디(2-에틸헥실) 프탈레이트가 대사 산물 생산에 미치는 영향을 연구하기 위한 알팔파 뿌리 삼출물 수집

요약

뿌리 삼출물의 분비는 일반적으로 스트레스 조건에서 식물에 대한 외부 해독 전략입니다. 이 프로토콜은 비표적 대사체 분석을 통해 알팔파에 대한 생체이물의 영향을 평가하는 방법을 설명합니다.

초록

뿌리 삼출물은 식물 뿌리와 주변 환경 간의 정보 통신 및 에너지 전달의 주요 매체입니다. 뿌리 삼출물 분비의 변화는 일반적으로 스트레스 조건에서 식물에 대한 외부 해독 전략입니다. 이 프로토콜은 대사 산물 생산에 대한 디(2-에틸헥실) 프탈레이트(DEHP)의 영향을 연구하기 위해 알팔파 뿌리 삼출물 수집에 대한 일반 지침을 도입하는 것을 목표로 합니다. 첫째, 알팔파 묘목은 수경 재배 실험에서 DEHP 스트레스 하에서 재배됩니다. 둘째, 식물을 50mL의 멸균된 초순수가 들어 있는 원심분리기 튜브로 옮겨 6시간 동안 뿌리삼출물을 수집합니다. 그런 다음 용액을 진공 동결 건조기에서 동결 건조합니다. 냉동된 샘플을 추출하고 비스(트리메틸실릴)) 트리플루오로아세트아미드(BSTFA) 시약으로 유도체화합니다. 이어서, 유도체화된 추출물은 비행 시간 질량 분석기(GC-TOF-MS)와 결합된 가스 크로마토그래프 시스템을 사용하여 측정됩니다. 그런 다음 획득한 대사 산물 데이터를 생물정보학적 방법을 기반으로 분석합니다. 뿌리 삼출물의 관점에서 알팔파에 대한 DEHP의 영향을 밝히기 위해 차등 대사 산물과 크게 변화된 대사 경로를 깊이 탐구해야 합니다.

서론

디(2-에틸헥실) 프탈레이트(DEHP)는 가소성과 강도를 향상시키기 위해 가소제로 다양한 플라스틱 및 폴리머에 널리 사용되는 합성 화합물입니다. 지난 몇 년 동안, DEHP가 내분비 교란 물질이며 인간과 다른 동물의 호흡기, 신경계 및 생식계에 악영향을 미친다는 연구 결과가 증가했다 ^1,2,3. 건강 위험을 고려하여 미국 환경 보호국, 유럽 연합 및 중국 환경 모니터링 센터는 모두 DEHP를 우선 오염 물질 목록으로 분류했습니다. 토양은 플라스틱 멀칭 및 유기 비료의 적용, 폐수 관개 및 슬러지 농장 적용으로 인해 환경에서 DEHP의 중요한 흡수원으로 간주되었습니다⁴. 예상대로, DEHP는 농지 토양에서 유비쿼터스로 검출되었으며, 그 함량은 중국 ^5,6의 일부 지역에서 건조 토양 킬로그램 당 밀리그램에 이릅니다. DEHP는 주로 뿌리를 통해 식물에 들어갈 수 있으며 토양 생태계의 다양한 영양 수준에서 생체 확대를 겪을 수 있습니다^7<....

프로토콜

이 프로토콜의 목적은 수경 재배 실험에서 대사 분석에 이르기까지 일반적인 파이프라인을 제공하여 알팔파 뿌리 삼출물에 대한 DEHP의 효과를 정량화하는 것입니다.

1. 수경재배 배양 실험

참고: 이 프로토콜은 다양한 농도의 DEHP의 스트레스 하에서 알팔파(Medicago sativa) 묘목을 얻기 위해 고안된 알팔파 수경 재배 실험의 예를 제시합니다. 세 가지 처리가 설정되었습니다: 첨가물이 없는 대조군과 1mg kg-1 및 10mg ^kg-1의 di(DEHP. DEHP의 농도는 토양²³의 DEHP의 실제 함량에 따라 설정되었습니다. 각 치료에는 6번의 반복이 있었습니다.

