우리는 전송된 신호 감지 기능이 있는 직립 자극 라만 산란 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 타임랩스 이미징을 위한 무대 상단의 유연한 환경 챔버를 보고합니다. 지질 방울은 3분 시간 간격으로 최대 24시간 동안 올레산으로 처리된 SKOV3 세포에서 이미지화되었습니다.
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이 논문에서
요약
초록
자극 라만 산란(SRS) 현미경은 라벨이 필요 없는 화학 이미징 기술입니다. SRS를 사용한 생세포 이미징은 많은 생물학적 및 생물 의학 응용 분야에서 입증되었습니다. 그러나, 살아있는 세포의 장기 타임랩스 SRS 이미징은 널리 채택되지 않았다. SRS 현미경은 고해상도 이미징을 달성하기 위해 높은 개구수(NA) 침수 대물렌즈와 높은 NA 오일 이멀젼 콘덴서를 사용하는 경우가 많습니다. 이 경우 대물렌즈와 콘덴서 사이의 간격은 몇 밀리미터에 불과합니다. 그러므로, 대부분의 상업적인 단계 정상 환경 약실은 단단한 유리제 덮개를 가진 그들의 큰 간격 때문에 SRS 화상 진찰을 위해 이용될 수 없습니다. 이 백서는 정립 현미경 프레임에서 전송된 SRS 신호 감지를 통해 타임랩스 라이브 셀 이미징에 사용할 수 있는 유연한 챔버의 설계 및 제작에 대해 설명합니다. 챔버의 유연성은 얇은 천연 고무 필름 인 부드러운 소재를 사용하여 달성됩니다. 새로운 인클로저 및 챔버 설계는 기존 SRS 이미징 설정에 쉽게 추가할 수 있습니다. 테스트 및 예비 결과는 플렉서블 챔버 시스템이 향후 다양한 바이오이미징 애플리케이션에 사용될 수 있는 살아있는 세포의 안정적이고 장기적인 타임랩스 SRS 이미징을 가능하게 한다는 것을 보여줍니다.
서론
광학 현미경은 샘플의 미세 구조를 관찰하는 데 사용됩니다. 광학 이미징은 다른 기술보다 빠르고, 덜 침습적이며, 덜 파괴적입니다1. 광학 현미경을 이용한 생세포 이미징은 장기간에 걸쳐 배양된 생세포의 역학을 포착하기 위해 개발되었다2. 다양한 유형의 광학 대비는 생물학적 샘플에 대한 뚜렷한 정보를 제공합니다. 예를 들어, 광학 위상 현미경은 샘플3에 걸친 굴절률의 미묘한 차이를 보여줍니다. 형광 현미경은 특정 생체 분자 또는 세포 소기관을 이미지화하는 데 널리 사용됩니다. 그러나, 형광의 광대역 여기 및 방출 스펙트럼은 일반적으로 다색 이미징이 수행될 때 스펙트럼 중첩을 초래한다4. 형광 분자는 빛에 민감하며 장기적이고 주기적으로 빛에 노출되면 표백될 수 있습니다. 또한, 형광 표지는 세포 내 분자의 생체 분포를 변화시킬 수 있다5. SRS 현미경은 무표지 화학 이미징 기술입니다6. SRS의 대비는 특정 화학 결합의 진동 전이에 의존합니다. 화학 결합의 진동 주파수는 종종 좁은 스펙트럼 대역폭을 나타내므로 동일한 샘플에서 여러 라만 대역을....
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프로토콜
1. 현미경 환경 인클로저 구축
참고: 이 대형 현미경 환경 인클로저는 현미경 본체의 온도와 이미징 환경을 37°C에서 안정화하는 데 사용됩니다(그림 1A).
- 광학 테이블의 마커 펜을 사용하여 SRS 현미경 프레임과 전동 스테이지의 발 위치를 표시합니다. 현미경의 검류계 스캐너 앞에 두 개의 홍채 다이어프램을 장착하고 펌프와 Stokes 레이저 빔이 조리개 다이어프램의 중앙을 통과하도록 조정합니다.
- 현미경 프레임과 s를 제거합니다.tage 광학 테이블에서.
- 실리콘 고무 시트(크기: 31 x 29인치, 두께: 1/8인치)를 광학 테이블(그림 1B)에 놓습니다.
- 칼을 사용하여 표시를 따라 실리콘 고무를 자르고 작은 고무 조각을 제거한 다음 정사각형 MICA 세라믹 시트(크기: 6 x 6인치, 두께: 1/4인치)를 같은 위치에 놓습니다.
