제브라피시의 면역 세포 기능에 대한 생물독소의 영향 평가

요약

이 프로토콜은 제브라피시 백혈구의 다양한 하위 집단의 내세포 기능에 대한 독소 노출의 영향을 평가할 수 있는 유세포 분석 분석에 대해 설명합니다. 분석에서 특정 기능 억제제를 사용하면 변경된 내포세포 메커니즘을 구별할 수 있습니다.

초록

다양한 생물학적 독소가 수생 환경에서 유해한 수준으로 존재할 수 있습니다. 시아노박테리아(Cyanobacteria)는 수생 환경에서 시아노톡신을 생산하는 다양한 원핵 미생물 그룹입니다. 이러한 생물독소는 간독소, 피부독소 또는 신경독소일 수 있으며 어류와 포유류에 영향을 미칠 수 있습니다. 높은 수준에서 이러한 화합물은 치명적입니다. 치명적이지 않은 수준에서는 은밀하게 행동하고 면역 세포 기능에 영향을 미칩니다. 조류에서 생성되는 생물독소에는 마이크로시스틴과 아나톡신 A가 있으며, 수생 동물도 클로스트리디움 보툴리눔에서 생성된 보툴리눔 신경독소 E(BoNT/E)에 오염된 물질을 섭취하여 사망에 이르거나 면역 기능을 저하시킬 수 있습니다. 제브라피시는 독소가 면역 세포 기능에 미치는 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 연구에서 독소 노출은 생체 내 또는 체외에서 수행될 수 있습니다. 생체 내 연구는 제브라피시를 독소에 노출시킨 다음 세포를 분리합니다. 이 방법은 조직 환경이 백혈구 기능에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 보여줍니다. 시험관 내 연구는 먼저 세포를 분리한 다음 배양 웰의 독소에 노출시킵니다. 백혈구는 신장 골수 추출에 의해 얻어진 후 밀도 구배 원심분리가 이루어집니다. 백혈구가 병원체를 내재화하는 방법은 내포세포 메커니즘에 의해 결정됩니다. 유세포 분석 phagocytosis assay는 독소 노출에 의해 내포세포 메커니즘이 변경되었는지 여부를 보여줍니다. 독소가 어떻게 면역 기능 장애를 일으키는지 확인하기 위해 분리된 백혈구를 사용하는 연구는 부족합니다. 이 기사에 설명된 절차를 통해 실험실에서는 제브라피시를 사용하여 환경 독소가 면역 세포의 내포세포 기능을 감소시킬 때 영향을 받는 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

서론

환경적 생물독소와 면역억제제에는 많은 종류가 있습니다. 박테리아 독소를 포함하는 조류 대발생은 내륙 해역에서 발생하며 생물막으로 발생할 수도 있습니다¹. 시아노박테리아(남조류)는 모든 담수 생태계에서 자연적으로 발생합니다. 시아노박테리아 번식은 담수 시스템에서 상당히 증가했습니다². 특정 시기에 시아노박테리아는 수생 및 육상 동물에 해로운 독소를 생성할 수 있습니다. 이러한 독소는 간, 피부, 점막 및/또는 신경계에 영향을 미칠 수 있습니다. 시아노박테리아에 의해 생성되는 두 가지 화합물은 마이크로시스틴(microcystin)과 아나톡신(anatoxin)입니다. 마이크로시스틴(Microcystin)은 고리형 헵타펩타이드(cyclic heptapeptide)입니다³. 아나톡신 A는 알칼로이드⁴입니다. 보툴리눔 신경독소 E(BoNT/E)는 수생계에서 발생하는 또 다른 독소입니다. 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum )에 의해 생산되며 수생 동물이 섭취할 수 있습니다⁵.

환경 독소에 대한 노출은 물고기에 영향을 미치고 동물의 건강에도 영향을 미치고 질병 발생을 증가시킬 수 있습니다⁶. 이러한 독소가 면역 세포에 어떤 영향을 미치는지 이해하는 것은 이러한 물질에 대한 노출과 관련된 위험을 결정하는 데 필수적입니다. 제브라피시는 환경 독소가 면역 세포에 미치는 영향을 연구하는 데 탁월한 모델입니다⁷. 유세포 분석법과 제브라피시 백혈구를 활용하는 방법을 개발하는 것은 매우 유익합니다. 제브라피쉬는 인간과 생리학적으로 관련성이 있으며, 이 방법은 기초 독성학 및 면역학에서 약물 발견 및 발달 생물학에 이르기까지 광범위한 연구 분야에 적용할 수 있습니다. 제브라피쉬는 수생 생물이기 때문에 수인성 환경 독소의 영향을 연구하는 데 특히 적합합니다⁷. 제브라피쉬의 사용은 다른 척추동물 모델보다 저렴하며 윤리적 우려가 적습니다.

