토마토의 종자 개발 연구를위한 효율적인 청산 프로토콜 (Solanum lycopersicum L.)

토마토(S. lycopersicum L.)는 전 세계에서 가장 중요한 채소 작물 중 하나이며 2020년 510만 헥타르에서 1억 8,680만 톤의 다육질 과일을 생산했습니다¹. 그것은 가지, 고추, 감자 및 담배와 같은 상업적으로 중요한 많은 작물을 포함하여 약 2,716 종²의 큰 Solanaceae 가족에 속합니다. 재배 된 토마토는 게놈 크기가 약 900 Mb³ 인 이배체 종 (2n = 2x = 24)입니다. 오랫동안 야생 Solanum spp에서 바람직한 형질을 선택하여 토마토 가축화 및 번식에 많은 노력을 기울였습니다. 토마토 유전학 자원 센터에는 5,000개 이상의 토마토 가입이 나열되어 있으며^{전 세계적으로} 80,000개 이상의 토마토 생식질이 저장되어 있습니다4. 토마토 식물은 온실에서 다년생이며 씨앗으로 번식합니다. 성숙한 토마토 종자는 다 자란 배아, 잔류 세포형 배유 및 단단한 종자 코트 ^5,6의 세 가지 주요 구획으로 구성됩니다 (그림 1A). 이중 수정 후, 세포형 배유의 발달은 접합체의 발달에 선행한다. 개화 후 ~ 5-6 일 (DAF)에, 배유가 6-8 개의 핵으로 구성 될 때 2 세포 배아가 처음 관찰됩니다⁷. Solanum pimpinellifolium에서 배아는 20 DAF 후에 최종 크기에 접근하고 종자는 32 DAF⁸ 후에 발아를 위해 생존 할 수 있습니다. 배아가 발달함에 따라 배유는 점차적으로 흡수되고 소량의 배젖 만 종자에 남아 있습니다. 잔류 배유는 방사상 끝을 둘러싸는 미세 정열 배유와 나머지 종자 ^9,10의 측면 배유로 구성됩니다. 외부 종자 코트는 외피의 두껍고 lignified 외부 표피에서 개발되며, 외피 잔해의 죽은 층과 함께 배아와 배유를 보호하기 위해 단단한 껍질을 형성합니다⁵.

그림 1 : Solanum lycopersicum 및 Arabidopsis thaliana에서 성숙한 종자의 개략적 표현. (A) 성숙한 토마토 종자의 종단 해부학. (B) 성숙한 애기장대 종자의 종단 해부학. 성숙한 토마토 씨앗은 애기장대 씨앗보다 크기가 약 70 배 더 큽니다. 스케일 바 = (A) 400 μm, (B) 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

