Method Article

토마토의 종자 개발 연구를위한 효율적인 청산 프로토콜 (Solanum lycopersicum L.)

DOI:

10.3791/64445

⸱

September 7th, 2022

 ,  , 
1Key Laboratory of Plant Molecular Physiology, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, 2College of Life Science, University of Chinese Academy of Sciences, 3Innovative Academy of Seed Design, Chinese Academy of Sciences

In This Article

Summary

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토마토 씨앗은 식물 생식 중 유전학 및 발생 생물학을 연구하는 중요한 모델입니다. 이 프로토콜은 더 미세한 배아 구조를 관찰하기 위해 다양한 발달 단계에서 토마토 씨앗을 제거하는 데 유용합니다.

Abstract

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토마토 (Solanum lycopersicum L.)는 전 세계적으로 주요 현금 작물 중 하나입니다. 토마토 씨앗은 식물 생식 중 유전학 및 발생 생물학을 연구하는 중요한 모델입니다. 토마토 종자 내에서 더 미세한 배아 구조의 시각화는 종종 종자 코트 점액, 다세포 층 외피 및 두꺼운 벽의 배유에 의해 방해를 받으며, 이는 힘든 매립 절단으로 해결해야 합니다. 더 간단한 대안은 화학 약품을 사용하여 종자를 거의 투명하게 만드는 조직 제거 기술을 사용하는 것입니다. 기존의 개간 절차를 통해 더 얇은 종자 코트로 더 작은 종자에 대한 깊은 통찰력을 얻을 수 있지만 토마토 종자를 제거하는 것은 특히 발달 후반 단계에서 기술적으로 계속 어렵습니다.

여기에 제시된 것은 배아 형태가 거의 완성 된 개화 후 3 일에서 23 일 사이에 토마토 종자 발달을 관찰하기위한 신속하고 노동력을 절약하는 개간 프로토콜입니다. 이 방법은 Arabidopsis 에서 널리 사용되는 클로랄 수화물 기반 클리어링 용액을 포르말린-아세토-알코올(FAA) 고정 생략, 종자의 차아염소산나트륨 처리 추가, 연화 종자 코트 점액 제거, 세척 및 진공 처리를 포함한 다른 수정과 결합합니다. 이 방법은 다양한 발달 단계에서 토마토 종자를 효율적으로 제거하는 데 적용 할 수 있으며 공간 분해능이 좋은 돌연변이 종자의 발달 과정을 완전히 모니터링하는 데 유용합니다. 이 클리어링 프로토콜은 Solanaceae에서 상업적으로 중요한 다른 종의 심층 이미징에도 적용될 수 있습니다.

Introduction

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토마토(S. lycopersicum L.)는 전 세계에서 가장 중요한 채소 작물 중 하나이며 2020년 510만 헥타르에서 1억 8,680만 톤의 다육질 과일을 생산했습니다1. 그것은 가지, 고추, 감자 및 담배와 같은 상업적으로 중요한 많은 작물을 포함하여 약 2,716 종2의 큰 Solanaceae 가족에 속합니다. 재배 된 토마토는 게놈 크기가 약 900 Mb3 인 이배체 종 (2n = 2x = 24)입니다. 오랫동안 야생 Solanum spp에서 바람직한 형질을 선택하여 토마토 가축화 및 번식에 많은 노력을 기울였습니다. 토마토 유전학 자원 센터에는 5,000개 이상의 토마토 가입이 나열되어 있으며전 세계적으로 80,000개 이상의 토마토 생식질이 저장되어 있습니다4. 토마토 식물은 온실에서 다년생이며 씨앗으로 번식합니다. 성숙한 토마토 종자는 다 자란 배아, 잔류 세포형 배유 및 단단한 종자 코트 5,6의 세 가지 주요 구획으로 구성됩니다 (....

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Protocol

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1. 용액 준비

  1. 50mL 원심분리 튜브에 37% 포름알데히드 2.5mL, 빙초산 2.5mL, 70% 에탄올 45mL를 추가하여 FAA 고정액을 준비합니다. 와동시키고 4 °C에서 보관하십시오. 사용 직전에 FAA 정착액을 신선하게 준비하십시오.
    주의 : 37 % 포름 알데히드는 부식성이며 노출되거나 흡입되면 잠재적으로 발암 성입니다. 정착액은 적절한 개인 보호 장비를 착용 한 상태에서 흄 후드에서 수행해야합니다.
  2. 주석 호일로 싸인 100mL 유리병에 100% 글리세롤 5mL, 클로랄 수화물 40g, 증류수 10mL를 첨가하여 투명화 용액을 준비합니다. 자석 교반기를 사용하여 실온에서 밤새 용해시킵니다. 제조된 용액은 4°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.
    주의 : 클로랄 수화물은 발암 성이며 매운 냄새가납니다. 흄 후드에서 실험을 수행하고 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 클로랄 수화물은 공기 중에서 조해하기 쉽고 대량으로 저장해서는 안됩니다. 투명액은 빛에 노출되면 분해될 수 있으므로 빛으로부터 멀리 떨어져 있어야 합니다.
  3. 50mL 원심분리 튜브에 6% 차아염소산나트륨 10mL, 증류수 40mL, 트윈-20 50μL를 첨가하여 소독액을 준비합니다. 소용돌이를 일으키고 실온에서 보....

