방법 논문

항체 의존성 세포 독성 변형 화합물의 식별을 위한 High-content screening assay

DOI:

10.3791/64485

⸱

2023년 8월 18일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Chemistry, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Doctoral School of Molecular Medicine, University of Debrecen, 3National Academy of Scientist Education, University of Debrecen, 4ELKH-DE Cell Biology and Signaling Research Group

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 치료용 항-HER-2 항체가 있는 상태에서 자연 살해 세포 매개 유방암 세포 사멸을 조절하는 화합물을 식별하기 위한 자동화된 이미지 기반 고처리량 기술을 제시합니다.

초록

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항원 특이 항체 또는 면역 관문 억제제를 사용한 면역 요법은 유방암 치료에 혁명을 일으켰습니다. 표피 성장 인자 수용체 HER2를 발현하는 유방암 세포는 항-HER-2 항체 트라스투주맙에 의해 표적화될 수 있다. 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC)은 HER-2의 항종양 작용에 연루된 중요한 기전이다. 암세포에 결합된 트라스투주맙은 ADCC 이펙터 세포(예: 자연 살해(NK) 세포, 대식세포 및 과립구)의 Fc 수용체에 의해 인식되어 암세포 사멸을 유도하는 이러한 면역 세포의 세포독성 활성을 유발할 수 있습니다. 우리는 high-content screening을 통해 새로운 ADCC 조절제 화합물을 식별하기 위해 ADCC의 정량화를 위한 이미지 기반 분석을 개발하기 시작했습니다. 분석에서 JIMT-1 유방암 세포를 과발현하는 HER2는 트라스투주맙의 존재 하에 NK-92 세포와 공동 배양되고 표적 세포 사멸은 자동 현미경 및 정량적 이미지 분석에 의해 정량화됩니다. 표적 세포는 EGFP 형광에 따라 이펙터 세포와 구별됩니다. 우리는 ADCC 조절제 약물을 식별하기 위해 분석에서 화합물 라이브러리를 테스트할 수 있는 방법을 보여줍니다. 이를 위해 실험실 선반에서 무작위로 선택된 정밀 화학 물질을 사용하여 화합물 라이브러리 테스트 플레이트를 설정했습니다. NK 세포 이동 및 탈과립을 방해할 것으로 예상되는 3가지 미세소관 불안정화 화합물(콜히친, 빈크리스틴, 포도필로톡신)도 테스트 라이브러리에 포함되었습니다. 테스트 스크린은 세 가지 양성 대조 화합물을 모두 적중으로 식별하여 화학 라이브러리에서 ADCC 변형 약물을 식별하는 방법의 적합성을 입증했습니다. 이 분석을 통해 화합물 라이브러리 스크리닝을 수행하여 항암 면역 요법을 받는 환자의 치료를 위한 보조 치료제로 사용할 수 있는 ADCC 강화 화합물을 확인할 수 있습니다. 또한, 상기 방법은 또한 상이한 적응증에 대해 암 환자에 의해 복용되는 치료 약물의 임의의 바람직하지 않은 ADCC-억제 부작용을 확인하는데 사용될 수 있다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

항암 항체, 면역 체크포인트 억제제 또는 키메라 항원 수용체 발현 T(CAR-T) 세포를 사용한 면역요법은 암 치료에 대한 강력한 접근법을 나타낸다 1,2,3. 트라스투주맙은 HER-2 양성 초기 단계 또는 전이성 유방암뿐만 아니라 HER-2 양성 전이성 위암치료에 사용되는 인간화 단클론 항-HER-2(인간 표피 성장 인자 수용체 2) 항체입니다 4,5,6. 이는 주로 표피성장인자4의 증식 자극 효과를 억제함으로써 작용한다. 그러나 트라스투주맙은 암세포가 HER-2 자극에 대한 반응성을 상실하더라도 암세포 사멸을 효율적으로 유발하는 것으로 보고되었다7. 항체의 이러한 역설적 효과는 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 (ADCC) 때문입니다.7. ADCC는 ADCC8,9의 이펙터 세포로 통칭되는 자연 살해(NK) 세포, 과립구 및 대식세포에 의해 매개될 수 있습니다. 트라스투주맙과 같은 항체가 종양 세포에 결합하는 경우, 이들 이펙터 세포는 Fc 수용체를 사용하여 항체의 불변(Fc) 영역에 결합합니다. 항체는 종양 세포와 Fc 수용체 보유 이펙터 세포를 연결하여 세포독성 매개체의 방출을 유발합니다10. 자연 살해 세포는 퍼포린을 함유한 과립의 세포독성 화물을 방출하여 표적 세포막과 그랜자임(세포 사멸 신호 전달 경로 유발)에 기공을 생성하여 면역 시냅스로 들어가 암세포의 세포자멸사를 유도합니다(그림 1 참조).

