방법 논문

탈세포화된 기관 이식편을 위한 저선량 감마선 멸균

DOI:

10.3791/64432

⸱

2023년 4월 14일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Thoracic Surgery Department, Hospital Universitari de la Ribera, 2Pathology Department, Universitat de Valencia Facultat de Medicina i Odontologia, 3Center for Biomaterials and Tissue Engineering, Universitat Politècnica de València, 4Radiation Oncology, Hospital Universitari de la Ribera, 5Thoracic Surgery Department, Hospitales Universitarios Virgen del Rocío, 6Department of Applied Statistics and Operations Research and Quality, Universitat Politècnica de València, 7Networking Research Center on Respiratory Diseases (CIBERER), 8INCLIVA Biomedical Research Institute

이 논문에서

요약

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기관 조직 이식에는 멸균이 필수적입니다. 여기에서 우리는 장기가 완전히 견딜 수 있는 저선량 감마선 조사를 사용하는 멸균 프로토콜을 제시합니다.

초록

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이식이 올바르게 진행되도록하는 주요 측면 중 하나는 배지의 무균 성입니다. 탈세포화된 기관 이식은 원래 환경과 접촉하여 처음부터 무균이 되지 않은 장기를 이식하는 것을 포함합니다. 탈세포화 프로토콜(세제 노출[2% 도데실황산나트륨], 연속 교반 및 삼투압 충격을 통해)은 무균 조치에 따라 수행되지만 살균을 제공하지는 않습니다. 따라서 주요 과제 중 하나는 생체 내 이식 전에 무균성을 보장하는 것입니다. 무기 물질에 대한 감마선 멸균 프로토콜이 확립되어 있지만 유기 물질에 대한 그러한 조치는 없습니다. 또한, 확립된 방사선량(25kGy)이 임플란트를 완전히 파괴할 수 있기 때문에 무기 재료에 대한 프로토콜을 유기 재료에 적용할 수 없습니다. 이 논문은 탈세포화된 토끼 기관에서 증가된 방사선량의 영향을 연구합니다. 우리는 용량 범위(kGy)를 유지하고 멸균이 달성되는 최소 용량을 찾을 때까지 증량된 용량을 테스트했습니다. 복용량을 결정한 후, 우리는 조직 학적으로나 생체 역학적으로 장기에 미치는 영향을 연구했습니다. 우리는 0.5kGy가 무균을 달성하지 못했지만 1kGy와 2kGy의 용량은 모두 달성했으며 따라서 1kGy는 멸균을 달성하는 데 필요한 최소 용량이라고 결정했습니다. 현미경 연구는 멸균되지 않은 장기와 비교하여 관련 변화를 나타내지 않았습니다. 축 방향 생체 역학적 특성은 전혀 변경되지 않았으며 기관이 방사상으로 견딜 수있는 단위 길이당 힘의 약간만 감소했습니다. 따라서 우리는 1 kGy가 장기에 미치는 영향을 최소화하면서 탈세포 화 된 토끼 기관의 완전한 살균을 달성한다고 결론 지을 수 있습니다.

서론

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임플란트의 살균은 생존력을위한 기본 요건입니다. 실제로 성공한 것으로 입증 된 보철물은 멸균 부위 (혈관, 심장, 뼈 등)에 이식 된 보철물입니다. 1. 기관은 두 개의 표면을 가지고 있습니다 : 외부 환경과 접촉하는 표면은 멸균되지 않으며, 다른 표면은 멸균 된 종격동을 향한 표면입니다. 따라서 기관이 추출되는 순간부터 멸균 기관이 아닙니다. 후속 탈세포화 공정이 최대 멸균 조건에서 수행됨에도 불구하고, 이는 멸균 단계2가 아니다. 이물질의 주입 자체는 그것이 생산하는 프로박테리아 미세환경으로 인한 감염의 위험을 수반한다3그리고 물질이 멸균된 경우에도 기증자로부터 수혜자에게 질병이 전파될 위험이 최대 0.014%에 달한다4. 기관의 올바른 혈관 형성을 보장하기 위해 거의 모든 실험적 이식 프로토콜에서 먼저 무균 부위(근육, 근막, 망막, 피하 등)에 이종 성 임플란트 5,6,7을 거칩니다. 이 배지에 비멸균 요소를 주입하면 영역

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프로토콜

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실험 동물의 관리 및 사용에 대한 유럽 지침 20170/63/EU를 준수했으며 연구 프로토콜은 발렌시아 대학교 윤리 위원회의 승인을 받았습니다(법률 86/609/EEC 및 214/1997 및 코드 2018/VSC/PEA/0122 스페인 발렌시아 정부).

1. 기관 탈세포화

참고: 탈세포화 방법은 다른 곳에서 보고된 바있다 20.

  1. 기증자 수컷 성인 뉴질랜드 백색 토끼(Oryctolagus cuniculus)를 체중 3.5-4.1kg과 133mg/kg 펜토바르비탈 나트륨으로 안락사시키고 가장자리 귀 정맥을 통해 200mg/mL 주사합니다.
  2. 무균 상태를 유지하면서 중앙 세로 자궁 경부 절개술을 시행하고 자궁 경부 근육을 해부하고 기관에 접근하십시오. 장기를 원주 방향 및 세로로 해부하십시오. 마지막으로, 첫 번째 고리 아래와 카리나 바로 위에 횡단합니다.
  3. 메스로 기관을 2cm 조각으로 나눕니다. 가위로 주변 결합 조직과 내부 점막층6을 제거합니다.
  4. 2% 소듐 도데실 설페이트(SDS), 5% 페니실린....