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Results

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Arabidopsis에서와 같이 기존의 방법을 사용하여 토마토 종자를 제거했을 때, 조밀 한 배유 세포는 3 DAF 및 6 DAF에서 초기 토마토 배아의 시각화를 차단했습니다 (그림 3A, B). 배아의 총 부피가 증가함에 따라 구형 배아는 9 DAF에서 거의 구별되지 않았습니다 (그림 3C). 그러나 종자 크기가 계속 증가함에 따라 투과성이 감소하여 12 DAF에서 퍼지 심장 배아가 생성되었습니다 (그림 3D). 13 DAF부터 종자 점액과 종자 코트가 점차 조밀 해져 제거제의 침투를 방지했습니다. 14-19 DAF 종자 내부의 배아의 윤곽은 처리 시간이 7 일로 연장 된 경우에도 매우 흐려졌습니다 (그림 3E-G

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Discussion

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기계적 절편에 비해, 클리어링 기술은 식물 조직 또는 기관(16)의 완전성을 유지하므로 3차원 이미징에 더 유리하다. 기존의 클리어링 프로토콜은 화학 용액의 침투가 쉽기 때문에 종종 작은 샘플로 제한됩니다. 토마토 씨앗은 크기가 Arabidopsis 종자보다 약 70 배 크고 투과성 장벽이 더 많기 때문에 조직 청소에 문제가되는 샘플입니다. 애기장대 종자 코트는 외부 외피와 내부 외피24에서 파생 된 4-5 개의 살아있는 세포층으로 구성됩니다. 그러나 Arabidopsis와 비교할 때 토마토 종자 코트6에는 22-27 개의 실질 세포층 (구형 배아 단계)이 있습니다. 토마토 종자 코트의 가장 안쪽 층은 수 베린으로 구성되며 반투성 층으로 알려져 있으며, 이는 수용성 화합물38의 이동에 대한 장벽으로 나타났습니다........

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 각각 미분 간섭 대비 현미경과 기존 투명화 방법에 대한 유용한 제안을 해준 Jie Le 박사와 Xiufen Song 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (31870299)과 중국 과학원 청소년 혁신 촉진 협회의 재정 지원을 받았습니다. 그림 2는 BioRender.com 로 작성되었습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,000 &마이크로; L 피펫GILSONFA10006M
1,000 µ L 피펫 팁CorningT-1000-B
2 ml 원심분리기 튜브AxygenMCT-200-C
37% 포름알데히드DAMAO685-2013
5,000 &마이크로; L 피펫Eppendorf3120000275
5,000 µ L 피펫 팁biosharpBS-5000-TL
50ml 원심분리기 튜브Corning430829
Absolute EthanolBOYUAN678-2002
병 유리FisherFB800-100
Chloral HydrateMeryerM13315-100G
CoverslipLeica384200
DIC 현미경ZeissAxio Imager A110x, 20x 및 40x 배율
소독제QIKELONGAN17-9185
해부 바늘Bioroyee17-9140
꽃 영양 토양FANGJIE
집게HAIOU4-94
빙하 아세트산BOYUAN676-2007
글리세롤SolarbioG8190
자기 교반기IKARET 기본
Micro-Tom토마토 유전학 리소스 센터LA3911
궤도 쉐이커QILINBEIERQB-206
파종 기판PINDSTRUPLV713 / 018-LV252스크리닝 : 0-10 mm
단일 오목 슬라이드HUABODEYI
슬라이드라이카3800381
실체 현미경라이카S8 APO1x 4x 배율
주석 호일ZAOWUFANG613
트윈 20시그마P1379
진공 펌프SHIDINGSHB-III
와류 미터SilogexMX-S
HBDY1895

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. FAOSTAT. , Available from: https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL (2022).
  2. Olmstead, R. G., Bohs, L. A summary of molecular systematic research in Solanaceae: 1982-2006. Acta Horticulturae. 745, 255-268 (2007).
  3. Consortium, T. G.

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