Ube3a 변이체의 기능 평가를 위한 확장 가능한 세포 기반 방법
Summary
기능 상실 및 획득이 Angelman 증후군 및 자폐 스펙트럼 장애와 관련된 유전자인 Ube3a에서 잘못된 센스 변이체의 기능적 중요성을 평가하기 위해 간단하고 확장 가능한 방법이 개발되었습니다.
Abstract
의학에서 시퀀싱의 사용이 증가함에 따라 인간 게놈에서 수백만 개의 코딩 변이가 확인되었습니다. 이러한 변이의 대부분은 신경 발달 장애와 관련된 유전자에서 발생하지만 대다수의 변이체의 기능적 중요성은 아직 알려지지 않았습니다. 본 프로토콜은 자폐증 및 Angelman 증후군 모두에 연결된 E3 유비퀴틴 리가 아제를 암호화하는 유전자 인 Ube3a에 대한 변이체 연구를 설명합니다. Ube3a 의 복제 또는 삼중 복제는 자폐증과 밀접한 관련이 있지만 결실은 Angelman 증후군을 유발합니다. 따라서 UBE3A 단백질 활성의 변화의 원자가를 이해하는 것은 임상 결과에 중요합니다. 여기서, Ube3a 변이체를 Wnt 경로 리포터와 페어링하는 신속한 세포 기반 방법이 설명된다. 이 간단한 분석은 확장 가능하며 모든 Ube3a 변이체에서 활성 변화의 원자가 및 크기를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 또한이 방법의 기능을 통해 UBE3A의 효소 메커니즘에 대한 깊은 통찰력을 얻는 데 사용할 수있는 풍부한 구조 기능 정보를 생성 할 수 있습니다.
Introduction
최근의 기술 발전으로 엑솜과 게놈의 시퀀싱이 임상 환경 1,2에서 일상화되었습니다. 이로 인해 일반적으로 단백질에서 하나의 아미노산을 변경하는 수백만 개의 잘못된 변이를 포함하여 많은 유전 적 변이가 발견되었습니다. 이러한 변이의 기능적 중요성을 이해하는 것은 여전히 어려운 과제이며, 알려진 missense 변이체 중 소수(~2%)만이 임상적 해석을 가지고 있습니다1,3.
이 문제의 두드러진 예는 분해를 위해 기질 단백질을 표적으로 하는 E3 유비퀴틴 리가아제를 암호화하는 유전자인 Ube3a입니다4. Ube3a는 염색체 15q11-13 내에 있으며 모계 유전 대립 유전자 5,6,7에서만 독점적으로 발현됩니다. 질병 유전학의 관찰은 UBE3A 효소의 불충분하거나 과도한 활성이 뚜렷한 신경 발달 장애를 유발한다는 것을 강력하게 시사합니다. 모체 염색체 15q11-13의 결실은 심각한 지적 장애, 운동 장애, 발작, 잦은 미소를 가진 행복한 태도 및 이형 얼굴 특징 8,9,10을 특징으로하는 장애 인 Angelman 증후군 (AS)8을 유발합니다. 대조적으로, 모체 염색체 15q11-13의 복제 또는 삼중은 자폐증의 가장 널리 퍼진 증후군 형태 중 하나로 인식되는 이질적인 상태 인 Dup15q 증후군을 유발합니다11,12,13. 또한 Ube3a에서 확인된 수백 개의 잘못된 변이체가 있으며, 그 중 대부분은 기능적 및 임상적 중요성이 알려지지 않았기 때문에 불확실한 중요성(VUS)의 변이체로 간주됩니다. 따라서, Ube3a 변이체가 신경발달 질환에 기여하는지 여부를 결정하기 위해 경험적으로 평가할 수 있는 방법을 개발하는 데 상당한 관심이 있다.
