우리는 Hoxb5 리포터 시스템을 사용하여 장기 조혈 줄기 세포(LT-HSC) 및 단기 HSC(ST-HSC)의 분리를 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
자가 재생 능력과 다중 계통 분화 잠재력은 일반적으로 조혈 줄기 세포(HSC)의 정의 특성으로 간주됩니다. 그러나 많은 연구에서 HSC 구획에 기능적 이질성이 존재한다고 제안했습니다. 최근의 단일 세포 분석에서는 HSC 구획 내에서 서로 다른 세포 운명을 가진 HSC 클론이 보고되었으며, 이를 편향된 HSC 클론이라고 합니다. 이질적이거나 재현성이 낮은 결과의 기본 메커니즘은 거의 이해되지 않았으며, 특히 정제된 HSC 분획을 기존 면역염색에 의해 이식할 때 자가 재생 길이와 관련하여 거의 이해되지 않았습니다. 따라서 장기 HSC(LT-HSC) 및 단기 HSC(ST-HSC)에 대한 재현 가능한 격리 방법을 확립하는 것이 이 문제를 극복하는 데 중요합니다. 편향되지 않은 다단계 스크리닝을 사용하여 마우스 조혈 시스템에서 LT-HSC의 배타적 마커일 수 있는 전사 인자인 Hoxb5를 확인했습니다. 이 발견을 바탕으로 Hoxb5 리포터 마우스 라인을 구축하고 LT-HSC 및 ST-HSC를 성공적으로 분리했습니다. 여기에서는 Hoxb5 리포터 시스템을 사용하여 LT-HSC 및 ST-HSC를 분리하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 분리 방법은 연구자들이 자가 재생 메커니즘과 HSC 구획의 이러한 이질성에 대한 생물학적 기초를 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다.
서론
조혈모세포(HSC)는 자가재생 능력과 분화능을 지니고 있으며, 조혈 계층의 정점에 위치한다 1,2. 1988년 Weissman과 동료들은 유세포 분석을 사용하여 마우스 HSC의 분리를 달성할 수 있음을 처음으로 입증했습니다3. 그 후, 세포 표면 마커의 조합에 의해 정의된 분획인 Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−는 마우스 4,5,6,7,8에서 모든 HSC를 포함하는 것으로 보고되었습니다.
면역표현형으로 정의된 (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/l....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
기술된 모든 동물 실험은 RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research의 승인을 받았습니다.
1. 수용자 마우스의 전처리
- 8-10주령의 수컷 C57BL/6 동종 마우스를 수용 마우스로 준비합니다. 수용 마우스의 수는 실험 프로토콜에 따라 다릅니다. 우리는 일반적으로 각 조건에 대해 10-20마리의 마우스를 준비합니다.
- 생쥐에게 enrofloxacin (170 mg / L)이 보충 된 멸균 된 물을 먹이십시오. 방사선 조사를 받은 수혜자 마우스는 감염에 매우 취약하므로 케이지를 가능한 한 깨끗하게 유지하십시오.
참고: 항생제 보충은 방사선 조사 24시간 전에 시작하여 감염을 피하기 위해 이식 후 3주 동안 계속됩니다.
- 생쥐에게 enrofloxacin (170 mg / L)이 보충 된 멸균 된 물을 먹이십시오. 방사선 조사를 받은 수혜자 마우스는 감염에 매우 취약하므로 케이지를 가능한 한 깨끗하게 유지하십시오.
- 전신 조사
- 전신 방사선 조사는 수혜자 골수 세포를 파괴하여 기증자 세포의 생착을 보장합니다. 수용자 마우스를 방사선 조사 케이지로 옮깁니다. 이식 전 12-16 시간에 8.7 Gy의 단일 용량으로 수용자 마우스를 치명적으로 조사하십시오.
알림: 방사선량과 시간은 장비에 따라 다를 수 있습니다. 치사량은 연구자의 방사선 조사기와 마우스 균주로 확인해야 합니다.
<....