1. 알팔파 씨앗을 0.1 % 차아 염소산 나트륨으로 10 분, 75 % 에틸 알코올로 30 분 동안 소독합니다.
   1. 멸균 된 종자를 증류수로 여러 번 헹구고 어두운 곳에서 30 ° C의 멸균 된 페트리 접시에 축축한 여과지로 발아시킵니다.
2. 20 개의 균일하고 발아 된 크고 통통한 종자를 (μM 단위) : Ca (NO 3) ₂

결과

본 실험에서는 상기 방법에 따라 알팔파 뿌리 삼출물을 채취, 추출, 분석하였다(도 1). 대조군, 저농도 DEHP(1mg ^L-1) 및 고농도 DEHP(10mg ^L-1)의 세 가지 처리군을 설정했습니다.

대조군의 크로마토그래프에서 총 778개의 피크가 검출되었으며, 그 중 질량 스펙트럼에 따라 314개의 대사산물을 식별할 수 있었습니다. 그림 2에서 볼 수 있듯이 이러한 대사산물은 상대적 풍부도에 따라 탄수화물(28.6%), 산(15.58%), 지질(13.87%), 알코올(3.91%), 아민(0.92%), 기타(37.12%)의 6가지 유형으로 분류할 수 있습니다. 0.5% 미만을 차지하는 대사산물은 다른 물질로 분류되었습니다(그림 2A). 산은 지방산(56.09%), 아미노산(26.6.......

토론

이 프로토콜은 DEHP 스트레스 하에서 알팔파의 뿌리 삼출물을 수집하고 측정하는 방법과 대사체 데이터를 분석하는 방법에 대한 일반적인 지침을 제공합니다. 이 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계에 세심한 주의를 기울여야 합니다. 수경 재배 실험에서, 알팔파 묘목은 DEHP의 농도가 다른 영양 용액으로 채워진 유리 병에서 수경 재배 배양되었다. 유리병은 DEHP가 광분해되는 것을 방지하고 모든 배양 용액에서 DEHP 농도의 균일성을 보장하기 위해 배양 기간 동안 알루미늄 호일로 덮어 빛으로부터 보호해야 합니다^25,26. DEHP 농도는 DEHP^27,28로 오염 된 토양에서 일반적으로 발견되는 농도에 따라 1 mg L-1 및 1 mg ^L-1로 설정되었습니다. 뿌리 삼출물을 수집하는 동안 원심.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아도니톨	시그마		≥ 99%
알팔파 씨앗	Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)
분석 저울	Sartorius	BSA124S-CW
BSTFA	REGIS Technologies		with 1% TMCS, V/V
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	Heraeus Fresco17
크로마토그래피 컬럼	애질런트	DB-5MS (30m × 250 μ m &시간; 0.25 &무; m)
디 (2- 에틸 헥실) 프탈레이트	Dr. Ehrenstorfer
FAMEs	Dr. Ehrenstorfer
가스 크로마토 그래피 (GC)	애질런트	7890A
연삭 기기	Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd	JXFSTPRP-24
질량 분석기 (MS)	LECO	PEGASUS HT
메탄올	CNW Technologies		HPLC
Methoxyaminatio hydrochloride	TCI		AR
미세 원심 분리기 튜브	Eppendorf	Eppendorf Quality	1.5 mL
오븐	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd	DHG-9023A
피리딘	아다마스		HPLC
R 소프트웨어			통계 분석 소프트웨어(경로 강화, 토폴로지)
SIMCA16.0.2			통계 분석 소프트웨어 (OPLS-DA 등)
초저온 냉동고	Thermo Fisher Scientific	Forma 900 시리즈
초음파	심천 Fangao Microelectronics Co., Ltd	YM-080S
진공 건조기	Taicang Huamei 생화학 기기 공장	LNG-T98