전후 난포 생성에 대한 연구를 발전시키기 위해서는 단일 난소에서 난포를 분리하는 효율적인 방법이 필요합니다. 여기에 제시된 것은 조직 초퍼와 균질화를 사용하여 소 난소에서 난포를 분리하기위한 간소화 된 기계적 프로토콜입니다. 이 방법은 단일 난소에서 많은 수의 생존 가능한 전방 난포를 수집 할 수있게합니다.
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이 논문에서
요약
초록
포유류 모낭 생성의 전체 과정을 이해하는 것은 가축, 인간 및 멸종 위기에 처한 종의 보조 생식 기술을 개선하는 데 중요합니다. 연구는 특히 소 종과 같은 대형 포유류에서 더 작은 전방 모낭의 분리가 어렵 기 때문에 대부분 전방 및 큰 전방 모낭으로 제한되었습니다. 이 연구는 단일 소 난소에서 많은 수의 작은 전방 난포를 회수하는 효율적인 접근 방식을 제시합니다. 개별 소 난소의 피질을 조직 초퍼를 사용하여 500μm 입방체로 절단하고 10mm 프로브를 사용하여 9,000-11,000rpm에서 6분 동안 균질화했습니다. 큰 파편은 치즈 천을 사용하여 균질액으로부터 분리하고, 이어서 300 μm 및 40 μm 세포 스트레이너를 통한 연속 여과하였다. 40μm 스트레이너에 남아있는 내용물을 검색 접시로 헹구어 모낭을 식별하고 배지 한 방울로 수집했습니다. 수집된 모낭의 생존력은 트리판 블루 염색을 통해 시험하였다. 이 방법은 약 90 분 안에 단일 소 난소에서 많은 수의 생존 가능한 작은 preantral 난포를 분리 할 수 있습니다. 중요하게도,이 방법은 완전히 기계적이며 모낭을 손상시킬 수있는 조직을 해리하기 위해 효소를 사용하지 않습니다. 이 프로토콜을 사용하여 얻은 난포는 RT-qPCR을 위한 RNA 분리, 특정 단백질의 면역 국소화 및 시험관 내 배양과 같은 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다.
서론
난소 난포는 난소의 기능 단위로, 배우자 (난 모세포)의 생산뿐만 아니라 생식 기능과 전반적인 건강에 중요한 호르몬을 담당합니다. 원시 난포는 태아 발달 중 또는 종1에 따라 신생아기에 난소에서 형성되며 여성의 난소 예비를 구성합니다. 여포 성장은 휴식 풀을 떠나 성장 단계로 들어가는 원시 모낭의 활성화로 시작됩니다. 전두엽 발달 이전의 모든 난포 단계를 포함하는 전안구 모낭 생성은 이 두 세포 유형 2,3 간의 긴밀한 통신에 의해 구동되는 난모세포와 주변 과립막 세포에서 동기식 형태학적 및 대사적 변화를 필요로 하는 매우 역동적인 과정입니다. Preantral 난포는 주어진 시간에 난소에서 발견되는 난포 단위의 대부분을 구성합니다4. 난포 발달 전 단계를 통한 발달은 전방 발달5,6보다 몇 주 더 긴 것으로 추정되며, 이 시기는 난모세포와 체세포가 발달의 최종 단계(즉, 항문 단계)에 진입하고 배란, 수정 및 배아 발달을 준비하기에 충분한 성숙을 얻는 데 필요합니다
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프로토콜
소(Bos taurus) 난소는 지역 도축장에서 공급되어 수집 후 6시간 이내에 실험실로 이송되었습니다. 시설에서 처리되는 동물의 수가 많기 때문에 동물의 나이, 품종 및 발정주기의 단계를 알 수 없습니다. 이 실험에는 살아있는 동물이 사용되지 않았기 때문에 승인 된 동물 관리 및 사용 프로토콜이 필요하지 않았습니다.
1. 장비 및 시약 준비
- 실험실 벤치의 2피트 너비 부분을 벤치 페이퍼로 덮습니다.
