여기에서 우리는 유전자 조작 마우스 모델 종양에서 파생된 세포의 두개내 주입에 의해 확립된 GBM에 대한 전임상 동소 마우스 모델을 설명합니다. 이 모델은 인간 GBM의 질병 특징을 표시합니다. 중개 연구를 위해 마우스 뇌종양은 생체 내 MRI 및 조직병리학에 의해 추적됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
인간 다형성 교모세포종(GBM)에 대한 유전자 조작 마우스(GEM) 모델은 뇌종양의 발달과 진행을 이해하는 데 중요합니다. 이종 이식 종양과는 달리, GEM에서 종양은 면역 적격 마우스의 천연 미세 환경에서 발생합니다. 그러나 전임상 치료 연구에서 GBM GEM을 사용하는 것은 긴 종양 잠복기, 신생물 빈도의 이질성 및 고급 등급 종양 발달 시기로 인해 어렵습니다. 두개내 동소 주사를 통해 유도된 마우스는 전임상 연구에서 더 다루기 쉽고 GEM 종양의 특징을 유지합니다. 우리는 Rb, Kras 및 p53 수차(TRP)가 있는 GEM 모델에서 파생된 동소 뇌종양 모델을 생성했으며, 이는 신생물 세포에 의한 괴사의 선형 초점과 인간 GBM과 유사한 조밀한 혈관화를 나타내는 GBM 종양을 발달시킵니다. GEM GBM 종양에서 유래한 세포를 야생형의 균주 일치 수용자 마우스에 두개내 주입하고 등급 IV 종양을 재현하므로 GEM 마우스에서 긴 종양 잠복기를 우회하고 전임상 연구를 위한 크고 재현 가능한 코호트를 생성할 수 있습니다. GBM에 대한 TRP GEM 모델의 고증식성, 침습성 및 혈관 특징은 동소 종양에서 요약되며 조직병리학 마커는 인간 GBM 하위 그룹을 반영합니다. 종양 성장은 일련의 MRI 스캔으로 모니터링됩니다. 면역 적격 모델에서 두개내 종양의 침습적 특성으로 인해 여기에 설명된 주사 절차를 주의 깊게 따르는 것이 두개외 종양 성장을 방지하는 데 필수적입니다.
서론
교모세포종(GBM; grade IV glioma)은 가장 흔하고 악성 뇌종양이며, 현재의 치료법은 효과가 없어 생존 중앙값이 15개월이다1. 뇌종양 성장 및 병인과 관련된 복잡한 신호 전달 경로를 나타내는 신뢰할 수 있고 정확한 전임상 모델은 GBM에 대한 새로운 치료 요법 평가의 진전을 촉진하는 데 필수적입니다. 인간 뇌종양 세포주를 면역저하 마우스에 피하로 이식한 마우스 모델은 뇌종양의 본래 면역 환경을 반영하지 않으며, 혈액뇌장벽을 통과하는 치료제의 능력을 평가하는 데 사용할 수 없다2. 이상적으로, 전임상 마우스 모델은 또한 주변 실질에 대한 높은 수준의 침습성을 포함하여 인간 GBM 조직병리학을 밀접하게 재현해야 한다3. 유전자 조작 마우스(GEM) 모델은 온전한 면역계의 맥락에서 종양을 발생시키지만, 복잡한 육종 계획이 필요한 경우가 많으며, 종양이 느리고 일관되지 않게 진행될 수 있다4. GEM 유래 동종이식 모델은 종양이 있는 마우스의 대규모 코호트가 더 짧은 기간에 필요한 전임상 치료 연구에 더 적합합니다.
이전 보고서에서 우리는 GEM 종양에서 직접 파생된....
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프로토콜
여기에 설명된 연구 프로토콜은 Frederick Animal Care and Use Committee의 NCI에 의해 승인되었습니다. NCI-Frederick은 AAALAC International의 인증을 받았으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 공중 보건 서비스 정책을 따릅니다. 동물 관리는 "실험실 동물의 관리 및 사용 가이드(National Research Council, 2011; National Academies Press, 워싱턴 D.C.).
1. 주사용 세포의 제조
참고: 이 모델에 사용된 마우스 뇌종양 원발성 세포(MBR)는 원래 El Meskini et al.5에 설명된 바와 같이 타목시펜 유도 TRP GEM 마우스에서 분리되었습니다. 세포 제조에 대한 자세한 내용은 이 참고문헌에서 찾을 수 있습니다.
- 생물 안전 캐비닛에서 멸균 기술을 사용하여 다음 단계를 수행하십시오.
- 원발성 뇌종양 세포가 기하급수적인 성장 단계에 도달할 때까지 시험관 내에서 배양합니다.
- 0.25% 트립신에서 세포를 수확하고 분리되면 성장 배지로 희석하여 트립신을....