UBE3A 효소는 E3 유비퀴틴 리가아제의 HECT (E6-AP C- 말단과 상동) 도메인 패밀리에 속하며, 모두 E2 효소로부터 활성화 된 유비퀴틴을 받아들이고 기질 단백질14로 전달하는 데 필요한 생화학 적 기계를 포함하는 시조 HECT 도메인을 소유한다. 역사적으로 E3 효소의 특성 분석은 정제 된 단백질 4,15,16의 앙상블을 필요로하는 재구성 된 시험관 내 시스템에 의존했습니다. 이러한 방법은 느리고 노동 집약적이며 많은 변종의 활동을 평가할 수 없습니다. 이전 연구에서 UBE3A는 프로테아좀의 기능을 조절하여 β-카테닌17의 분해를 늦춤으로써 HEK293T 세포에서 Wnt 경로를 활성화하는 것으로 확인되었습니다. 이러한 통찰력은 Ube3a18의 기능 손실 및 획득 변이체를 식별하는 효율적이고 신속한 방법으로 Wnt 경로 리포터를 사용할 수 있게 한다. 아래 프로토콜은 Ube3a 변이체의 활성 변화를 평가하기 위한 루시페라아제 기반 리포터뿐만 아니라 Ube3a 변이체를 생성하는 방법을 자세히 설명합니다.
Protocol
1. Ube3a 변이체를 생성하기 위한 돌연변이 유발 클로닝
- 모든 Ube3a 변이체를 pCIG2 플라스미드 (그림 1A), EGFP 발현19에 대한 닭-β-액틴 프로모터 및 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 포함하는 비시스트로닉 벡터 내로 복제합니다. 전장 Ube3a 구축물은 N-말단 Myc-태그 서열을 함유하고, 5′ SacI 부위 및 3′ XmaI 부위를 사용하여 pCIG2로 클로닝된다. 또한, Ube3a 코딩 서열 내의 자연 발생 EcoRI, EcoRV 및 PstI 부위도 서브클론 단편에 사용된다.
참고: Ube3a 에 대한 식별되지 않은 변이체는 문헌 및 ClinVar 데이터베이스와 같은 공개적으로 액세스할 수 있는 리포지토리를 통해 얻을 수 있습니다.1. 보고되지 않은 추가 변종은 의료 센터와의 개인적인 의사 소통을 통해 얻을 수 있습니다. - 적응된 2단계 메가프라이머 돌연변이유발법20 을 사용하여 Ube3a 판독 프레임에 돌연변이를 도입합니다. 첫 번째 단계에서, 돌연변이에 대한 상동성 5′ 및 3’의 최소 30개의 염기쌍(bp)에 의해 측면에 원하는 돌연변이(이 프로토콜에 표시된 예는 UBE3A Q588E 변이체를 생성하는 것임)를 포함하는 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오티드를 설계합니다(그림 1B 및 표 1).
- 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오티드를 제1라운드 PCR에 상보적 올리고뉴클레오티드와 함께 사용하여 돌연변이를 포함하는 200-400 bp 메가프라이머를 생성한다(도 1C; 표 2 및 표 3). 1% 겔을 사용하고 후속 겔 정제를 사용하여 아가로스 겔 전기영동을 위해 PCR 반응 부피의 전체 50 μL를 사용한다(재료 표). 아래의 제2 라운드 PCR 단계에서 사용하기 위해 30 μL의 탈이온화된 H2O(diH2O)의 PCR 산물을 용리시킨다.
- 표시된 대로 제2 라운드 PCR을 설정합니다(그림 1C; 표 2 및 표 3). 이 단계는 서브 클로닝에 적합한 돌연변이 및 말단 제한 부위를 포함하는 더 큰 DNA 단편 (일반적으로 ~ 1-1.5kb 길이)을 생성합니다 (그림 1C).
- PCR 반응 완료 후, PCR 정제 키트(재료 표)를 이용하여 생성된 생성물을 정제한다. 30 μL에서 용리시키고, 모든 정제된 생성물 및 pCIG2 및 Ube3a WT 구축물을 적절한 제한 효소로 소화시킨다 (실시예는 EcoRI 및 XmaI를 사용한 소화를 나타낸다).
- 37°C에서 2시간 분해한 후, 아가로스 겔 전기영동(1% 겔)을 통해 분해 생성물을 분해하고, 적절한 생성물을 겔-정제한다. 제조업체의 프로토콜(재료 표)에 따라 결찰을 설정하고 결찰 제품을 DH10B 박테리아 균주(재료 표)로 변환한 다음 선택한 암피실린(100μg/mL)으로 플레이트합니다.