- 전신 방사선 조사는 수혜자 골수 세포를 파괴하여 기증자 세포의 생착을 보장합니다. 수용자 마우스를 방사선 조사 케이지로 옮깁니다. 이식 전 12-16 시간에 8.7 Gy의 단일 용량으로 수용자 마우스를 치명적으로 조사하십시오.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
이전에는 경쟁적 이식 분석을 사용하여 자가 재생 능력을 측정했는데, 이 분석에서 기증자 HSC는 수혜자 말초 혈액에서 다중 계통 기증자 세포가 관찰되는 경우에만 자가 재생 능력을 유지하는 것으로 생각되었다17. 또한, 몇몇 보고서에서는 LT-HSC를 두 번째 골수 이식 후 몇 개월 후에 말초 혈액 세포를 계속 생산하는 세포로 정의하고 있다10,18. 따라서, 이들의 자가 재생 능력을 비교하기 위해, Hoxb5리포터 마우스로부터 분리된 10개의 Hoxb5 pos 또는 Hoxb5 neg pHSC를 2 x 105개의 전체 골수 세포로 치사적으로 조사된 1차 수용자 마우스에 이식하였다. 이어서, 1차 이식 16주 후, 1차 수용자 마우스로부터 분리된 1 x 107개의 골수 세포를 치사 조사된 2차.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
전통적으로, 세포 표면 마커로 정의된 HSC는 자가 재생 능력 및 다능성과 같은 HSC의 기능을 연구하기 위해 준비되었다 19,20,21. 그러나 면역 표현형으로 정의된 (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/lo Flk2−) HSC 분획에는 LT-HSC 및 ST-HSC의 두 가지 개별 HSC 집단이 포함됩니다 9,10. 따라서 선의의 HSC, LT-HSC의 구체적인 분석은 아직 이루어지지 않았습니다. 따라서 Hoxb5 리포터 시스템을 사용하는 LT-HSC의 분리 방법은 자가 재생 능력의 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 이 연구와 관련된 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
동물 관리와 RIKEN BDR의 수혜 마우스를 제공한 키요나리 히로시, 고베 대학의 실험실 관리를 위해 오가 히토미, 나가사카 카요코, 미야하시 마사키에게 감사드립니다. 저자는 또한 이 작업에 대한 지속적인 지원에 크게 감사드립니다. 미야니시 마사노리는 일본 과학 진흥 협회 (JSPS) KAKENHI 보조금 번호 JP17K07407 및 JP20H03268, 모치다 의료 및 제약 연구 재단, 일본 생명 과학 재단, 다케다 과학 재단, 아스텔라스 대사 장애 연구 재단 및 AMED-PRIME, AMED의 지원을 받았습니다. 허가 번호 JP18gm6110020. Taro Sakamaki는 JSPS KAKENHI 보조금 번호 JP21K20669 및 JP22K16334의 지원을 받았으며 JSPS Core-to-Core 프로그램 및 RIKEN Junior Research Associate Program. 니시 카츠유키는 JSPS 보조금 번호 KAKENHI JP18J13408의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 8 튜브의 0.2 mL 스트립, 돔 캡 | SSIbio | 3230-00 | |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Iinvtrogen | AM9260G | |
| 100 µ m 세포 여과기 | Falcon | 352360 | |
| 30G 인슐린 주사기 | BD | 326668 | |
| 40 µ m Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 mL 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관, 셀 스트레이너 스냅 캡 포함 | FALCON | 352235 | |
| 7-AAD 생존도 염색 용액 | BioLegend | 420404 | |
| 96 웰 U-Bottom | FALCON | 351177 | |
| Anti-APC-MicroBeads | Milteny biotec | 130-090-855 | |
| 트랩 포함 흡인기 플라스크 | Biosan | FTA-1 | |
| B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2) | BioLegend | 103232 | |
| B220-Biotin (RA3-6B2) | BioLegend | 103204 | |
| B220-BV786 (RA3-6B2) | BD Biosciences | 563894 | |
| B6. CD45.1 선천성 마우스 | Sankyo Labo 서비스 | N/A | |
| Baytril 10% | BAYER | 341106546 | |
| BD FACS Aria II 특별 주문 시스템 | BD | N / A | |
| 브릴리언트 염색 완충액 | BD | 566349 | |
| CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70) | BioLegend | 101222 | |
| CD11b-Biotin (M1/70) | BioLegend | 101204 | |
| CD11b-BUV395 (M1/70) | BD Biosciences | 563553 | |
| CD11b-BV711 (M1/70) | BD Biosciences | 563168 | |
| CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34) | Invitrogen | 56-1271-82 | |
| CD150-BV421 (TC15-12F12.2) | BioLegend | 115943 | |
| CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93) | Invitrogen | 56-0161-82 | |
| CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34) | BD Biosciences | 560230 | |
| CD34-FITC (RAM34) | Invitrogen | 11034185 | |
| CD3-Alexa Fluor 700 (17A2) | BioLegend | 100216 | |
| CD3 ε -Biotin (145-2C11) | BioLegend | 100304 | |
| CD3 ε -BV421 (145-2C11) | BioLegend | 100341 | |
| CD45.1 / CD45.2 / CD45.2 congenic 마우스 | N | / A | 우리 실험실에서 자란 |
| 해당 없음 CD45.1-FITC (A20) | BD Biosciences | 553775 | |
| CD45.2-PE (104) | BD Biosciences | 560695 | |
| CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5) | BioLegend | 100430 | |
| CD4-Biotin (GK1.5) | BioLegend | 100404 | |
| CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7) | BioLegend | 100730 | |
| CD8a-Biotin (53-6.7) | BioLegend | 100704 | |
| 원심분리기 튜브 15ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-15 | |
| 원심분리기 튜브 50ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-50 | |
| c-Kit-APC-eFluor780 (2B8) | Invitrogen | 47117182 | |
| D-PBS (-) Ca 및 Mg 없음, 액체 | Nacalai | 14249-24 | |
| 태아 소 혈청 | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10) | eBioscience | 46135182 | |
| FlowJo 버전 10 | BD Biosciences | ||
| Gmmacell 40 | Exactor 최고의 theratronics | N/A | |
| Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5) | BioLegend | 108422 | |
| Gr-1-Biotin (RB6-8C5) | BioLegend | 108404 | |
| Hoxb5-tri-mCherry 마우스 (C57BL/6J 배경) | N/A | /A | 우리 실험실에서 자란 |
| 쥐 혈청에서 IgG, 기술 등급, >=80% (SDS-PAGE), 완충 수용액 | Sigma-Aldrich | I8015-100MG | |
| 이소플루란 | 화이자 | 4987-114-13340-3 | |
| Kimwipes S200 | 일본 종이 크레시아 | 6-6689-01 | |
| LS 컬럼 | Milteny biotec | 130-042-401 | |
| 용해 완충액 | BD | 555899 | |
| MACS 조직 | Milteny biotec | 130-042-303 | |
| 마이크로 플레이트(접착 세포용) 6Well | IWAKI | 3810-006 | |
| MidiMACS 세퍼레이터 | Milteny biotec | 130-042-302 | |
| 마우스 파이 케이지 | 나츠메 제작소 | KN-331 | |
| 다목적 냉장 원심분리기 | TOMY | EX-125 | |
| NARCOBIT-E (II) | 나츠메 제작 | KN-1071-I | |
| NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136) | BioLegend | 108728 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 혼합 용액 | 나칼라이 | 26253-84 | |
| 도자기 모르타르 φ 120mm Pestle | Asone | 6-549-03 | |
| 단백질 LoBind 튜브 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| Sca-I-BUV395 (D7) | BD Biosciences | 563990 | |
| 스테인리스 스틸 메스 블레이드 | FastGene | FG-B2010 | |
| Streptavidin-BUV737 | BD Biosciences | 612775 | |
| SYTOX-red | Invitrogen | S34859 | |
| Tailveiner Restrainer for Mice standard | Braintree | TV-150 STD | |
| TCRb-BV421 (H57-597) | BioLegend | 109230 | |
| Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119) | BioLegend | 116220 | |
| Ter-119-Biotin (TER-119) | BioLegend | 116204 | |
| Terumo 5ml 동심원 Luer-Slip 주사기 | TERUMO | SS-05LZ | |
| 테루모 피하 주사 바늘 23G x 1 | TERUMO | NN-2325-R |
참고문헌
- Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).
- Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
