여기에서는 AT4G18020(APRR2)-AirID 단백질을 모델로 사용하여 오이(Cucumis sativus L.)에서 근접 라벨링(PL) 실험을 수행하기 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 벡터의 구성, 아그로인 침투를 통한 구성물의 변형, 비오틴 침투, 단백질 추출 및 친화성 정제 기술을 통한 비오틴 표지 단백질의 정제를 설명합니다.
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방법 논문
식물의 단백질-단백질 상호작용을 위한 AirID 기반 근접 라벨링
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
포유류 세포와 식물에서 변형된 아스코르브산염 과산화효소(APEX) 또는 대장균 비오틴 리가아제 BirA(BioID로 알려짐)를 사용하는 근접 표지(PL) 접근법은 단백질-단백질 상호 작용(PPI)을 식별하는 데 성공적인 것으로 입증되었습니다. APEX, BioID 및 BioID의 개정판인 TurboID는 가치 있는 기술일 뿐만 아니라 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 최근 개발된 AirID는 단백질-단백질 상호 작용에서 근접 식별을 위한 BioID의 새로운 버전으로, 이러한 제한을 극복했습니다. 기존에는 동물 모델에서 AirID를 사용했으나, 이번 연구에서는 식물에서 AirID를 사용하는 것을 입증했으며, 그 결과 AirID가 표적 단백질에 근접한 단백질 라벨링을 위해 BioID 및 TurboID와 같은 다른 PL 효소에 비해 식물 시스템에서 더 나은 성능을 발휘한다는 것을 확인했습니다. 다음은 AT4G18020(APRR2) 단백질을 모델로 사용하여 단백질 상호 작용 파트너를 식별하기 위한 단계별 프로토콜입니다. 이 방법은 벡터의 구성, 아그로인 침투를 통한 구성물의 변환, 비오틴 변환, 단백질 추출 및 친화성 정제 기술을 통한 비오틴 표지 단백질의 농축을 설명합니다. 그 결과 AirID는 식물의 PPI를 분석하기 위한 새롭고 이상적인 효소라는 결론을 내렸습니다. 이 방법은 식물의 다른 단백질을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.
서론
다양한 세포 단백질은 생물학적으로 조절되는 시스템 하에서 작용하며, 단백질-단백질 상호작용(PPI)은 이 시스템의 일부이자 많은 세포 과정의 기초입니다. PPI 외에도 천연 단백질의 기능은 복합체, 유비퀴틴화 및 인산화의 형성과 같은 다양한 변형을 통해 번역 후 촉진됩니다. 따라서 PPI를 연구하는 것은 표적 단백질의 가능한 기능을 이해하는 데 중요합니다. PPI는 면역침전 후 질량 분석 분석(IP-MS 분석)1, 효모 2 하이브리드 시스템(Y2H)2, 무세포 기반 어레이3와 같은 다양한 기술을 사용하여 수행되었습니다. 이러한 방법은 연구 분야에서 다양한 중요한 발견을 탐구했습니다. 그러나 이러한 방법에는 몇 가지 단점이 있습니다. 예를 들어, Y2H는 대상 종의 Y2H 라이브러리를 구축해야 하는 시간과 비용이 많이 드는 전략입니다.
또한 Y2H 기술은 이종 단세포 진핵 생물인 효모를 사용하여 고등 진핵 세포의 세포 상태를 정확하게 반영할 수 없습니다. IP-MS는 소수성이 높은 단백질에 적합하지 않으며 약한 PPI를 포획하는 데 낮은 효율을 보입니다. 뉴클레오티드 결합 도메인, 류신이 풍부한 반복 ....
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프로토콜
1. 식물 재료의 준비
- Cucumis sativus (오이)는 실험 분석에 사용됩니다. 씨앗을 물에 넣고 50 °C에서 20 분 동안 배양 한 다음 12-16 시간 동안 페트리 판의 여과지에 씨앗을 놓습니다.
- 그 후, 씨앗을 토양이 들어있는 화분 (상업적으로 구입)으로 옮기고 23 °C 온도와 16 시간 밝은 광주기 및 8 시간 어두운 광주기의 기후 챔버에서 자랍니다.
- 성공적인 아그로인 침투를 위해 식물이 3 또는 4 잎 단계에 도달 할 때까지 3-4 주 동안 기후 챔버에서 식물을 유지하십시오.
2. AirID 구성
- APRR2를 표적 단백질로 사용하고 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S promoter(p35S: APRR2-AirID)로 APRR2-AirID를 구축합니다. 이를 Gateway 호환 이진 벡터 pEarleyGate1006(캔자스 주립 대학의 Kathrin Schrick 박사 제공)에 도입하고 보충 파일 1에 제공된 서열에 따라 PL 효소를 직접 합성합니다.
