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방법 논문

디(2-에틸헥실) 프탈레이트가 대사 산물 생산에 미치는 영향을 연구하기 위한 알팔파 뿌리 삼출물 수집

2.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/64470

⸱

2023년 6월 2일

 ,  ,  , 
1Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, 2College of Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences

이 논문에서

요약

뿌리 삼출물의 분비는 일반적으로 스트레스 조건에서 식물에 대한 외부 해독 전략입니다. 이 프로토콜은 비표적 대사체 분석을 통해 알팔파에 대한 생체이물의 영향을 평가하는 방법을 설명합니다.

초록

뿌리 삼출물은 식물 뿌리와 주변 환경 간의 정보 통신 및 에너지 전달의 주요 매체입니다. 뿌리 삼출물 분비의 변화는 일반적으로 스트레스 조건에서 식물에 대한 외부 해독 전략입니다. 이 프로토콜은 대사 산물 생산에 대한 디(2-에틸헥실) 프탈레이트(DEHP)의 영향을 연구하기 위해 알팔파 뿌리 삼출물 수집에 대한 일반 지침을 도입하는 것을 목표로 합니다. 첫째, 알팔파 묘목은 수경 재배 실험에서 DEHP 스트레스 하에서 재배됩니다. 둘째, 식물을 50mL의 멸균된 초순수가 들어 있는 원심분리기 튜브로 옮겨 6시간 동안 뿌리삼출물을 수집합니다. 그런 다음 용액을 진공 동결 건조기에서 동결 건조합니다. 냉동된 샘플을 추출하고 비스(트리메틸실릴)) 트리플루오로아세트아미드(BSTFA) 시약으로 유도체화합니다. 이어서, 유도체화된 추출물은 비행 시간 질량 분석기(GC-TOF-MS)와 결합된 가스 크로마토그래프 시스템을 사용하여 측정됩니다. 그런 다음 획득한 대사 산물 데이터를 생물정보학적 방법을 기반으로 분석합니다. 뿌리 삼출물의 관점에서 알팔파에 대한 DEHP의 영향을 밝히기 위해 차등 대사 산물과 크게 변화된 대사 경로를 깊이 탐구해야 합니다.

서론

디(2-에틸헥실) 프탈레이트(DEHP)는 가소성과 강도를 향상시키기 위해 가소제로 다양한 플라스틱 및 폴리머에 널리 사용되는 합성 화합물입니다. 지난 몇 년 동안, DEHP가 내분비 교란 물질이며 인간과 다른 동물의 호흡기, 신경계 및 생식계에 악영향을 미친다는 연구 결과가 증가했다 1,2,3. 건강 위험을 고려하여 미국 환경 보호국, 유럽 연합 및 중국 환경 모니터링 센터는 모두 DEHP를 우선 오염 물질 목록으로 분류했습니다. 토양은 플라스틱 멀칭 및 유기 비료의 적용, 폐수 관개 및 슬러지 농장 적용으로 인해 환경에서 DEHP의 중요한 흡수원으로 간주되었습니다4. 예상대로, DEHP는 농지 토양에서 유비쿼터스로 검출되었으며, 그 함량은 중국 5,6의 일부 지역에서 건조 토양 킬로그램 당 밀리그램에 이릅니다. DEHP는 주로 뿌리를 통해 식물에 들어갈 수 있으며 토양 생태계의 다양한 영양 수준에서 생체 확대를 겪을 수 있습니다7. 따라서 최근 수십 년 동안 식물에서 DEHP로 인한 스트레스에 대한 상당한 우려가 제기되었습니다.

식물은 일반적으로 DEHP 노출에 취약합니다. DEHP 스트레스는 종자 발아 및 정상적인 신진대사에 악영향을 미쳐 식물의 성장과 발육을 억제하는 것으로 관찰되었다 8,9. 예를 들어, DEHP는 엽엽 세포에 산화적 손상을 유도하고, 엽록소 및 삼투압의 함량을 감소시키며, 항산화 효소 활성을 증가시켜 결국 식용 식물의 수확량과 품질을 감소시킬 수 있습니다10,11. 그러나 DEHP 스트레스에 대한 식물의 반응에 대한 이전 연구의 대부분은 산화 스트레스와 생리적, 생화학적 특성에 초점을 맞추었습니다. 식물 대사와 관련된 해당 메커니즘은 덜 연구되었습니다. 뿌리 삼출물은 식물 뿌리가 분비되어 환경으로 방출되는 화합물을 설명하는 일반적인 용어입니다. 식물과 근권 토양 사이의 상호 작용 매개체로 간주되어 식물의 성장과 발달을 지원하는 데 중요한 역할을 합니다12. 뿌리 삼출물이 모든 광합성 탄소13의 약 30%-40%를 차지한다는 것은 잘 알려져 있습니다. 오염된 환경에서 뿌리 삼출물은 신진대사 또는 외부 배제를 통해 오염 물질의 스트레스에 대한 식물의 내성을 향상시키는 데 관여한다14. 결과적으로, 오염 스트레스에 대한 식물 뿌리 삼출물의 반응에 대한 깊은 이해는 세포 생화학 및 생물학적 현상과 관련된 기본 메커니즘을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다15.