참고: MICA 세라믹은 가공하기 쉬운 소재입니다15. 알루미늄만큼 단단하지만 우수한 단열재입니다. MICA 세라믹 시트는 금속 현미경 프레임과 스테이지에서 스테인리스 스틸 광학 테이블로의 ....
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결과
타임랩스 SRS 이미징을 위한 플렉시블 챔버 시스템을 제작 및 조립한 다음(그림 1 및 그림 2) 시스템의 성능을 평가했습니다. 현미경 환경 인클로저 내부의 온도는 1시간 이내에 예상 37°C에 도달했으며, 이는 실내 온도에 큰 영향을 미치지 않았습니다(그림 3A). 가요성 챔버 내의 온도는 1.5 시간 내에 37 °C에 도달하였고, 적어도 24 시간 동안 37 °C에서 안정적으로 유지되었다 (도 3B). 플렉시블 챔버의 상대 습도는 1시간 내에 85%에 도달할 수 있으며 최소 24시간 동안 유지될 수 있습니다(그림 3C). 측정된 온도 및 습도 데이터는 이 시스템이 장기적인 세포 성장을 위한 최적의 환경을 제공할 수 있음을 확인합니다.
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토론
타임랩스 라이브 셀 SRS 현미경은 라벨 없는 방식으로 분자 추적을 위한 대체 이미징 기술입니다. 형광 표지와 비교하여 SRS 이미징은 광표백이 없어 분자를 장기간 모니터링할 수 있습니다. 그러나, 현재까지, 직립 SRS 현미경 상의 라이브 세포 이미징 시스템은 상업적으로 이용가능하지 않다. 이 작업에서는 안정적인 단열 현미경 인클로저 상자와 유연한 내부 소프트 챔버가 있는 라이브 셀 이미징 시스템을 개발하여 전송된 SRS 타임랩스 이미징을 가능하게 했습니다. 이 설정에서 대형 인클로저 박스는 37°C에서 온도 안정성을 유지하는 반면, 내부 소프트 챔버는 가습된 공기를 공급하여 최적의 세포 배양 환경을 구축합니다. 이 연구에서 입증된 유연한 개방 챔버는 살아있는 세포의 장기 SRS 이미징을 위한 간단한 워크플로우를 가능하게 합니다. 유리 바닥 접시에 파종된 세포는 이미징을 위해 유연한 온스테이지 챔버로 옮기기 전에 먼저 일반 인큐베이터에서 준비 및 배양할 수 있습니다. 라이브 세포 SRS 이미징을 수행하기 위한 대안적인 해결책은.......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
현미경 인클로저 상자의 설계, 제작 및 테스트에 대해 Binghamton University의 2019년 학부 수석 디자인 팀(윤석철, Ian Foxton, Louis Mazza 및 James Walsh)에게 감사드립니다. 도움이 되는 토론을 해주신 Binghamton University의 Scott Hancock, Olga Petrova, Fabiola Moreno Olivas에게 감사드립니다. 이 연구는 수상 번호 R15GM140444에 따라 국립 보건원(National Institutes of Health)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 실험실에서 제작한 SRS 현미경 | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50MHz 락인 앰플리버 | 취리히 악기 | HF2LI | |
| 조리개 다이어프램 | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| Kinematic Mirror Mount | Thorlabs Inc | KM100 | |
| 현미경 프레임 | Nikon Inc | FN-1 | |
| 전동 현미경 검사 단계 | : Prior Scientific | Z-Deck | |
| 오일 이멀젼 콘덴서(C-AA, Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
| 침수 대물렌즈(CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon | Inc MRD77225 | |
| 현미경 인클로저용 재료 및 부품(31'' x 29'' x 28'' L x W x H) | |||
| Airtherm 히터 모듈 | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Airtherm 히터 컨트롤러, CO2 및 습도 모니터 | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
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| 다목적 6061 알루미늄 바(8'' x 8'', 두께 3/8' ') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| 대물렌즈 노즈피스(단일) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| 샘플 홀더(수정) | Prior Scientific | HZ202 | |
| 초박형 천연 고무 필름(두께 0.01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| 진공 밀봉 유리 항아리 | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ (피지) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS 이미징 소프트웨어 | |
| Materials for live-cell imaging | |||
| Cover glass bottom sterile culture dish (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
| DMEM 세포 배양 배지 | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor 형광 염료 DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Oleic acid | MilliporeSigma | 364525 | |
| SKOV3 세포주 | ATCC | HTB-77 |
참고문헌
- Mertz, J. Introduction to Optical Microscopy. , Cambridge University Press. (2019).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G.
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