figure-introduction-1
그림 1: ADCC의 이펙터 및 표적 세포 상호작용. 이펙터 NK 세포의 세포 표면 Fcγ 수용체는 종양 세포의 표면 상에서 발현되는 HER2 분자에 특이적인 항-HER2 트라스투주맙 항체의 Fc 영역을 인식한다. 따라서, 소위 면역 학적 시냅스가 두 세포 사이에 확립되어 이펙터 세포의 세포 독성 과립의 유도 된 엑소 사이토 시스를 유도한다. 방출된 퍼포린 및 그랜자임 분자는 결국 표적 세포의 세포자멸사를 초래합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

ADCC를 포함한 세포 독성을 정량화하기 위해 여러 분석법이 이전에 개발되었습니다. 황금 표준은 방사성 크롬 방출 방법으로, 표적 세포는 방사성 51Cr 동위 원소로 표지되고 ADCC는 용해 된 표적 세포11의 상청액에서 방사능을 측정하여 정량화됩니다. 방사성 약전 및 폐기물의 취급, 저장 및 폐기를 엄격하게 규제하기 때문에 명백한 문제로 인해 이 방법은 생명 과학자들 사이에서 점점 더 인기가 없게 되었습니다. 또한 처리량이 많은 응용 프로그램에도 적합하지 않습니다. 사멸된 표적 세포로부터 방출된 효소(예를 들어, 젖산-탈수소효소)의 활성을 측정하는 것은 51Cr분석에 대한 비방사성 대안을 제공할 수 있다(12). 그러나 이러한 분석은 표적 세포 사멸과 이펙터 세포 사멸을 구별하지 못합니다. ECIS(Electric Cell-substrate Impedance Sensing)는 ADCC13의 정량화에 적합한 것으로 입증되었지만 ECIS 장비는 대부분의 실험실에서 사용할 수 없으며 이 기술은 고처리량 애플리케이션/스크리닝과 호환되지 않습니다. 형광 표지된 세포는 많은 세포 생물학 분석에서 인기 있는 대안을 나타내며 유세포 분석 또는 플레이트 리더 기반 응용 분야에서 자주 사용됩니다14,15,16. 그러나 이러한 분석에는 종종 세척 단계가 포함되거나 고처리량 응용 분야(예: 유세포 분석 기반 기술)와 호환되지 않습니다. 이론적으로 ADCC 정량화에 적합해야 하는 일부 인기 있는 세포독성 분석은 ADCC 효율을 신뢰성 있게 결정하지 못한다13. 최근 형광 컨포칼 현미경의 보급으로 생명 과학의 다양한 영역에서 이미지 기반 고함량 분석이 점점 인기를 얻고 있습니다17. 한편으로, 세포 이미징 장비는 이제 다소 유비쿼터스적인 반면, 다른 한편으로는 획득 된 이미지에서 사실상 끝없는 형태 학적 매개 변수를 수집 할 수 있습니다. 따라서 우리는 high-content screening compatible ADCC assay를 개발하고 화합물 라이브러리 스크리닝에 대한 적합성을 입증하기 시작했습니다.

여기에서는 이미지 기반 ADCC 분석을 제시하고 이 분석을 HCS(High-Content Screening)에 사용하여 ADCC 조절 화합물을 식별하는 방법을 보여줍니다. 이 모델은 JIMT-1 유방암 표적 세포, CD16.176V.NK-92 이펙터 세포 및 인간화 단클론 항-HER2 항체 트라스투주맙을 기반으로 합니다. 이 방법을 통해 NK 세포의 종양 사멸 작용을 향상시킬 수 있는 약물을 식별하거나 ADCC를 방해하는 소분자를 식별하여 NK 세포 매개 ADCC의 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 우리는 ADCC와 관련하여 세포 매개 세포 독성을 정량화하는 것을 목표로 하는 생명 과학자들이 발견 과학 또는 약물 개발을 위해 이 분석을 사용하는 것이 도움이 될 수 있다고 제안합니다. 이 분석은 실험실에서 형광 이미징 및 정량적 이미지 분석에 접근할 수 있고 경험이 있는 경우 대안이 될 수 있습니다.