고품질 토마토 종자의 생산은 배아, 배유 및 모체 종자 성분 사이의 조정에 달려있다¹¹. 종자 개발에서 핵심 유전자와 네트워크를 해부하려면 돌연변이 종자에 대한 심층적이고 완전한 표현형 기록이 필요합니다. 반박형 섹션 및 파라핀 섹션과 같은 종래의 임베딩-절편 기술은 배아^12,13,14,15의 국소 및 미세 구조를 관찰하기 위해 토마토 종자에 널리 적용됩니다. 그러나 얇은 섹션에서 종자 발달을 분석하는 것은 일반적으로 힘들고 z 축 공간 해상도가 부족합니다. 이에 비해 조직 투명화는 발생할 가능성이 가장 높은 배아 결함의 발달 단계를 정확히 찾아내는 빠르고 효율적인 방법입니다¹⁶. 투명화 방법은 굴절률을 하나 이상의 생화학적 제제(¹⁶)로 균질화함으로써 내부 조직의 불투명도를 감소시킨다. 전체 조직 투명화는 그 완전성을 파괴하지 않으면서 식물 조직 구조의 관찰을 가능하게 하며, 투명화 기술과 3차원 이미징의 결합은 식물 기관의 형태 및 발달 상태에 대한 정보를 얻기 위한 이상적인 솔루션이 되었다(^17,18). 수년에 걸쳐 종자 개간 기술은 Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare 및 Beta vulgaris 19,20,21,22,23을 포함한 다양한 식물 종에서 사용되었습니다. 이 중 전체 마운트 난자 제거 기술은 크기가 작고 종자 코트 세포의 4-5 층과 핵형 배유^24,25로 인해 Arabidopsis의 종자 발달을 연구하는 효율적인 접근 방식이었습니다. Hoyer의 용액²⁶의 출현과 같은 다양한 클리어링 혼합물의 지속적인 업데이트와 함께, 배젖이 종자의 대부분을 구성하지만 보리 난자의 내부 구조가 높은 수준의 선명도로 이미지화되었습니다. 사탕무의 배발생은 진공 처리와 결합 및 염산¹⁹로 연화함으로써 관찰할 수 있다. 그럼에도 불구하고 위에서 언급 한 종과 달리 토마토 종자의 프로토콜을 제거함으로써 발생 학적 관찰은보고되지 않았습니다. 이것은 토마토의 배아 및 종자 발달에 대한 상세한 조사를 방해합니다.

클로랄 수화물은 침지된 조직 및 세포가 상이한 광학 평면 상에 디스플레이될 수 있게 하고, 세포 또는 조직 성분(^27,28,29)을 실질적으로 보존하는 클리어링 용액으로서 통상적으로 사용된다. 클로랄 하이드레이트 기반 클리어링 프로토콜은 Arabidopsis^21,28의 배아와 배유를 관찰하기 위해 종자의 전체 마운트 클리어링에 성공적으로 사용되었습니다. 그러나이 청소 솔루션은 Arabidopsis 씨앗보다 불 침투성 토마토 씨앗을 제거하는 데 효율적이지 않습니다. 물리적 장벽은 다음과 같습니다 : (1) 토마토 외피는 3에서 15 DAF 30,31에 거의 20 개의 세포층을 가지고 있으며, (2) 토마토 배유는 핵 유형 32가 아닌 세포 유형이며, (3) 토마토 씨앗은 크기가 약 70 배 더 큽니다^33,34 (4) 다량의 종자 코트 점액을 생성하여 투명 시약의 침투를 차단하고 배아 세포의 시각화에 영향을 미칩니다.

따라서 이 보고서는 다양한 단계에서 토마토 종자의 전체 마운트 제거를 위한 최적화된 클로랄 하이드레이트 기반 투명화 방법을 제시하여 배아 발달 과정을 심층 이미징할 수 있습니다(그림 2).

1. 용액 준비

1. 50mL 원심분리 튜브에 37% 포름알데히드 2.5mL, 빙초산 2.5mL, 70% 에탄올 45mL를 추가하여 FAA 고정액을 준비합니다. 와동시키고 4 °C에서 보관하십시오. 사용 직전에 FAA 정착액을 신선하게 준비하십시오.
   주의 : 37 % 포름 알데히드는 부식성이며 노출되거나 흡입되면 잠재적으로 발암 성입니다. 정착액은 적절한 개인 보호 장비를 착용 한 상태에서 흄 후드에서 수행해야합니다.
2. 주석 호일로 싸인 100mL 유리병에 100% 글리세롤 5mL, 클로랄 수화물 40g, 증류수 10mL를 첨가하여 투명화 용액을 준비합니다. 자석 교반기를 사용하여 실온에서 밤새 용해시킵니다. 제조된 용액은 4°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.
   주의 : 클로랄 수화물은 발암 성이며 매운 냄새가납니다. 흄 후드에서 실험을 수행하고 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 클로랄 수화물은 공기 중에서 조해하기 쉽고 대량으로 저장해서는 안됩니다. 투명액은 빛에 노출되면 분해될 수 있으므로 빛으로부터 멀리 떨어져 있어야 합니다.
3. 50mL 원심분리 튜브에 6% 차아염소산나트륨 10mL, 증류수 40mL, 트윈-20 50μL를 첨가하여 소독액을 준비합니다. 소용돌이를 일으키고 실온에서 보관하십시오. 사용 직전에 소독액을 새로 준비하십시오.
   참고 : 장기간 배치 된 차아 염소산 나트륨의 유효 염소 함량은 감소 할 수 있으며 실제 상황에 따라 6 % 차아 염소산 나트륨의 함량을 증가시킬 수 있습니다.