- 다음 날, 2-4개의 콜로니를 선택하여 Luria 브로스(LB)와 100μg/mL 암피실린이 포함된 3mL 배양균을 접종합니다. 배양물을 진탕(225 rpm)을 갖는 궤도 배양기에서 37°C에서 밤새 성장시켰다.
- 다음 날, 1-1.5mL의 박테리아 배양을 사용하여 플라스미드 DNA(재료 표)를 미니프렙합니다. 남은 배양액을 4°C에 두어 저장합니다. 원하는 돌연변이로부터 ~200bp에 결합하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 Sanger 시퀀싱으로 미니프렙된 플라스미드를 스크리닝합니다.
- 4°C에서 저장된 박테리아 배양물을 사용하여 50 mL 배양물을 다시 접종하여 올바른 플라스미드를 midiprep으로 접종합니다(재료 표). Ube3a 코딩 서열을 완전히 시퀀싱하여 DNA의 올바른 서열을 검증합니다.
- 후속 형질감염 단계를 위해 멸균 H2O를 사용하여 100ng/μL 농도로 Ube3a 변이체 플라스미드 및 β-카테닌 활성화 리포터(BAR)21, TK-레닐라 루시페라제, 리가아제 사멸 Ube3a(UBE3A C820A돌연변이) 및 pCIG2 빈 벡터의 작업 스톡을 생성합니다.
2. 인간 배아 신장 293T(HEK293T) 세포의 제조 및 형질감염
- 앞서 설명한 대로 글루타민, 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 항생제-항진균제가 미리 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM)에서 성장한 HEK293T 세포에서 분석을 수행합니다17. 세포를 37°C의 멸균 가습 인큐베이터에서 5%CO2로 성장시킨다.
- 생물안전 캐비닛을 사용하여 먼저 부유된 HEK293T 세포를 100μL의 배양 배지에서 웰당 2.2 × 10개의4 개의 세포로 조직 배양 처리된 96웰 평평한 바닥 플레이트에 플레이트하고 밤새 성장하도록 합니다.
- 둘째 날에, 세포를 생물안전 캐비닛에서 반딧불이 및 레닐 라 루시퍼라아제 리포터 플라스미드 (표 4) 및 Ube3a 플라스미드를 삼중으로 형질감염시켰다. 앞서 기술한 바와 같이 10:1:8 비율의 플라스미드(각각 웰당 50ng의 BAR, 5ng의 TK-Renilla 및 40ng의 Ube3a 플라스미드)를 사용하여 웰당 총 부피 10μL의 형질감염을 수행하고,18, 및 0.4μL의 형질주입 시약을 수행한다(표 4).
참고: 각 실험에 대해 빈 벡터(GFP만 해당) 및 리가아제 사멸 Ube3a 를 코딩하는 플라스미드도 형질감염되어 음성 대조군으로 사용됩니다. - 1.5mL 마이크로원심분리 튜브(표 4)에서 각 변이체에 대한 형질주입을 위한 마스터 믹스를 만들고 실온(RT)에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후, 튜브를 두드려 형질주입 혼합물을 부드럽게 교반한 다음, 형질주입 혼합물 10μL를 웰의 기존 성장 배지에 직접 첨가한다.
- 그런 다음 세포를 인큐베이터로 되돌리고 플라스미드가 48시간 동안 발현되도록 합니다. 성장 배지의 교체는 필요하지 않습니다.
- 형광 현미경을 사용하여 GFP 형광에 의한 형질감염 효율을 모니터링한다. HEK293T 세포는 이 방법으로 효율적으로 형질감염되며 세포의 >80%가 48시간 후에 GFP를 발현해야 합니다.
3. 루시퍼라아제 활성 측정
참고: 루시페라아제 활성은 제조업체의 프로토콜에 따라 반딧불이 및 레닐 라 루시퍼라아제(재료 표)를 모두 분석하는 상업적으로 이용 가능한 시스템을 사용하여 평가됩니다.