- 메스 손잡이, 멸균 메스 블레이드, 지혈제, 해부 겸자 한 쌍, 20mL 루어 잠금 주사기, 18G 바늘, 200mL 비커 2개, 500mL 삼각 플라스크, 104mm 직경의 플라스틱 깔때기, 플라스틱 도마, 처리 중인 난소당 22cm2 겹의 치즈클로스(치즈천은 사용 전에 오토클레이빙으로 멸균할 수 있음) 1개, 300 μm 세포 스트레이너 및 40 μm 세포 스트레이너 ( 재료 표 참조).
- 모든 장비를 벤치 용지로 옮깁니다.
- 지혈제를 사용하여 메스 칼날을 메스 손잡이에 끼웁니다. 블레이드의 각진 베이스를 핸들의 각진 표시기에 맞춘 다음 블레이드를 핸들의 홈에 밀어 넣습니다.
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결과
개요 및 중요 단계
이 프로토콜을 사용하면 작은 소 preantral 난포를 실험적으로 관련된 숫자로 단일 난소에서 안정적으로 분리 할 수 있습니다. 총 30 번의 반복에서 복제 당 평균 41 개의 난포가 얻어졌으며 범위는 11-135 개입니다 (그림 4A). 14번의 반복에서, 모낭은 실체현미경 하에 1 μm 현미경 보정 슬라이드를 사용하여 난포 직경을 측정함으로써 앞서26 과 같은 발달 단계를 특성화하였다. 이 방법을 사용하여 총 476개의 난포를 1차(40-79μm 크기의 난포), 초기 2차(80-119μm) 또는 2차(≥120μm) 난포(그림 4B)로 분류했습니다. 원시 모낭은 40 μm 여과 단계로 인해 제외되었다. 난포 생존율은 앞서30에 기재된 바와 같이 트리판 블루 배제 시험을 사용하여 평.......
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토론
본 프로토콜은 소 난소로부터 초기 단계의 preantral 난포, 특히 1 차 및 초기 2 차 단계에서 회수하는 재현 가능한 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 이전 보고서 20,25,30,34,35,36을 기반으로 하며 개별 난소에서 의미 있는 수의 난포를 분리하는 최적화를 제공합니다. 이 방법을 사용하여 분리된 전안구 난포는 실행 가능하며 단백질의 면역국소화 및 유전자 발현 분석을 위한 RNA 추출과 같은 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 분리된 모낭의 배양은 본 연구에서 시도되지 않았다. 그러나 현재 작은 소 전방 난포의 성공적인 장기 배양을 달성하기 위한 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 프로젝트는 USDA 다중 상태 프로젝트 W4112와 UC Davis Jastro Shields 상을 SM에 의해 부분적으로 자금을 지원받았습니다.
저자는 모든 실험에 사용 된 소 난소를 제공 한 Central Valley Meat, Inc.에 감사를 표하고 싶습니다. 저자는 또한 난소 처리 및 난포 분리에 대한 도움을 준 Olivia Silvera에게 감사드립니다.
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재료
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| #21 멸균 메스 블레이드 | Fisher Scientific | 50-365-023 | 난소를 절단하고 수질을 제거하는 데 사용됩니다 |
| 40 μ m 세포 여과기 | Fisher Scientific | 22-363-547 | 300 &mu에서 여과액을 필터링하는 데 사용됩니다. m 세포 여과기 |
| 104 mm 플라스틱 깔때기 | 피셔 사이언티픽 | 10-348C | 크기는 다를 수 있지만, 치즈 천이 적절하게 절단되고 난소 호모겐산염이 |
| 300 &mu 이상 흘러내리지 않도록 하십시오; m 세포 여과기 | pluriSelect | 43-50300-03 | 치즈 천에서 여과액을 여과하는 데 사용됩니다 |
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참고문헌
- Fortune, J. E., Yang, M. Y., Allen, J. J., Herrick, S. L. Triennial reproduction symposium: The ovarian follicular reserve in cattle: What regulates its formation and size. Journal of Animal Science. 91 (7), 3041-3050 (2013).
- Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M.
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