2. 종자 수집

1. 토마토 씨앗 (S. lycopersicum L. cv. Micro-Tom, 재료 표 참조)을 꽃 양분 토양과 기질 (v / v)의 1 : 1 혼합물로 가득 찬 8cm × 8cm × 8cm 정사각형 분지에 뿌리고 ( 재료 표 참조) 24 ± 2 ° C (낮) 및 18 ± 2 ° C (밤)에서 16/8 시간의 명암 기간이있는 성장실에서 자랍니다. 60%-70% 상대 습도 및 4,000Lux의 광도. 약 6 주 후 식물은 개화 단계에 들어갔다.
2. anthesis (꽃잎의 개방 각도는 90 °)에서 독립 꽃의 개화 날짜를 태그하고 개화 다음 날 (DAF)을 기록합니다.
3. 3에서 23 DAF 토마토 식물에서 과일을 수확하고 즉시 얼음 위에 놓습니다. 과일 (종자 또는 배아)을 3-23 DAF에서 초기 (3-10 DAF), 중간 (11-16 DAF) 및 후기 (17-23 DAF) 과일 (종자 또는 배아)로 나눕니다.
   알림: 한 번에 너무 많은 과일을 수집하지 말고 추가 치료를 위해 각 과일의 씨앗을 1 시간 이내에 제거하십시오.
4. 초기 과일의 경우 과일을 깨뜨려 슬라이드에 놓고 실체 현미경 ( 재료 표 참조)으로 정밀 집게로 1x에서 4x 배율로 신선한 씨앗을 조심스럽게 수집합니다. 중간 및 후기 과일의 경우 과일을 깨고 정밀 집게를 사용하여 신선한 씨앗을 직접 수집합니다.

3. 클로랄 수화물 기반 종자 제거

참고: 종래의³⁵ 개 프로토콜과 최적화된 프로토콜은 종자 개간 효율성에 대해 이 연구에서 비교되었습니다.