- 형질감염된 HEK293T 세포에서 배양 배지를 조심스럽게 흡인한 다음 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세척합니다. PBS를 흡인하고 25μL의 비변성 용해 완충액을 추가하여 세포를 용해하고 얼음 위에서 부드럽게 흔들면서 15분 동안 배양합니다.
- 그런 다음 생성된 용해물 20μL(원심분리 필요 없음)를 Firefly 루시퍼라제 기질 시약 100μL가 포함된 새로운 96웰 분석 플레이트에 추가합니다. 두드려 접시를 부드럽게 섞습니다.
- 플레이트를 플레이트 리더에 로드하고 판독 높이가 1mm이고 적분 시간이 1초인 상단 검출기를 사용하여 발광을 측정합니다.
알림: 감지기의 게인은 신호 강도에 따라 조정해야 할 수 있습니다. - 반딧불이 루시퍼라아제 발광을 읽은 직후, 100 μL의 레닐라 루시퍼라아제 기질을 웰에 첨가한다. 이 단계는 반딧불이 루시퍼라아제 활성을 동시에 소멸시키면서 레닐라 루시퍼라아제 활성을 평가한다. 플레이트의 부드러운 교반에 의해 샘플을 혼합하고 다시 발광을 측정하여 레닐 라 루시퍼라아제 활성을 평가하였다.
알림: 이 분석에는 다른 플레이트를 사용할 수 있지만 검은색 프레임과 흰색 웰이 있는 플레이트를 사용하면 노이즈를 최소화하면서 루시퍼라아제 신호를 증폭하므로 가장 민감한 결과를 얻을 수 있습니다. - 리포터 반응을 반딧불이 루시퍼라아제 대 레 닐 라 루시퍼라아제 비율(반딧불이/레닐라)로 정량화하고, 삼중 측정의 값을 평균화한다. 그 후, 각 변이체에 대한 Firefly/Renilla 값을 야생형(WT) Ube3a 발현 세포의 값에 대해 정규화하여 변이체 단백질의 상대적 활성을 비교합니다.
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 프로토콜은 Ube3a 변이체의 효소 활성을 평가하기 위한 효율적이고 확장 가능한 방법을 제공합니다. 이 분석을 사용할 때 신중하게 고려해야 할 몇 가지 기술적 세부 사항이 있습니다. 한 가지 고려사항은 본 분석에 사용된 Wnt 리포터 플라스미드의 선택이다. 여기에 설명된 프로토콜은 TCF 결합 부위의 재조합 및 손실을 최소화하기 위해 특별히 설계된 링커 서열로 분리된 12개의 T 세포 인자(TCF) 반응 요소의 연결기를 포함하는 리포터인 β-카테닌 활성화 리포터(BAR)21을 구체적으로 사용합니다. 문헌23에 기재된 추가의 루시페라아제계 Wnt 리포터 플라스미드가 있으며, 이전의 연구에서 일부가 UBE3A 활성을 평가하는데 사용될 수 있음을 나타내지만, BAR 플라스미드는 이러한 목적을 위해 가장 철저하게 특성화되었다17,18. 둘째, 레닐라 루시페라아제 플라스미드의 선택이 중요합니다. 레닐라 루시퍼라제를 코딩하는 플라스미드가 형질감염 효율을 정상화하기 위해 형질감염 단계 동안 포함된다. 이 프로토콜에 사용된 플라스미드는 티미딘 키나제(TK) 프로모터(TK-레닐라)의 제어 하에 레닐라 루시퍼라아제를 구성적으로 발현합니다. 널리 사용되는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터와 같은 다른 프로모터를 함유하는 플라스미드의 사용은 레닐라 루시퍼라아제 발현에서 다양한 결과를 초래할 수 있다.