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결과
뇌종양 세포를 주사한 마우스는 발작, 운동실조증 또는 체중 감소와 같은 종양 성장의 징후가 있는지 매일 모니터링해야 합니다. 뇌종양 성장은 또한 정기적으로 MRI 스캔으로 모니터링할 수 있습니다. 매주 MRI 스캔을 통해 뇌 내 증가하는 종양 부담과 종양 부피 측정을 시각화할 수 있습니다(그림 1C). 특히, TRP 종양은 공격적인 성장을 나타내며, 3D 종양 부피는 두개내 주사 후 2-3주 이내에 MRI로 측정할 수 있습니다(평균 부피 30-40mm3). 한 대표적인 연구에서, 뇌종양 보유 마우스 코호트는 대조군 대 방사선 요법을 위해 두 그룹으로 나뉩니다. MRI 종양 부피 측정은 방사선 치료 후 종양 성장 억제의 부족을 나타내었고 (도 2A), 치료 된 마우스의 생존율은 증가하지 않았다 (도 2B).
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토론
전임상 모델은 GBM에서 새로운 치료 표적과 새로운 치료 전략을 평가하는 데 필수적입니다. GBM에 대한 유전자 조작 마우스 모델은 자가성 부위에서 종양이 발생할 수 있다는 이점이 있지만, 종종 긴 잠복기와 예측할 수 없는 종양 성장을 보인다13. GEM 모델 종양은 4-5개월의 잠복기를 나타내며 이미징, 모집 및 치료를 위한 이상적인 시간 창은 개별 마우스마다 다릅니다. 동소 모델은 4-5주의 잘 확립되고 다루기 쉬운 성장 및 치료 일정을 가지며 종양은 이식 후 MRI로 안정적으로 감지됩니다. GEM 유래 동소 모델을 사용하면 주변 뇌 미세 환경의 이점을 유지하면서 종양 성장 개시를 시간적으로 제어할 수 있을 뿐만 아니라 각 마우스의 정확한 위치에 종양을 배치할 수 있습니다. TRP 동소 모델에서 활성화된 RTK, PTEN 및 RB 경로는 인간 GBM의 조직학적 특징을 요약하는 종양 모델을 생성합니다. 인간 GBM과 유사하게, 동소 TRP GBM 종양은 가성생물 세포로 둘러싸인 괴사성.......
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
탁월한 기술 지원을 해주신 Alan E. Kulaga 씨와 수술 기술을 개선해 주신 Michelle L. Gumprecht 씨에게 감사드립니다. 병리학 분석을 위해 Dr. Philip L. Martin과 MRI 스캔을 위한 Frederick National Laboratory Small Animal Imaging Program의 Ms. Lilia Ileva와 Dr. Joseph Kalen에게 감사드립니다.
이 프로젝트는 계약 번호 HHSN261201500003I에 따라 국립 보건원 국립 암 연구소 (National Cancer Institute, National Institutes of Health)의 연방 기금으로 전체 또는 부분적으로 자금을 지원받았습니다. 이 간행물의 내용이 반드시 보건복지부의 견해나 정책을 반영하는 것은 아니며, 상호, 상용 제품 또는 조직에 대한 언급이 미국 정부의 보증을 의미하지는 않습니다.
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재료
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| 5X PBS의 1% 메틸셀룰로오스, 오토클레이브 | Millipore Sigma | M7027 | |
| 1mL 투베르큘린 주사기, 슬립 팁 | BD | 309659 | |
| 6" 면 팁 애플리케이터 | Puritan | S-18991 | |
| 조정 가능한 무대 플랫폼 | David Kopf Instruments | 모델 901 | |
| 에어로졸 배리어 팁 | Fisher Scientific | 02-707-33 | |
| 알코올 준비 패드 멸균, 대형 - 2.5 x 3 인치 | PDI | C69900 | |
| B6D2 마우스 스트레인 (C57Bl/6J x DBA/2J) | Jackson Laboratory | Jax #10006 | |
| Bone Wax | Surgical Specialties | 901 | |
| Bupivacaine 0.25% | Henry Schein | 6023287 | |
| BuprenorphineSR | ZooPharm | n/a | |
| 투명 비닐 튜브 1/8ID X 3/16OD | UDP | T10004001 | |
| CVS 윤활제 눈 연고 | CVS 약국 | 247881 | |
| 일회용 메스, #10 블레이드 | 메스 Miltex | 16-63810 | |
| 산소 연결 및 마취 상자가 있는 가스 마취기 | Somni Scientific | n/a | 조사자는 시설 표준 장비를 사용할 수 있습니다 |
| . 가스 생쥐용 마취 플랫폼 | David Kopf Instruments | 모델 923-B | |
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| Reflex 9mm 상처 클립 제거제 | Fine Science Tools | 12033-00 | |
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| Semken 집게, 곡선형 | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| 온도 컨트롤러 | David Kopf Instruments | PH TCAT-2LV | |
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| UltraMicroPump 3(Micro2T 컨트롤러 포함 | 세계 정밀 기기 | 모델 UMP3T |
참고문헌
- Tamimi, A. F., Juweid, M. Epidemiology and Outcome of Glioblastoma. Glioblastoma. , (2017).
- Robertson, F. L., Marques-Torrejon, M. A., Morrison, G. M., Pollard, S. M. Experimental models and tools to tackle glioblastoma. Disease Models & Mechanisms. 12 (9), (2019).
- Wen, P. Y., Kesari, S.
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