1. 기존 프로토콜을 사용한 지우기
   1. 신선한 씨앗 (2.4 단계에서 얻음)을 1.5mL FAA 정착액이 들어있는 2mL 원심 분리 튜브에 즉시 넣고 실온에서 4 시간 동안 궤도 쉐이커 (5rpm, 재료 표 참조)에서 배양합니다.
   2. 이 씨앗을 70 %, 95 % 및 100 % 에탄올 (v / v)의 에탄올 시리즈에서 오비탈 셰이커 (5rpm)에서 각각 1 시간 동안 탈수시킵니다.
   3. 슬라이드에 3-5방울의 투명액(~100μL)에 씨앗을 놓고 커버슬립으로 샘플을 부드럽게 덮습니다. 슬라이드를 중간 및 후기 시드를 위한 단일 오목한 슬라이드( 재료 표 참조)로 교체합니다.
   4. 이 슬라이드 또는 단일 오목한 슬라이드는 종자 재료의 발달 단계에 따라 30 분 (3 DAF), 2 시간 (6 DAF), 1 일 (9 DAF), 3 일 (12 DAF) 또는 7 일 (14-22 DAF) 동안 실온에 보관하십시오 (재료가 젊을수록 청산 속도가 빠름).
   5. 디지털 카메라가 장착된 미분 간섭 대비(DIC) 현미경( 재료 표 참조)으로 샘플을 10x, 20x 및 40x 배율로 관찰합니다. 투과광 밝기, DIC 슬라이더 및 콘덴서 조리개를 각 샘플 및 캡처 이미지에 대해 실시간으로 조정하고 최적화합니다.
2. 최적화된 프로토콜을 사용한 지우기
   1. 신선한 씨앗 (2.4 단계에서 얻음)을 1.5mL 소독액이 들어있는 2mL 원심 분리 튜브에 직접 넣습니다 (1.3 단계).
      알림: 2mL 원심 분리기 튜브에 수집 된 씨앗의 수는 씨앗의 발달 단계에 따라 다릅니다. 자세한 내용은 표 1에 나열되어 있습니다.
   2. 샘플을 실온의 오비탈 쉐이커(30rpm)에서 가장 안쪽의 종자 코트 윤곽이 명확하게 보일 때까지 3 내지 50분 동안 배양합니다. 소독액을 폐기하십시오.
      참고 : 필요한 배양 시간은 종자 발달 단계에 따라 다릅니다 (종자가 늦을수록 배양 시간이 길어집니다). 자세한 내용은 표 1에 나열되어 있습니다.
   3. 중간 및 후기 종자의 경우 종자를 슬라이드로 옮기고 집게와 해부 바늘로 종자 점액을 실체 현미경으로 1x-4x 배율로 제거합니다. 집게를 사용하여 씨앗을 원래의 원심 분리기 튜브로 다시 옮깁니다.
      참고 :이 단계는 초기 씨앗에는 필요하지 않습니다.
   4. 씨앗을 5mL 탈이온수로 1.5회 씻고 매번 10초 동안 씻습니다. 탈이온수를 폐기하십시오.
   5. 종자 부피의 2 ×의 투명화 용액을 첨가 한 다음 진공 펌프로 0-50 분 동안 진공 처리 (표 1)합니다 ( 재료 표 참조). 간헐적 진공 처리는 각 진공 처리와 함께 10분 간격으로 10분 간격으로 수행됩니다.
   6. 씨앗의 부피 2 ×의 신선한 청산 용액으로 교체하십시오. 종자가 들어 있는 2mL 원심분리 튜브를 실온에 보관하고 제거를 용이하게 하기 위해 30분 내지 7일 동안 빛으로부터 보호하십시오(표 1). 배양 중에 후기 배아의 경우 매일 깨끗한 용액을 신선한 용액으로 교체하고 종자를 10 분 동안 진공 처리하십시오.
   7. 슬라이드 또는 단일 오목 슬라이드에 깨끗한 씨앗을 준비하고 디지털 카메라가 장착 된 DIC 현미경으로 10x, 20x 및 40x 배율로 관찰합니다. 투과광 밝기, DIC 슬라이더 및 콘덴서 조리개를 각 샘플 및 캡처 이미지에 대해 실시간으로 조정하고 최적화합니다.

Arabidopsis에서와 같이 기존의 방법을 사용하여 토마토 종자를 제거했을 때, 조밀 한 배유 세포는 3 DAF 및 6 DAF에서 초기 토마토 배아의 시각화를 차단했습니다 (그림 3A, B). 배아의 총 부피가 증가함에 따라 구형 배아는 9 DAF에서 거의 구별되지 않았습니다 (그림 3C). 그러나 종자 크기가 계속 증가함에 따라 투과성이 감소하여 12 DAF에서 퍼지 심장 배아가 생성되었습니다 (그림 3D). 13 DAF부터 종자 점액과 종자 코트가 점차 조밀 해져 제거제의 침투를 방지했습니다. 14-19 DAF 종자 내부의 배아의 윤곽은 처리 시간이 7 일로 연장 된 경우에도 매우 흐려졌습니다 (그림 3E-G). 22 개의 DAF 종자에서 종자의 내부 구조는 완전히 보이지 않았습니다 (그림 3H).