대사체학(Metabolomics) 기술은 세포(16, 17), 조직(18), 심지어 당, 유기산, 아미노산 및 지질을 포함한 유기체(19)의 삼출물 내에서 많은 수의 소분자 대사산물을 동시에 측정하기 위한 효율적인 전략을 제공한다. 전통적인 화학 분석 방법이나 기존의 화학 분석 방법과 비교했을 때, 대사체학 접근법은 검출할 수 있는 대사산물의 수를 크게 증가시켜20개를 검출할 수 있으며, 이는 더 높은 처리량의 방식으로 대사 산물을 식별하고 주요 대사 경로를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 대사체학은 중금속21, 신종 오염 물질22 및 나노 입자19와 같은 스트레스 환경에서의 생물학적 반응 연구 분야에서 널리 사용되어 왔습니다. 식물에 대한 이러한 연구의 대부분은 내부 식물 조직의 대사 변화에 초점을 맞춘 반면, 환경 스트레스에 대한 뿌리 삼출물의 반응에 대해서는 보고된 바가 거의 없습니다. 따라서 본 연구의 목적은 DEHP가 대사산물 생산에 미치는 영향을 연구하기 위해 알팔파 뿌리 삼출물 수집에 대한 일반적인 지침을 도입하는 것입니다. 결과는 DEHP에 의한 식물 대사체학의 후속 연구를 위한 방법 지침을 제공할 것입니다.

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프로토콜

이 프로토콜의 목적은 수경 재배 실험에서 대사 분석에 이르기까지 일반적인 파이프라인을 제공하여 알팔파 뿌리 삼출물에 대한 DEHP의 효과를 정량화하는 것입니다.

1. 수경재배 배양 실험

참고: 이 프로토콜은 다양한 농도의 DEHP의 스트레스 하에서 알팔파(Medicago sativa) 묘목을 얻기 위해 고안된 알팔파 수경 재배 실험의 예를 제시합니다. 세 가지 처리가 설정되었습니다: 첨가물이 없는 대조군과 1mg kg-1 및 10mg kg-1의 di(DEHP. DEHP의 농도는 토양23의 DEHP의 실제 함량에 따라 설정되었습니다. 각 치료에는 6번의 반복이 있었습니다.

  1. 알팔파 씨앗을 0.1 % 차아 염소산 나트륨으로 10 분, 75 % 에틸 알코올로 30 분 동안 소독합니다.
    1. 멸균 된 종자를 증류수로 여러 번 헹구고 어두운 곳에서 30 ° C의 멸균 된 페트리 접시에 축축한 여과지로 발아시킵니다.
  2. 20 개의 균일하고 발아 된 크고 통통한 종자를 (μM 단위) : Ca (NO 3) 2, 3,500; NH4H2PO4, 1,000; KNO3, 6,000; MgSO4, 2,000; Na2Fe- 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 75; H3BO3, 46; 망간소4, 9.1; ZnSO4, 0.8; CuSO4, 0.3; 및 (NH4)6Mo7O24, 0.02. 0.1 M KOH를 사용하여 용액 pH를 7.0으로 조정한다. 매주 모든 솔루션을 갱신하십시오.
  3. 모든 배양 병을 150-180 μmol m-2s-1의 광도를 갖는 제어된 성장 챔버에 각각 낮(16시간) 및 밤(8시간)을 나타내는 27°C 및 20°C에서 매일 16시간의 광주기로 배치합니다.
  4. 2주 후 1 mg kg-1 및 1 mg kg-1 DEHP 스트레스 하에서 배양 실험을 위해 15개의 균일한 알팔파 묘목을 새 유리병에 옮깁니다. 유리병을 알루미늄 호일과 파라필름으로 감싸 DEHP의 광분해 및 휘발을 방지합니다. 동일한 조건을 적용하려면 제어 병을 알루미늄 호일과 파라필름으로 감쌉니다. 액체 수준을 유지하기 위해 매일 영양 용액을 보충하십시오.
  5. 알팔파 묘목의 일관된 성장 조건을 보장하기 위해 2일마다 병을 무작위로 놓고 회전시킵니다.
  6. 재배 7 일 후, 병에서 알팔파 묘목을 제거하고 초순수로 여러 번 씻어 뿌리 삼출물 수집을 준비합니다.