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프로토콜

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참고: 분석 워크플로의 주요 단계는 그림 2에 나와 있습니다.

figure-protocol-1
그림 2: ADCC 화면의 워크플로 96 웰 HCS 플레이트에 시딩된 JIMT-1-EGFP 표적 세포는 화합물 라이브러리의 약물로 처리된다. 차례로, 염색되지 않은 NK(이펙터) 세포 및 트라스투주맙을 첨가하고, 플레이트를 0 시점 및 배양 3시간 후에 이미지화한다. ADCC 평가는 생존 가능한(표면 부착성) 표적 세포의 수의 변화에 기초한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. HCS 플레이트의 코팅

  1. 96웰 고함량 스크리닝(HSC) 플레이트를 50μL/웰 JIMT-1 배지(20% 소 태아 혈청(FBS), 0.3U/mL 인슐린(100IU/mL, Humulin R 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F-12 배지)로 코팅합니다.
  2. 플레이트를 1시간 동안 CO2 인큐베이터에 넣습니다.
    알림: 코팅은 JIMT-1 셀을 플레이트의 유리 표면에 부착하는 데 중요합니다.

2. JIMT-1 강화 녹색 형광 단백질(EGFP) 세포의 파종

참고: EGFP 발현 JIMT-1 세포는 이전 연구18에서 생성되었고, 세포는 JIMT-1 배지의 T25 조직 배양 플라스크에서 배양되었습니다(단계 1.1의 조성 참조).

  1. 세포를 2mL의 멸균 PBS로 세척합니다.
  2. 1mL의 트립신-EDTA를 플라스크에 넣고 플라스크를 다시CO2 인큐베이터에 10분 동안 넣습니다.
  3. 배양 후 플라스크를 두드려 JIMT-1 세포가 분리되었는지 확인합니다.
  4. 2mL의 JIMT-1 배지로 분해를 중지하고 세포 현탁액을 15mL 튜브에 수집합니다.
  5. Bürker 챔버에서 0.4% 트립판 블루(염료 80μL + 세포 현탁액 20μL)로 세포를 계수하고 세포 수를 133, 000 cells/mL로 조정합니다.
  6. 96 웰 플레이트로부터 코팅 매질을 흡인한다(단계 1.2).
  7. 75 μL의 세포 현탁액을 HCS 플레이트의 각 웰에 피펫팅한다 ( 물질의 표 참조).
  8. 세포가CO2 인큐베이터에서 37°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션하는 동안 부착되도록 한다.

3. 화합물 라이브러리를 이용한 JIMT-1 EGFP 세포의 전처리

  1. JIMT-1 세포에서 배지를 흡인하고 50μL/웰의 신선한 JIMT-1 배지를 웰에 추가합니다. 플레이트를 고처리량 스크리닝 실험실로 옮깁니다.
    알림: 액체 처리 로봇을 사용하면 화합물 라이브러리를 보다 효율적이고 재현 가능하게 추가할 수 있습니다.
  2. 25nL 부피로 보정된 핀 도구를 사용하여 화합물 라이브러리 플레이트에서 분석 플레이트로 테스트 화합물을 옮깁니다. 이 작업을 네 번 수행합니다. 4 라운드의 전달은 100 nL (및 20 μM 최종 농도)의 최종 부피를 제공합니다.
  3. 각 단계 사이에 핀 도구를 먼저 50% DMSO로 세척한 다음 70% 에탄올로 세척합니다.
  4. 플레이트를 37°C의CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션한다.

4. 이펙터 세포를 첨가하여 ADCC 분석 시작

참고: CD16.176V.NK92 세포(이하 NK92 세포라고 함)는 20% FBS, 1% MEM-NEAA, 1% Na-피루브산, 1% 글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 100IU/mL IL-2가 보충된 α-MEM에서 배양되었습니다.