따라서 기존의 염소 수화물 기반 청산 절차는 토마토 종자의 효율적인 청산을 가능하게하기 위해 최적화되었습니다. 모든 단계에 대한 자세한 내용은 표 1에 나열되어 있습니다. 첫째, 기존의 청산 절차에서 종종 요구되는 FAA 고정 및 에탄올 탈수 단계가 프로토콜에서 생략되었습니다. FAA 고정은 일반적으로 형태 학적 구조와 세포 구성 요소를 부패로부터 보존하는 데 사용되지만, (이 연구에서) 토마토 종자의 내부 구조는 FAA 고정 및 에탄올 탈수가 없음에도 불구하고 쉽게 변형되지 않고 잘 보존되는 것으로 밝혀졌습니다.

둘째, 종자 코트 표피 세포에 의해 생성 된 종자 코트 점액은 13 DAF 이후에서 매우 두드러집니다 (그림 4). 다당류가 풍부한 종자 점액질은 높은 점도 및 상당히 낮은 투과성35,36을 나타내었다. 해부 현미경으로 미세한 집게와 바늘을 사용하여 종자 코트를 파괴하지 않고 제거하려는 초기 시도는 불행히도 실패했습니다. 이것은 종자 코트가 부서지기 쉽고 점액에 단단히 연결되어 있기 때문입니다. 더욱이, 종자 코트에 안료의 존재는 명시야 이미지(37)의 품질의 저하로 이어진다. 이 문제를 극복하기 위해, 종자를 1.2 % 차아 염소산 나트륨 및 0.1 % 트윈 20의 소독 용액으로 처리했다. 차아염소산나트륨의 표백 효과는 내부 종자 코트를 명확하게 식별할 수 있게 하고 샘플을 장기간 보관할 수 있는 비교적 무균 환경을 조성합니다. 세제 트윈 20을 사용하면 표면 장력을 낮추고 종자 투과성을 높일 수 있습니다. 더 중요한 것은이 단계 후에 대부분의 부착 성 점액이 종자 코트를 손상시키지 않고 종자에서 분리 될 수 있다는 것입니다 (그림 4). 이후, 처리된 종자를 2mL 원심분리 튜브에 풀링하고, 오비탈 쉐이커(30rpm)에서 실온에서 배양하였다.

셋째, 진공 처리는 중간 및 후기 단계에서 배아에 대한 클리어링 용액의 침투를 가속화하기 위해 사용되었습니다. 마지막으로, 토마토 씨앗은 12 DAF 후에 특히 더 크기 때문에, 종래의 슬라이드는 DIC 이미징 시 단일 오목한 슬라이드로 대체되었다.

최적화된 클리어링 프로토콜에 따라 처리한 후, 토마토 씨앗은 테스트된 모든 발달 단계에서 만족스러운 투명성을 보였습니다(그림 5A-L). 종래의 프로토콜을 사용하여 수득된 퍼지 세포 윤곽과는 대조적으로, 3 DAF에서 종자 코트의 뚜렷한 세포층이 보였다(도 5A). 배유 세포는 5 DAF에서 더 구별 가능하였다 (도 5B). 막대기 모양의 배아는 7 DAF에서 나타 났고, 배아는 9 DAF에서 구형 단계에, 심장 단계는 11 DAF에 도달했습니다 (그림 5C-E). 이 발달 단계에서 배아 내부의 세포 윤곽이 가장 명확하게 보였습니다. 기존 방법과 비교하여 최적화된 프로토콜은 심장 단계에서 성숙한 배아 단계까지 훨씬 더 나은 품질의 이미지를 생성했습니다. 배아 발달이 13 DAF에서 초기 어뢰 단계, 14 DAF에서 중간 어뢰 단계, 15 DAF에서 후기 어뢰 단계, 16 DAF에서 초기 자엽 단계, 19 DAF 및 21 DAF에서 구부러진 자엽 단계, 23 DAF에서 성숙한 배아에 도달했을 때, 자엽과 싹 정점 분열 조직의 컬링 정도는 매우 쉽게 포착되었습니다 (그림 5F-L ). 그러나 23 DAF를 넘어서면 클리어링 처리가 1 주일 이상으로 연장 된 경우에도 배아의 세부 사항을 시각화 할 수 없었습니다.