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결과
선행 연구에 따르면, 오이 유전자 APRR2 는 백색의 미성숙 과일 색을 조절하는 후보 유전자이다8. 여기서는 오이에서 APRR2 의 상호작용 파트너 단백질을 찾기 위해 AirID를 근접 표지 효소로 사용하는 프로토콜을 개발했습니다. 작제물을 오이 잎으로 옮기고, 침투 후 36시간 후, 비오틴을 옮겼다. 48시간 후 성공적인 형질전환을 확인하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 위해 샘플을 채취했습니다. 단백질은 웨스턴 블롯에 대한 프로토콜에서 위에서 언급한 바와 같이 추출되었습니다. 그림 1 의 대표 데이터는 침윤된 오이 잎에서 단백질 발현과 비오틴화를 나타냈으며, 이는 새로 수정된 기술을 기반으로 예상되는 결과였습니다. 그 결과, 대조군에 비해 표지된 단백질과 여분의 띠의 발현 수준이 더 높았습니다. 이를 통해 AirID가 관심 유전자(GOI)의 표적 단백질에 성공적으로 태그를 지정했음을 확인할 수 있습니다.......
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토론
이번 실험에서 AirID는 근접 라벨링에 사용되었으며, Kido 등은 대규모 게놈 데이터 세트와 5개의 기존 BirA 효소를 사용하여 조상 효소 재구성 알고리즘을 통해 개발했습니다5. 무작위 돌연변이는 동적 서열 변화를 일으킬 수 없기 때문에 활성 9,10을 향상시키기 위해 전통적인 진화 단백질 공학에서 무작위 돌연변이가 사용되었습니다. 다른 PL 효소와 비교할 때 AirID에는 몇 가지 장점이 있습니다. 이전에는 이 PL 방법이 동물 시스템에만 적용되었습니다. 이 연구에서는 식물의 단백질-단백질 상호 작용을 조사하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜은 잎 샘플 준비, 유리 비오틴 제거, 추출된 단백질 정량화, 비오틴화된 단백질 농축을 포함하여 식물에 AirID 기반 PL을 단계별로 설정하는 방법을 설명합니다.
오이에서 잘 확립된 Ag.......
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공개 사항
저자들은 이해 상충이 없다고 선언했습니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (X.H.에 보조금 번호 32000197), 중국 박사후 과학 재단의 특별 재정 보조금 (X.H.에 보조금 번호 2019T120467)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Acetosyringone | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | S1519 | |
| Acryl/Bis 30% 용액 | Sangon Biotech(상하이) Co.Ltd | 1510KA4528 | |
| Agar | BioFroxx GmbH | D64683 | |
| Agarose | tsingke(상하이) Co.Ltd | TSJ001 | |
| 중탄산 암모늄 | Sangon Biotech(상하이) Co.Ltd | ||
| Biotin | BBI 생명 과학 | G908BA0012 | |
| CaCl2 | BBI 생명 과학 | E209BA0008 | |
| 유능한 세포 GV3101 | 현재 실험 | ||
| 탈염 컬럼 | Thermo scientific | WC321753 | |
| Deoxycholic acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | ||
| DH5α 현재 | 실험 | E.coli DH5α | |
| β-D-maltoside | Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd | S818 | |
| EDTA | Sangon Biotech(상하이) Co.Ltd | E104BA0029 | |
| Glycine Sangon Biotech(상하이) Co.Ltd | 161BA0031 | ||
| HEPES | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | H8090 | |
| LiCl | Sangon Biotech(상하이) Co.Ltd | H209BA0003 | |
| MES | 베이징 솔라리보 과학 기술 Co.Ltd | M8019 | |
| MiraCloth | EMD Milipore Corp/MERCK kgAA 다름슈타트, Germenay | 3429963 | 빠른 여과 재료 필터 |
| MgCl2 | Beijing solaribo 과학 기술 Co.Ltd | 20200819 | |
| NaCl | Sangon Biotech(상하이) Co.Ltd | H324BA0003 | |
| NP40 | Sangon Biotech(상하이) Co.Ltd | N8030 | |
| 단백질 억제제 칵테일 | Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd | S3450 | |
| PVDF | BIO-RAD | ||
| SDS | Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd | S1015 | |
| Silwet | Sangon Biotech(상하이) Co.Ltd | S9430 | |
| Streptavidin-C1-conjugated magnetic beads | Enriching Biotechnology | 7E511E1 | Magnetic beads |
| TEMED | Servicebio | G2056 | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech(상하이) Co.Ltd | GB03BA007 | |
| Tris-HCl | Sangon Biotech(상하이) Co.Ltd | F828BA0020 | |
| Tryptone | Thermo scientific | LP0042 |
참고문헌
- Han, J., et al. The identification of novel protein-protein interactions in liver that affect glucagon receptor activity. PloS One. 10 (6), 0129226(2015).
- Zhao, S., et al.
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재인쇄 및 허가