2. 뿌리 삼출물의 수집, 추출 및 대사 분석

참고: 이 프로토콜은 수집 실험, 추출 실험 및 뿌리 삼출물의 대사 분석의 세 부분으로 나뉩니다. 수집 실험의 목표는 후속 추출을 위해 식물 샘플에서 분비된 대사 산물을 용액 시스템으로 전달하는 것입니다.

  1. 수집 실험
    1. 10개의 균일한 알팔파 묘목을 50mL의 멸균된 탈이온수로 채워진 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 뿌리를 물에 담그고 6시간 동안 뿌리 삼출물을 수집합니다. 튜브를 똑바로 세우십시오. 각 처리에 대해 최소 6번의 반복실험을 수행합니다.
    2. 원심분리기 튜브를 알루미늄 호일로 감싸 뿌리를 빛으로부터 보호합니다.
    3. 식물을 제거하고 대사 산물 프로파일링을 위해 수집된 액체를 동결 건조합니다.
  2. 추출 실험
    1. 1.8mL의 추출 용액(메탄올:H2O= 3:1, V/V)을 튜브에 넣고 30초 동안 소용돌이칩니다.
    2. 얼음물 욕조에서 10 분 동안 튜브에 초음파를 가하십시오.
    3. 시료를 4°C 및 11,000× g 에서 15분 동안 원심분리합니다.
    4. 200μL의 상층액을 1.5mL 미세원심분리기 튜브에 조심스럽게 옮깁니다. 각 샘플에서 45 μL의 상층액을 취하여 샘플의 대사체 데이터 보정에 사용되는 270 μL의 최종 부피로 품질 관리(QC) 샘플에 혼합합니다.
    5. 추출물을 진공 농축기에서 동결 건조합니다. 5 μL의 내부 표준물질(리보뉴클레올)로 건조를 계속한다.
    6. 진공 농축기에서 증발시킨 후 30μL의 메톡시아민화 염산염(20mg mL-1 농도의 피리딘에 용해됨)을 튜브에 넣고 튜브를 80°C에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 40μL의 BSTFA(bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide) 시약(1% 트리메틸클로로실란[TMC], V/V 포함)을 샘플에 추가하고 유도체화를 위해 튜브를 70°C에서 1.5시간 동안 둡니다.
    7. 샘플을 실온으로 냉각하고 5 μL의 지방산 메틸 에스테르 (FAME) (클로로포름)를 QC 샘플에 첨가하십시오.
  3. 대사체 분석
    1. 유도체화된 추출물 1.0μL을 비분할 모드를 사용하여 대사체 프로파일링 분석을 위해 비행 시간 질량 분석기(GC-TOF-MS)에 연결된 가스 크로마토그래프 시스템에 주입합니다.
      1. 모세관 컬럼(30 m x 250 μm x 0.25 μm)을 사용하여 1.0 mL min-1의 유속으로 운반 가스로 헬륨을 사용합니다. 주입 온도를 280°C로 설정하고, 이송관 온도와 이온 소스 온도를 각각 280°C와 250°C로 유지한다.
      2. 분리를 위해 다음 오븐 프로그램을 사용하십시오: 50°C에서 1분 등온 가열, 10°C/min-1 오븐 램프에서 310°C로, 최종 등온 가열을 310°C에서 8분 동안 가열합니다.
      3. -70eV의 에너지로 전자 충돌 모드를 수행합니다. 12.5 spectra/s의 속도로 50-500 m/z의 질량 스캔 범위를 가진 전체 스캔 모니터링 모드를 사용하여 질량 스펙트럼을 얻습니다.
    2. 개별 피크를 필터링하여 노이즈를 제거합니다. 편차 값은 사분위수 범위를 기준으로 필터링됩니다.
    3. 결측값을 최소값의 절반으로 채우고, 데이터를 표준화하고, 정규화합니다.
    4. 다변량 분석을 위해 .csv 형식의 최종 데이터를 통계 분석 소프트웨어로 가져옵니다.
    5. KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 데이터베이스(생물학적 시스템의 높은 수준의 기능과 유용성을 이해하기 위한 데이터베이스 리소스)에서 대사 산물을 찾아 탄수화물, 산, 지질, 알코올 및 아민과 같은 다양한 범주로 분류합니다. 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 모든 뿌리 삼출물에서 각 범주의 백분율을 나타내는 원형 차트를 구성합니다.
    6. 감독 직교 투영을 OPLS-DA(latent structures-discriminate analysis)에 적용하여 그룹 간의 차이를 입증합니다.
    7. 투영(VIP) > 1 및 p 0.05(Student's t test)의 변수 중요도에 따라 차등 대사산물로 크게 변화된 대사산물을 선별<.
    8. 대사체 데이터를 사용하여 통계 분석 소프트웨어로 히트 맵을 구성하고 다양한 처리에서 접힘 변화를 사용하여 히스토그램을 구성합니다.
    9. KEGG 데이터베이스와 Pubchem에서 차등 대사 산물을 찾아 차등 대사 산물을 포함하는 대사 경로를 컴파일합니다. 경로 보강 분석 또는 토폴로지 분석을 수행합니다.

