸쳐 SGN 상태의 매우 작은 샘플만을 제공합니다. TSLIM을 사용하면 모든 달팽이관 구조가 기기의 분해능 수준(즉, 세포 이하)에서 디지털화됩니다. 달팽이관의 완전한 이미지 스택을 통해 여기에 표시된 여러 달팽이관 구조의 정량화 및 시각화가 가능하며, 이는 전통적인 조직학적 방법으로는 얻을 수 없었습니다. 예를 들어, 클러스터링 알고리즘을 사용하여 본 조사는 Rosenthal의 운하 내에서 SGN 세포 밀도를 보고 정량화하고 노화.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 청각 장애 및 기타 의사 소통 장애 연구소 (National Institute on Deafness and Other Communication Disorders), 켈로그 재단 (Kellogg Foundation)의 보조금과 브리짓 스펄 (Bridget Sperl)과 존 맥코믹 (John McCormick)의 개인 기부금으로 지원되었습니다. TSLIM은 독일 일메나우 공과대학교의 Matthias Hillenbrand, Kerstin John, Meike Lawin, Michel Layher, Tobias Schroeter, Peter Schacht, Oliver Dannberg 및 Julian Wuester의 멘토(Stefan Sinzinger 및 Rene Theska)와 James Leger의 탁월한 지원으로 개발되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Amira 3D 렌더링 소프트웨어 | ThermoFisher Scientific | 주소: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433 | |
| 벤질 벤조에이트(W213810) | Sigma-Aldrich, Inc. | 주소: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Bondic | 본다이 | 주소: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 캐나다 | |
| 에탄올 95% 및 100% | 미네소타 | 주소: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455 | |
| 에틸렌디아민테트라아세트산 디소듐 염 이수화물(EDTA) (E5134) | 시그마-알드리치, Inc. | 주소: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| LabVIEW 그래픽 프로그램 및 Vision | National Instruments | 주소: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504 | |
| methyl salicylate (M6742) | Sigma-Aldrich, Inc. | 주소: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Olympus MVX10 해부 현미경 | Olympus Corp | 주소: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034 | |
| Rhodamine B isothiocynate, (283924) | 시그마-알드리치, Inc. | 주소: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Starna Flurometer Cell (3-G-20) | Starna Cells | 주소: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423 |
참고문헌
- Deafness and hearing loss. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss (2021).
- Vater, M., Kössl, M. Comparative aspects of cochlear functional organization in mammals. Hearing Research. 273 (1-2), 89-99 (2011).
- Santi, P. A., Blair, A., Bohne, B. A., Lukkes, J., Nietfeld, J.....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