두 번째 고려 사항은 세포 배양에 사용되는 FBS의 유형과 로트에 따른 세포의 거동입니다. 예를 들어, FBS는 HEK293T 세포의 성장 속도에 가변적으로 영향을 미칠 수 있습니다. 현재 프로토콜은 18-24시간의 전형적인 배가 시간을 나타내는 세포로 최적화되어, 형질감염 시 세포 밀도를 웰당 대략 ×~4 내지 104 세포로 만들었다. 세포 밀도가 형질감염 효율에 영향을 미칠 수 있으므로, 세포 성장 속도는 사용자에 의해 신중하게 평가되어야 하고 세포 수는 도금시에 그에 따라 조정되어야 한다. 추가적으로, UBE3A-의존성 BAR 반응은 실험 중에 일정량의 Wnt 리간드가 존재할 것을 필요로 한다. 대부분의 표준 조건에서 FBS에는 이 응답을 구동하기에 충분한 Wnt가 있습니다. 그러나 이 응답도 다를 수 있습니다. 형질감염에 사용되는 플라스미드 비율의 적정은 BAR 반응이 적절한 선형 범위 내에서 측정되도록 하기 위해 권장됩니다. 대안적인 접근법은 재조합 Wnt 리간드 또는 Wnt-보충된 성장 배지17을 사용하여 Wnt 신호전달을 자극하는 것이다.
BAR 분석의 장점은 모든 Ube3a 이소형의 유비퀴틴 리가아제 활성을 보고할 수 있다는 것이다. 인간은 대안적인 전사 시작 부위(24)의 사용으로 인해 이들의 극단적인 N-말단에서 상이한 Ube3a의 3개의 이소형을 발현한다. BAR 분석은 이소형에 대해 동일한 판독에 구애받지 않으므로 이 분석을 사용하여 모든 Ube3a 변이체를 평가할 수 있습니다. 또한 Ube3a 변이체의 대규모 특성 분석은 효소 기능에 중요한 새로운 도메인과 메커니즘을 밝힐 수 있는 심층 구조-기능 데이터를 제공합니다. 이전 연구에서는 유비퀴틴 사슬 신장을 촉진하는 UBE3A 내의 유비퀴틴 결합 도메인을 발견하기 위해 변이체 데이터를 활용했습니다18. 추가적인 구조-기능 연구는 치료 개발에 활용될 수 있는 UBE3A의 생화학적 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공할 것입니다.
BAR 분석에는 변이의 병원성을 결정할 때 신중하게 고려해야 하는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 뉴런에서 Ube3a 의 후성유전학적 각인으로 인해 이 분석은 모계 및 부계 대립유전자를 구별할 수 없으며 변이체의 병원성을 결정하기 위해 기능적 데이터와 함께 추가 유전적 증거를 평가해야 합니다. 또한, UBE3A의 유비퀴틴 리가 제 활성을 넘어서는 추가적인 변수는 질병의 맥락에서 고려되어야한다. 예를 들어, 이전의 연구는 핵-국소화된 UBE3A가 Angelman 증후군 병리학25 에 기여하고 일부 변이체가 효소26의 이러한 국소화 패턴을 교란시킨다는 것을 보여주었다. 따라서 신경 발달 병리학에 대한 Ube3a 변이체의 기여를 완전히 이해하기 위해서는 추가적인 다운스트림 특성화를 수행해야 합니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300-054 | |
| 1 Kb DNA ladder | Lambda Biotech | M108-S | |
| 100 bp DNA Ladder | Lambda Biotech | M107 | |
| 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP | New England BioLabs | B0202A | |
| 5x Phusion HF Reaction Buffer | New England BioLabs | B0518S | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30004CI | |
| Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate | PerkinElmer | 6005030 | |
| Carbenicillin Disodium Salt | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Countess II Automated Cell Counter | life technologies | Cell counting machine | |
| Custom DNA oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569044 | Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Restriction enzyme |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | Fetal bovine serum |
| Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes | Fisherbrand | FB012924 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2691 | |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells | Intact Genomics | 1011-12 | E. coli DH10B cells |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | Midi prep |
| pCIG2 plasmid | |||
| pGL3 BAR plasmid | |||
| Phusion HF DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | DNA polymerase |
| ProFlex 3 x 32 well PCR System | Applied biosystems by life technologies | Thermocycler | |
| pTK Renilla plasmid | |||
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini prep |
| QIAquick Gel Extraction Kit (250) | Qiagen | 28706 | Gel purification |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | PCR purification |
| rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Restriction enzyme |
| Synergy HTX Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek) | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202L | Ligase |
| TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP13324 | |
| Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom | Fisherbrand | FB012931 | |
| UltraPure Ethidium Bromide Solution | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
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