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결과

본 실험에서는 상기 방법에 따라 알팔파 뿌리 삼출물을 채취, 추출, 분석하였다(도 1). 대조군, 저농도 DEHP(1mg L-1) 및 고농도 DEHP(10mg L-1)의 세 가지 처리군을 설정했습니다.

대조군의 크로마토그래프에서 총 778개의 피크가 검출되었으며, 그 중 질량 스펙트럼에 따라 314개의 대사산물을 식별할 수 있었습니다. 그림 2에서 볼 수 있듯이 이러한 대사산물은 상대적 풍부도에 따라 탄수화물(28.6%), 산(15.58%), 지질(13.87%), 알코올(3.91%), 아민(0.92%), 기타(37.12%)의 6가지 유형으로 분류할 수 있습니다. 0.5% 미만을 차지하는 대사산물은 다른 물질로 분류되었습니다(그림 2A). 산은 지방산(56.09%), 아미노산(26.6...

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토론

이 프로토콜은 DEHP 스트레스 하에서 알팔파의 뿌리 삼출물을 수집하고 측정하는 방법과 대사체 데이터를 분석하는 방법에 대한 일반적인 지침을 제공합니다. 이 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계에 세심한 주의를 기울여야 합니다. 수경 재배 실험에서, 알팔파 묘목은 DEHP의 농도가 다른 영양 용액으로 채워진 유리 병에서 수경 재배 배양되었다. 유리병은 DEHP가 광분해되는 것을 방지하고 모든 배양 용액에서 DEHP 농도의 균일성을 보장하기 위해 배양 기간 동안 알루미늄 호일로 덮어 빛으로부터 보호해야 합니다25,26. DEHP 농도는 DEHP27,28로 오염 된 토양에서 일반적으로 발견되는 농도에 따라 1 mg L-1 및 1 mg L-1로 설정되었습니다. 뿌리 삼출물을 수집하는 동안 원심...

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공개 사항

저자는 이 논문에 보고된 작업에 영향을 미칠 수 있는 경쟁적인 재정적 이해관계나 개인적인 관계가 없다고 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 중국 국립 자연 과학 재단 (41877139), 중국 국립 자연 과학 재단 (41991335)의 주요 프로젝트, 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램 (2016YFD0800204), 장쑤성 자연 과학 재단 (No. BK20161616), "135"계획 및 중국 과학원의 프론티어 프로그램 (ISSASIP1615).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아도니톨시그마≥ 99%
알팔파 씨앗Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)
분석 저울SartoriusBSA124S-CW
BSTFAREGIS Technologieswith 1% TMCS, V/V
CentrifugeThermo Fisher ScientificHeraeus Fresco17
크로마토그래피 컬럼애질런트DB-5MS (30m × 250 μ m &시간; 0.25 &무; m)
디 (2- 에틸 헥실) 프탈레이트Dr. Ehrenstorfer
FAMEsDr. Ehrenstorfer
가스 크로마토 그래피 (GC)애질런트7890A
연삭 기기Shanghai Jingxin Technology Co., LtdJXFSTPRP-24
질량 분석기 (MS)LECOPEGASUS HT
메탄올CNW TechnologiesHPLC
Methoxyaminatio hydrochlorideTCIAR
미세 원심 분리기 튜브EppendorfEppendorf Quality1.5 mL
오븐Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LtdDHG-9023A
피리딘아다마스HPLC
R 소프트웨어통계 분석 소프트웨어(경로 강화, 토폴로지)
SIMCA16.0.2 통계 분석 소프트웨어 (OPLS-DA 등)
초저온 냉동고Thermo Fisher ScientificForma 900 시리즈
초음파심천 Fangao Microelectronics Co., LtdYM-080S
진공 건조기Taicang Huamei 생화학 기기 공장LNG-T98

참고문헌

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