사카로마이세스 세레비시아에 5-에티닐-2'-데옥시우리딘 혼입을 사용한 S상 지속 시간 측정

요약

우리는 생체 내에 통합되고 현미경 및 유세포 분석에 의한 Click 화학을 사용하여 검출되는 티미딘 유사체인 EdU를 사용하여 S. cerevisiae에서 S상 지속 시간을 정확하게 결정하기 위한 두 가지 보완 프로토콜을 설명합니다. 이를 통해 DNA 복제 기간을 쉽게 특성화하고 돌연변이의 복제 결함을 간과할 수 있습니다.

초록

진핵생물 DNA 복제는 염색체 분리 전에 세포의 유전적 청사진이 올바르게 복제되도록 하는 고도로 조절된 과정입니다. DNA 합성 결함이 염색체 재배열의 기초가 됨에 따라 DNA 복제 모니터링은 게놈 불안정성의 기초를 이해하는 데 필수적이 되었습니다. 사카로마이세스 세레비지애 는 세포 주기 조절을 연구하는 고전적인 모델이지만 S기의 세포 분율 또는 S기 기간과 같은 주요 DNA 복제 매개변수는 여전히 결정하기 어렵습니다. 이 프로토콜은 조작된 TK-hENT1 효모 세포에서 티미딘 유사체인 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU)의 짧고 독성이 없는 펄스를 사용한 다음 클릭 반응으로 검출하여 현미경 및 유세포분석을 통해 단일 세포 및 집단 수준 모두에서 높은 공간 및 시간 분해능으로 DNA 복제를 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 이 방법은 효모 돌연변이체의 S 단계 및 세포주기 진행에서 이전에 간과 된 결함을 식별 할 수 있으므로 게놈 안정성을 보장하는 데 필수적인 새로운 플레이어의 특성화를 허용합니다.

서론

유사분열 분열을 통한 게놈 안정성은 완전하고 동일한 염색체 세트를 생산된 두 세포 자손으로 전달함으로써 보장됩니다. 이것은 세포주기의 각 단계에서 주어진 시간에 발생하는 일련의 사건의 정확한 완료에 의존합니다. G 1에서 복제 원본은 Cdc6¹을 포함한 여러 라이센스 요소를 모집할 때 라이센스가 부여됩니다. S 단계에서 전체 게놈 복제는 여러 활성 복제 기점에서 시작되고 복제 공장²이라는 현미경으로 보이는 초점에 모이는 복제 기계에 의해 수행됩니다. M 단계에서, 복제 된 자매 염색분체는 유사 분열 방추에 부착되고 이중 배향되어 유사 분열 세포³의 반대 극으로 분리 될 수 있습니다. 각 단계의 조절, 적절한 완료 및 기간은 게놈 안정성을 보장하는 데 중요합니다. 실제로, 이러한 단계에서 조기 종료는 게놈 불안정성을 초래합니다. 예를 들어, 출아 효모 CDK 억제제 Sic1의 결실 또는 G1 사이클린의 과발현에 의해 유도된 더 짧은_G1은 후속 S상 4,5,6을 변화시킬 것이다.

프로토콜

1. S. 세레비시아에 세포 배양

참고: 사용된 효모 균주는 표 1에 나열되어 있습니다.

알림: S상 지속 시간은 다양한 방법으로 모니터링할 수 있습니다. 다루어야 할 질문에 따라, 세포는_G1 정지 후에 비동기적으로 또는 동기적으로 성장될 수 있다.

1. 비동기적으로 성장하는 S. 세레비시아에 세포에서
   참고: 이 방법을 사용하면 비동기적으로 증가하는 세포 집단에서 S 단계의 세포 백분율을 결정할 수 있습니다. 배가 시간을 결정함으로써 S 상 (및 다른 상)의 지속 시간을 외삽 할 수 있습니다.
   1. S. cerevisiae 세포를 낮은 세포 농도(5 × 10⁴ cells/mL)의 합성 완전(SC) 배지 10mL에 접종하여 130rpm에서 궤도 교반으로 30°C에서 밤새 배양합니다.
      알림: 농도는 세포 카운터로 측정됩니다. 배가 시간을 효율적으로 계산하려면 아직 지수 단계에 있는 야간 배양(즉, 이상적으로는 2 × 10⁷ cells/mL 미만)에서 배양을 접종하는 것이 좋습니다. 풍부한 배지(YPD)....

결과

S기 지속기간 및, 보다 광범위하게는_G1 및_G2+M의 지속기간을 결정하기 위해(프로토콜 단계 1.1), S. 세레비지애 W303 야생형 세포(WT, 표 1)를 SC 배지에서 7시간 동안 비동기적으로 성장시켰다. 매 시간마다, 세포 농도를 모니터링하여 배가 시간을 결정하였다(도 2B). 이들 성장 조건에서, 계산된 배가 시간은 25°C에서 120분 ± 13분이었다(표 2). 세포가 지수기(2 × 10 6-5 × 10⁶ cells/mL)에 있을 때, 세포의 분취량을 5분 동안 EdU(10μM)로 펄스 라벨링하여 S 페이즈의 셀을 선별하고_G1, S 및_G2+M 페이즈에 있는 셀의 백분율을 결정하였다. 3개의 세포 집단이 이변량 EdU-PI 세포분석기 분석에서 관찰되었다(

토론

효모는 세포주기 연구의 주요 모델 유기체이지만 DNA 복제의 추적자로 사용되는 BrdU와 같은 외인성 뉴 클레오 사이드를 통합 할 수 없기 때문에 S 단계의 특성화는 오랫동안 방해 받아 왔습니다. 효모에 단순 포진 티미 딘 키나아제 (TK)의 높은 발현을 장착하고 인간 뉴 클레오 시드 수송 체 (hENT)를 첨가하면이 문제가 크게 해결되었습니다^15,16. EdU는 항 BrdU 항체¹⁷과 달리 작은 형광 아지드 및 클릭 화학을 사용한 검출이 투과화된 효모 세포 및 FACS 분석에 적합하기 때문에 BrdU보다 더 다재다능합니다. 여기에서 우리는 이 TK-hENT1 균주에서 EdU 라벨링 및 검출 조건을 최적화하고 이전에 검출되지 않은 복제 결함을 FACS 또는 현미경으로 이 프로토콜을 사용하여 정량화할 수 있음을 보여주었습니다.

동일한 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
&알파;-팩터	Genescript	RP01002
소 혈청 알부민 (BSA)	Euromedex	04-100--812-E
구리 황산	시그마	C1297
DAPI	시그마	D9542
디-설포-시아닌5 아지드 (Cy5 아지드)	Interchim	FP-JV6320	Alexa647-Azide
Dy-530 아지드	Dyomics	530-10
EdU(5-에티닐-2'-데옥시우리딘)	Carbosynth	NE08701
에탄올 앱솔루트	Carlo Erba 시약	P013A10D16	또는 등가
L-아스코르브산	Sigma	A4544
Propidium iodide	Sigma	P4864
Proteinase K	Euromedex	EU0090
Rnase	SIGMA	R5000
Sytox Green	Invitrogen	S-7020
Equipment
Cell counter	OLS	CASY
유세포 분석기	Agilent	NovoSampler Pro
진탕 인큐베이터	Infors	444-4230	또는 동급
진탕수 bath	Julabo	SW22	또는 동급의
제품, Sonicator	, Sonics,	Vibra cell
, 광시야 현미경,	Leica,	THUNDER Imager	또는 동급의