이 프로토콜은 치료용 항-HER-2 항체가 있는 상태에서 자연 살해 세포 매개 유방암 세포 사멸을 조절하는 화합물을 식별하기 위한 자동화된 이미지 기반 고처리량 기술을 제시합니다.
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방법 논문
항체 의존성 세포 독성 변형 화합물의 식별을 위한 High-content screening assay
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
항원 특이 항체 또는 면역 관문 억제제를 사용한 면역 요법은 유방암 치료에 혁명을 일으켰습니다. 표피 성장 인자 수용체 HER2를 발현하는 유방암 세포는 항-HER-2 항체 트라스투주맙에 의해 표적화될 수 있다. 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC)은 HER-2의 항종양 작용에 연루된 중요한 기전이다. 암세포에 결합된 트라스투주맙은 ADCC 이펙터 세포(예: 자연 살해(NK) 세포, 대식세포 및 과립구)의 Fc 수용체에 의해 인식되어 암세포 사멸을 유도하는 이러한 면역 세포의 세포독성 활성을 유발할 수 있습니다. 우리는 high-content screening을 통해 새로운 ADCC 조절제 화합물을 식별하기 위해 ADCC의 정량화를 위한 이미지 기반 분석을 개발하기 시작했습니다. 분석에서 JIMT-1 유방암 세포를 과발현하는 HER2는 트라스투주맙의 존재 하에 NK-92 세포와 공동 배양되고 표적 세포 사멸은 자동 현미경 및 정량적 이미지 분석에 의해 정량화됩니다. 표적 세포는 EGFP 형광에 따라 이펙터 세포와 구별됩니다. 우리는 ADCC 조절제 약물을 식별하기 위해 분석에서 화합물 라이브러리를 테스트할 수 있는 방법을 보여줍니다. 이를 위해 실험실 선반에서 무작위로 선택된 정밀 화학 물질을 사용하여 화합물 라이브러리 테스트 플레이트를 설정했습니다. NK 세포 이동 및 탈과립을 방해할 것으로 예상되는 3가지 미세소관 불안정화 화합물(콜히친, 빈크리스틴, 포도필로톡신)도 테스트 라이브러리에 포함되었습니다. 테스트 스크린은 세 가지 양성 대조 화합물을 모두 적중으로 식별하여 화학 라이브러리에서 ADCC 변형 약물을 식별하는 방법의 적합성을 입증했습니다. 이 분석을 통해 화합물 라이브러리 스크리닝을 수행하여 항암 면역 요법을 받는 환자의 치료를 위한 보조 치료제로 사용할 수 있는 ADCC 강화 화합물을 확인할 수 있습니다. 또한, 상기 방법은 또한 상이한 적응증에 대해 암 환자에 의해 복용되는 치료 약물의 임의의 바람직하지 않은 ADCC-억제 부작용을 확인하는데 사용될 수 있다.
서론
항암 항체, 면역 체크포인트 억제제 또는 키메라 항원 수용체 발현 T(CAR-T) 세포를 사용한 면역요법은 암 치료에 대한 강력한 접근법을 나타낸다 1,2,3. 트라스투주맙은 HER-2 양성 초기 단계 또는 전이성 유방암뿐만 아니라 HER-2 양성 전이성 위암치료에 사용되는 인간화 단클론 항-HER-2(인간 표피 성장 인자 수용체 2) 항체입니다 4,5,6. 이는 주로 표피성장인자4의 증식 자극 효과를 억제함으로써 작용한다. 그러나 트라스투주맙은 암세포가 HER-2 자극에 대한 반응성을 상실하더라도 암세포 사멸을 효율적으로 유발하는 것으로 보고되었다7. 항체의 이러한 역설적 효과는 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 (ADCC) 때문입니다.7. ADCC는 ADCC8,9의 이펙터 세포로 통칭되는 ....
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프로토콜
참고: 분석 워크플로의 주요 단계는 그림 2에 나와 있습니다.
그림 2: ADCC 화면의 워크플로 96 웰 HCS 플레이트에 시딩된 JIMT-1-EGFP 표적 세포는 화합물 라이브러리의 약물로 처리된다. 차례로, 염색되지 않은 NK(이펙터) 세포 및 트라스투주맙을 첨가하고, 플레이트를 0 시점 및 배양 3시간 후에 이미지화한다. ADCC 평가는 생존 가능한(표면 부착성) 표적 세포의 수의 변화에 기초한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
1. HCS 플레이트의 코팅
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결과
분석이 실생활에서 어떻게 작동하는지 보여주기 위해 실험실 선반에서 무작위로 선택된 16개 화합물의 테스트 라이브러리를 만들었습니다(그림 3). 또한, DMSO도 음성 대조군으로, 3개의 미세소관 중합 억제제 화합물(콜히친, 빈크리스틴 및 포도필로톡신)을 양성 대조군으로 포함시켰다. 후자는 암세포로의 NK 세포 이동 및 NK 세포 탈과립을 방해하여 ADCC를 억제할 것으로 예상되었다. 모든 테스트 화합물 및 DMSO를 테스트 라이브러리 플레이트에 4배로 배치하고, DMSO를 플레이트의 첫 번째 및 마지막 컬럼에도 첨가하였다(그림 3).