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결과

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탈세포화
DAPI 염색은 DNA의 부재를 보여주고, 전기영동에 의해 임의의 기관에서 50 ng 이상의 DNA 값이 검출되지 않았으며, 모든 단편은200 bp 20보다 작았다.

미생물 배양
0.5 kGy를 받은 8개 조각 중 2개는 1주일 이내에 색 변화를 보였다. 1 kGy 및 2 kGy에서 조사된 조각들 중 어느 것도 색 변화를 나타내지 않았다(그림 1).

조직학적 분석
분석된 시편에서 콜라겐 또는 탄성 섬유 분포 패턴의 변화는 감지되지 않았습니다(그림 2).

방사선량 결정
0.5 kGy에서.......

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토론

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존재하는 몇 가지 살균 전략이 있습니다. 초임계 CO2는 조직을 완전히 관통하여 배지를 산성화하고 임플란트 8,14,25의 감압에 의한 간단한 제거로 세포 인지질 이중층을 분해합니다. 자외선도 사용되어 왔으며 설치류 기관에서의 효과가 발표되었지만 문헌10에는 몇 가지 보고서 만 있습니다. 사용된 다른 방법으로는 과초산, 에탄올, 과산화산소 또는 전해수와 같은 물질의 적용이 포함되는데, 이는 불규칙한 결과를 제공하고 조직에 큰 영향을 미치는 것으로 나타났습니다11,12. 앞서 언급 한 전략과는 달리, 감마선 조사는 살균 측면에서 완전히 효과적 일뿐만 아니라 복용량과 살균 효과에 관해서도 철저하고 풍부.......

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공개 사항

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저자 중 누구도 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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이 논문은 2018년 스페인 흉부외과 학회(Spanish Society of Thoracic Surgery)의 지원을 받아 국립 다중심 연구(National Multicentric Study)[Néstor J.Martínez-Hernández에게 수여된 180101번] 및 Instituto de Salud Carlos III의 PI16-01315[Manuel Mata-Roig에게 수여됨]의 지원을 받았습니다. CIBERER는 VI National R & D & I Plan 2018-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider Program, CIBER Actions 및 Instituto de Salud Carlos III의 지원을 받아 유럽 지역 개발 기금 (European Regional Development Fund)의 지원을 받고 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
6-0 나일론 모노필라멘트 봉합사 모노소프트. 코비디엔; 미국 매사추세츠주 맨스필드SN-5698G
암포테리신 B 5%Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA15290018
BioanalyzerAgilent, Santa Clara, CA, USAG2939BA
부프레노르핀부프렉스. 레킷벤키저 헬스케어; Hull, Reino UnidoN02AE01
압축 데스크탑 UTMMicrotest, 마드리드, 스페인EM1/10/FR
CryostateLeyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, AlemaniaCM3059
디메틸 설폭사이드(DMSO)시그마-알드리치; 미국 MOD2650
DMEM 써모 피셔 사이언티픽; Waltham, MA, USA11965084
DNA 추출 키트DNeasy 추출 키트 Quiagen, Hilden, Germany4368814
Enrofloxacin, 2.5%Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany0035-0002
Fetal bovine serum (FBS)GE Healthcare Hyclone; 스페인 마드리드SH20898.03IR
형광 현미경Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany)DM2500??
냉동 용기 프로스티 씨. 써모 피셔; 스페인 마드리드  5100-0001
이소플루오란이소플로; 프로이마 가나데라; 시우다드 레알, 스페인 8.43603E+12
케타민이말겐. 메리알; 툴루즈, 프랑시아BOE127823
리니어 액셀러레이터 "트루 빔". Varian, Palo Alto, California, USAH191001
자기 교반기궤도 셰이커 PSU-10i. 바이오산; 리가, LetoniaBS-010144-AAN
Meloxicam 5 mg/mlBoehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany6283-MV
페니실린-스트렙토마이신 5%Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA15140122
펜토바르비탈 나트륨돌레탈. 베토퀴놀; 마드리드, 에스파ñ a 3.60587E+12
인산염 완충 식염수(PBS)시그마-알드리치; 미주리, 미국P2272
프로포폴프로포폴 Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, AlemaniaG 151030
단백질 분해 효소 KGibco Thermo Fisher Scientific; 월섬, 매사추세츠, 미국S3020
PVC 중공 튜브Cristallo 추가; FITT, 산드리고, 이탈리아hhdddyyZ
PVC 스텐트 아가일TM 메드트로닉; 터키 이스탄불019 5305 1
R 소프트웨어, 버전 3.5.3 R CoreR Foundation for Statistical ComputingR 3.5.3
도데실황산나트륨(SDS)시그마-알드리치; 미주리, 미국8,17,034
분광 광도계Nanodrop, Life Technologies; 이소겐 생명과학. 네덜란드 위트레흐ND-ONEC-W
스프레드시트Mac용 Microsoft Excel, 버전 16.23, 미국 워싱턴주 레드몬드2864993241
견인 만능 시험기 테스트 기계, Veenendaal, 네덜란드84-01
UTM SoftwareTestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA 100-093-627 F
VECTASHIELD 마운팅 미디엄 벡터 랩스, 벌링게임; 캘리포니아; 미국H-1000-10
자일라신자일라직. 더 칼리어; 바르셀로나, 에스파ñ 재질보기 20102-003

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ch'ng, S., et al. Reconstruction of the (Crico)trachea for malignancy in the virgin and irradiated neck. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65 (12), 1645-1653 (2012).
  2. Johnson, C. M., Guo, D. H., Ryals, S., Postma, G. N., Weinberger, P. M.

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재인쇄 및 허가

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