  1. NK92 세포를 트리판 블루(염료 80μL + 세포 현탁액 20μL)로 계산합니다. 세포 수를 400,000 cells/mL로 조정합니다.
  2. 세포 현탁액 4mL를 실온에서 3분 동안 150 x g 로 원심분리합니다.
  3. JIMT-1 배지에 20μg/mL 항-HER2 항체(트라스투주맙)를 추가하여 ADCC 배지를 준비합니다.
  4. NK 세포 펠릿을 5mL ADCC 배지에 재현탁합니다.
  5. 50 μL의 ADCC 배지에 20,000 NK 세포를 표적으로 JIMT-1 세포에 피펫팅한다. 최종 부피는 100μL이고 최종 트라스투주맙 농도는 10μg/mL입니다.
  6. 분석 플레이트를 37°C로 설정된 내장 인큐베이터가 있는 고함량 분석 장비에 넣습니다.

5. 이미징

참고: 플레이트는 두 가지 시점에서 이미지화되어야 하는데, 첫째는 이펙터 세포를 표적 세포에 추가한 직후이고 둘째는 NK 세포를 추가한 후 3시간에 이미지화해야 합니다. 이미징을 위해 high-content 분석기와 그 소프트웨어 또는 적절한 대안을 사용할 수 있습니다( 재료 표 참조).

  1. 플레이트 목록에서 플레이트 유형(96웰 셀 캐리어 울트라)을 선택합니다.
  2. 플레이트에서 분석을 수행하는 경우 Two peak autofocus 를 선택합니다.
  3. 비공초점 모드에서 10x 대물렌즈를 사용합니다.
  4. 신호 대 잡음비를 두 배로 늘리려면 비닝 2 를 선택합니다.
  5. 650-760nm에서 명시야 이미지를 촬영하고 488nm(여기) 및 500-550nm(방출) 파장에서 EGFP 형질도입된 JIMT-1 세포의 형광 이미지를 촬영합니다.
  6. 이미징을 위한 필드 수와 시점 수를 선택합니다.

6. 이미지 분석

참고: ADCC 효율을 분석하기 위해 생존 가능한 JIMT-1 세포를 계수합니다. ADCC에 의해 사멸된 표적 세포는 표면에서 분리되어 현미경의 초점면에서 멀어집니다. 따라서, ADCC 반응의 시작과 끝에서 생존 가능한 세포의 수의 차이는 ADCC에 의해 제거된 표적 세포에 상응한다. 평가 시퀀스를 구축하는 방법을 보여주기 위해 제어 ADCC 웰이 비디오에 나와 있습니다.

  1. 셀 찾기 모듈을 사용하여 이미지에서 셀 에 해당하는 영역을 감지합니다.
    참고: 각 셀은 이미지에서 주변보다 형광 강도가 더 높은 영역으로 감지됩니다.
  2. 직경이 최소 80μm인 내장 M 알고리즘을 사용하여 셀을 선택합니다.
  3. 큰 오브젝트를 작은 오브젝트로 구획하는 분할 민감도를 0.5로 설정합니다.
  4. 공통 임계값(픽셀 강도의 가장 낮은 수준)을 0으로 설정합니다.
  5. EGFP 형광 강도가 높은 배경 영역의 검출을 두 단계로 제외합니다.
    1. 먼저 강도 속성 계산 기능을 사용하여 이전에 선택한 셀 영역의 EGFP 형광 강도를 확인합니다.
    2. Select population 옵션을 사용하여 최소 및 최대 강도 임계값을 설정합니다.

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결과

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분석이 실생활에서 어떻게 작동하는지 보여주기 위해 실험실 선반에서 무작위로 선택된 16개 화합물의 테스트 라이브러리를 만들었습니다(그림 3). 또한, DMSO도 음성 대조군으로, 3개의 미세소관 중합 억제제 화합물(콜히친, 빈크리스틴 및 포도필로톡신)을 양성 대조군으로 포함시켰다. 후자는 암세포로의 NK 세포 이동 및 NK 세포 탈과립을 방해하여 ADCC를 억제할 것으로 예상되었다. 모든 테스트 화합물 및 DMSO를 테스트 라이브러리 플레이트에 4배로 배치하고, DMSO를 플레이트의 첫 번째 및 마지막 컬럼에도 첨가하였다(그림 3).