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토론
ADCC 반응은 비교적 오래 전에 기술되어왔다. 이 과정의 주요 분자 사건 또한 기술되었다19. ADCC를 측정하는 방법은 황금 표준 방사성 크롬 방출 분석, 세포질 효소 방출 분석에서 여러 형광 기반 유세포 분석 또는 마이크로플레이트 분석에 이르기까지 다양하다20. 그러나 이러한 분석의 일반적인 한계는 고처리량 응용 분야에 적합하지 않다는 것입니다. 이전에 본 발명자들은 ADCC 변형 약물에 대한 화합물 라이브러리를 스크리닝하는 데 적합한 이미지 기반 HCS 분석법을 개발했다18. 그러나 이전에 개발된 분석법은 표적 세포를 칼세인-아세톡시메틸에스터로 사전 염색해야 하고 NK 세포와 트라스투주맙을 첨가하기 전에 과잉 염료를 제거해야 했기 때문에 세척 단계가 필요하다는 큰 단점이 있었습니다. 현재의 방법은 EGFP-형질도입된 JIMT-1 세포의 사용이 염색 및 세척 단계 없이 이펙터와 표.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없다고 보고합니다.
감사의 글
LV는 국가 연구, 개발 및 혁신 사무소 보조금 GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE 및 OTKA K132193, K147482로부터 자금을 받았습니다. CD16.176V.NK-92 세포는 Brink Biologics, lnc. San Diego, CA)는 전 세계적으로 특허로 보호되며 Nantkwest, lnc의 라이선스를 받았습니다. 저자는 NK-92 세포주 사용에 대한 도움과 기술적 조언을 해준 György Vereb와 Árpád Szöőr에게 감사를 표합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 화합물 라이브러리의 | 5-fluorouracil | Applichem | A7686 |
| 96-well Cell Carrier Ultra plate | PerkinElmer | LLC 6055302 | |
| Betulin | Sigma | B9757 | in compound library |
| CD16.176V.NK92 cells | Nankwest Inc. | ||
| 화합물 | 라이브러리 | ||
| Cisplatin | Santa Cruz 생명 공학 | sc-200896 | 화합물 라이브러리 |
| Colchicine | Sigma | C9754 | 라이브러리 |
| Concanavalin-A | Calbiochem | 234567 | 화합물 라이브러리 |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | 복합 라이브러리 |
| DMEM/F-12 배지 | Sigma | D8437 | JIMT-1 EGFP 배지 |
| DMSO | Sigma | D2650 | 화합물 라이브러리 |
| Etoposide | Sigma | E1383 | E1383 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1 EGFP 및 NK 배지 |
| Fisetin | Sigma | F4043 | 화합물 라이브러리 |
| Freedom EVO 액체 핸들링 로봇 | TECAN | ||
| Gallotannin | Fluka Chemical Corp. | 16201 | 화합물 라이브러리 |
| Glutamine | Gibco | 35,050– 061 | NK 미디엄 |
| 하모니 소프트웨어 | PerkinElmer | ||
| 인간화 항 HER2 단클론 항체 (Herzuma) | EGIS Pharmaceuticals, Budapest 헝가리 | N / A | |
| Humulin R (인슐린) | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1 EGFP 매체 |
| IL-2 | Novartis Hung á 리아 Kft. | PHC0026 | NK 매체 |
| Isatin | Sigma | 114618 | 화합물 라이브러리 |
| MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11,140– 050 | NK 매체 |
| Na-pyruvate | Lonza | BE13-115E | NK 매체 |
| Naringenin | Sigma | N5893 | 화합물 라이브러리 |
| NQDI-1 | Sigma | SML0185 | 화합물 라이브러리 |
| Opera Phoenix High-Content Analysis 장비 | PerkinElmer | ||
| Penicillin– 스트렙토마이신 | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1 EGFP 및 NK 배지 |
| 펜톡시필린 | 시그마 | P1784 | 라이브러리 |
| 산염 완충 식염수(PBS) | Lonza | BE17-517Q | 세포를 세척하기 위해 |
| 라이브러리의 | 포도필로톡신 | 시그마 | P4405 |
| 라이브러리 | |||
| 의 케르세틴 시그마 Q4951화합물 라이브러리의 타닌산 | Sigma | T8406 | |
| Temozolomide | Sigma | T2577 | 화합물 라이브러리 |
| Trypan blue 0.4% 용액 | Sigma | T8154 | 세포 계수용 |
| Vincristine sulfate | Sigma | V0400000 in compound library | |
| α-MEM | Sigma | M8042 | NK medium |
참고문헌
- Gupta, S. L., Basu, S., Soni, V., Jaiswal, R. K. Immunotherapy: an alternative promising therapeutic approach against cancers. Molecular Biology Reports. 49 (10), 9903-9913 (2022).
- Moretti, A., et al. The past, present, and future of non-viral CAR ....
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