그림 2: 기존 프로토콜 및 최적화된 프로토콜의 순서도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 기존의 투명화 방법을 사용하여 처리된 S. lycopersicum 난자의 미분 간섭 대비 이미지. (A) 3 DAF에서 퍼지 배아 주머니가있는 난자. (B) 6 DAF에서 보이는 배유 세포 (화살촉)가있는 배아 주머니. (C) 9 DAF에서 거의 구별할 수 없는 구형 배아. (D) 12, (E) 14, (F) 16 및 (G) 19 DAF에서의 퍼지 배아. (H) 종자의 내부 구조는 22 DAF에서 완전히 보이지 않습니다. 스케일 바 = 25 μm; em = 배아; ES = 배아 낭. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4 : 다른 발달 단계에서 S. lycopersicum 종자의 소독. 상단 이미지 (A1-F1)는 (A1) 11, (B1) 12, (C1) 14, (D1) 16, (E1) 18 및 (F1) 21 DAF에서 개발 과일의 줄무늬 씨앗이며, 하단 이미지 (A2-F2)는 소독액으로 처리 된 종자입니다. A2-F2에서는 내부 종자 코트 윤곽을 명확하게 식별 할 수 있습니다. 스케일 바 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 최적화된 프로토콜을 사용하여 제거된 S. lycopersicum 배아의 미분 간섭 대비 이미지. (A-L) (A) 3 DAF 및 (B) 5 DAF에서 보이는 배아 주머니가있는 토마토 난자의 DIC 현미경 이미지, (C) 7 DAF에서 막대기 모양의 배아, (D) 9 DAF에서 구형 배아, (E) 11DAF에서 심장 배아, (F) 13 DAF의 초기 어뢰 배아, (G) 중간 어뢰 배아 14 DAF, (H) 15 DAF의 후기 어뢰 배아, (I) 16 DAF의 초기 자엽 배아, (J) 19 DAF 및 (K) 21 DAF의 구부러진 자엽 배아, (L) 23 DAF의 성숙한 배아. 스케일 바 = 50 μm; em = 배아; sc = 종자 코트; en = 배젖; ES = 배아 낭; hy = 배축; 공동 = 자엽; r = 방사형; sa = 정점을 쏴라. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1 : 토마토 종자의 클리어링 효능을 개선하기위한 프로토콜의 최적화. 1 = 배치 작업, 한 번에 많은 수의 시드 관찰 지우기; 종자를 2 mL 원심분리 튜브에 넣었다. 2 = 6 % NaClO : dH2O : 트윈 -20, 200 : 800 : 1 (v / v)의 비율로 소독; 모든 단계는 30 rpm 진탕을 갖는 오비탈 쉐이커 상에서 수행하였다. 3 = 모든 단계는 달리 명시되지 않는 한 집게와 해부 바늘로 해부 현미경으로 수행되었습니다. 4 = 각 단계 후에 종자를 증류수로 세척하였다. 5 = 100 % 글리세롤 : 클로랄 수화물 : dH 2 O를 1 : 8 :2(v / w / v)의 비율로 사용하여 청소. 6 = 각 진공 처리는 10분 동안 지속되었으며 10분 간격으로 간격을 두었습니다. 7 = 신선한 청산 용액으로 교체하고 씨앗을 실온에서 빛을 피해 보관하십시오. 17 DAF에서 23 DAF까지의 종자의 경우 깨끗한 용액을 신선한 용액으로 교체하고 잠복기 동안 매일 10 분 동안 진공 청소기로 청소하십시오.

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.