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토론

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ADCC 반응은 비교적 오래 전에 기술되어왔다. 이 과정의 주요 분자 사건 또한 기술되었다19. ADCC를 측정하는 방법은 황금 표준 방사성 크롬 방출 분석, 세포질 효소 방출 분석에서 여러 형광 기반 유세포 분석 또는 마이크로플레이트 분석에 이르기까지 다양하다20. 그러나 이러한 분석의 일반적인 한계는 고처리량 응용 분야에 적합하지 않다는 것입니다. 이전에 본 발명자들은 ADCC 변형 약물에 대한 화합물 라이브러리를 스크리닝하는 데 적합한 이미지 기반 HCS 분석법을 개발했다18. 그러나 이전에 개발된 분석법은 표적 세포를 칼세인-아세톡시메틸에스터로 사전 염색해야 하고 NK 세포와 트라스투주맙을 첨가하기 전에 과잉 염료를 제거해야 했기 때문에 세척 단계가 필요하다는 큰 단점이 있었습니다. 현재의 방법은 EGFP-형질도입된 JIMT-1 세포의 사용이 염색 및 세척 단계 없이 이펙터와 표...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없다고 보고합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LV는 국가 연구, 개발 및 혁신 사무소 보조금 GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE 및 OTKA K132193, K147482로부터 자금을 받았습니다. CD16.176V.NK-92 세포는 Brink Biologics, lnc. San Diego, CA)는 전 세계적으로 특허로 보호되며 Nantkwest, lnc의 라이선스를 받았습니다. 저자는 NK-92 세포주 사용에 대한 도움과 기술적 조언을 해준 György Vereb와 Árpád Szöőr에게 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
화합물 라이브러리의5-fluorouracilApplichemA7686
96-well Cell Carrier Ultra platePerkinElmerLLC 6055302
BetulinSigmaB9757in compound library
CD16.176V.NK92 cellsNankwest Inc. 
화합물라이브러리
CisplatinSanta Cruz 생명 공학sc-200896화합물 라이브러리
ColchicineSigmaC9754라이브러리
Concanavalin-ACalbiochem234567화합물 라이브러리
DexamethasoneSigmaD4902 복합 라이브러리
DMEM/F-12 배지SigmaD8437JIMT-1 EGFP 배지
DMSOSigmaD2650화합물 라이브러리
EtoposideSigmaE1383E1383
Fetal bovine serum (FBS)BioseraFB-1090/500JIMT-1 EGFP 및 NK 배지
FisetinSigmaF4043화합물 라이브러리
Freedom EVO 액체 핸들링 로봇TECAN
GallotanninFluka Chemical Corp.16201화합물 라이브러리
GlutamineGibco35,050– 061NK 미디엄
하모니 소프트웨어 PerkinElmer
인간화 항 HER2 단클론 항체 (Herzuma)EGIS Pharmaceuticals, Budapest 헝가리N / A
Humulin R (인슐린)Eli LillyHI0219JIMT-1 EGFP 매체
IL-2Novartis Hung á 리아 Kft.PHC0026NK 매체
IsatinSigma114618화합물 라이브러리
MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA)Gibco11,140– 050NK 매체
Na-pyruvateLonzaBE13-115ENK 매체
NaringeninSigmaN5893화합물 라이브러리
NQDI-1SigmaSML0185화합물 라이브러리
Opera Phoenix High-Content Analysis 장비PerkinElmer
Penicillin– 스트렙토마이신BioseraLM-A4118JIMT-1 EGFP 및 NK 배지
펜톡시필린시그마P1784라이브러리
산염 완충 식염수(PBS)LonzaBE17-517Q세포를 세척하기 위해
라이브러리의포도필로톡신시그마P4405
라이브러리
의 케르세틴 시그마 Q4951화합물 라이브러리의 타닌산SigmaT8406
TemozolomideSigmaT2577화합물 라이브러리
Trypan blue 0.4% 용액SigmaT8154세포 계수용
Vincristine sulfateSigmaV0400000 in compound library
α-MEMSigmaM8042NK medium
화합물 , , , , , 화합물 인화합물 화합물 in

참고문헌

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NKHER2ADCC

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