백혈구 또는 백혈구는 질병을 일으키는 유기체에 대한 세포 방어의 첫 번째 라인입니다. 세포내이입(Endocytosis)은 세포가 세포 외부에 있는 액체나 입자를 흡수하거나 내재화하는 과정입니다. 이것은 세포가 화합물을 소포(⁸)로 둘러싸고 있음에 의해 달성된다. 백혈구는 이 과정을 병원체를 죽이고 질병에 대한 방어를 준비하는 첫 번째 단계로 사용합니다. 식세포작용(phagocytosis)은 세포내이입(endocytosis)의 일종으로, 환경 오염 물질이 어류의 건강에 미치는 영향을 조사하는 데 사용된 최초의 방법 중 하나였다⁹. Petrie-Hanson 실험실은 제브라피시 백혈구를 사용하여 백혈구 내포세포 및 식세포 기능을 방해하고 면역 방어에 영향을 미칠 수 있는 잠재적인 능력에 대해 생물독소를 스크리닝하는 방법을 개발했습니다. 이러한 방법에 포함된 세포내이입의 유형은 pinocytosis, phagocytosis, calcium dependent receptor-mediated phagocytosis 및 mannose receptor mediated phagocytosis입니다. 제브라피시에 유세포 분석 방법을 사용하는 것은 Petrie-Hanson lab⁹ 에서 처음 설명되었으며 수생 독소 및 병원체를 조사하는 데 일상적으로 사용됩니다. Rag1^-/- 돌연변이 제브라피쉬는 T 및 B 세포¹⁰ 을 가지고 있지 않으며 선천성 면역 세포 메커니즘을 특이적으로 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

유세포 분석은 레이저 기반이며 세포의 물리적 특성을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 전방 산점도 또는 FSC 값은 X축에 표시되며 셀의 크기를 나타냅니다. 측면 산란 또는 SSC는 Y축에 표시되며 세포의 세포질 입도를 나타냅니다. 결과 플롯은 유사한 물리적 특성을 가진 세포 집단이 함께 그룹화되어 있으며, 서로 다른 세포 유형이 산점도의 다양한 위치에 나타납니다. 이러한 집단은 세포의 물리적 특성이 변화함에 따라 산점도의 위치를 변경할 수 있습니다⁹. 제브라피시 백혈구에 이 기술을 사용하면 연구자들은 환경 독소를 포함한 다양한 자극에 대한 반응으로 세포 집단의 변화를 평가할 수 있습니다.

유세포 분석기는 다차원이며, 여러 유형의 형광단을 평가에 사용하여 세포와 세포의 활성을 추가로 특성화할 수 있습니다. 이 프로토콜에 설명된 분석에서 세포내이입은 세포가 내재화한 형광 물질의 양을 측정하는 것이 특징입니다. 독소 노출이 내세포 메커니즘에 영향을 미치는지 여부와 방법은 유세포 분석을 사용하여 독소에 노출된 세포의 물질에 흡수하는 능력과 비독성 노출 세포의 능력을 비교하여 결정할 수 있습니다. 이러한 방식으로 평가할 수 있는 세포내이작용(endocytic process)은 pinocytosis, receptor mediated endocytosis, phagocytosis를 포함한다.

Pinocytosis는 용해성 성분을 흡수하는 것으로, 세포 수용체를 활용하지 않습니다. 흡수는 작은 액포를 형성하기 위해 미세필라멘트와 미세소관에 의한 세포질 재배열을 포함합니다. Luciferase Yellow(LY)는 비선택적 병세포작용¹¹에 의한 액체 흡수를 측정하는 데 사용되는 형광 염료입니다. 수용체 매개 세포내이입은 큰 분자의 선택적 흡수를 포함합니다. 플루오레세인(FITC) 표지 덱스트란(DX) 40을 사용하여 이 프로세스를 평가할 수 있습니다. 식세포작용(phagocytosis)은 0.5마이크로미터보다 큰 입자를 섭취하는 세포내이입(endocytosis)의 한 형태입니다. 이 과정은 FITC-DX70 및 FITC-Eschericia coli를 사용하는 절차로 조사됩니다. DX40과 DX70의 분자량은 각각 40,000과 70,000입니다. FITC-E. coli 는 유세포 분석기로 측정할 수 있는 형감에 결합된 E. coli 의 표준 실험실 균주입니다. 많은 형태의 수용체 매개 세포내이입(receptor mediated endocytosis)은 신호 분자로서 칼슘을 필요로 하며, 세포골격 재배열(cytoskeletal rearrangement)을 위해 칼슘을 필요로 한다⁹. 수용체 매개 세포내이입의 또 다른 유형은 만노스 수용체(mannose receptor, MR) 매개 세포내이입입니다. 만노스 수용체(Mannose receptor)는 미생물 세포 표면에 있는 만난의 형태를 인식하는 막관통 단백질(transmembrane protein)이다⁹. 이러한 절차를 최적화하려면 사용할 용량을 설정하기 위해 각 독소에 대해 용량 반응 곡선을 만들어야 합니다. 사용할 정확한 농도를 평가하기 위해 LY, FITC-DX40, FITC-DX70 및 FITC-E. 대장균 에 대해 포화 곡선을 수행해야 합니다.

백혈구가 다른 입자를 내재화하는 데 사용하는 메커니즘은 다양할 수 있습니다. 과정의 어떤 구성 요소가 독소 노출에 의해 영향을 받을 수 있는지 제안하기 위해 억제제를 추가하여 식세포 메커니즘을 차단할 수 있습니다. 사이토칼라신 D(CCD)는 미세소관의 움직임을 억제하여 병세포작용(pinocytosis)을 유발합니다. CCD는 수용체 매개 세포내이입에 영향을 미치지 않는다¹¹. EDTA는 칼슘(Ca²⁺) 의존성 수용체 매개 세포내이입(endocytosis)을 차단합니다. 만난(Mannan)은 MR을 위한 천연 리간드(ligand)이며, 만난(Mannan)은 식세포작용(phagocytosis) 또는 피노사이토시스(pinocytosis)가 만노스 수용체(mannose receptor)를 매개하는지 평가하기 위한 만노스 수용체 억제제로 사용된다⁹.

이 프로토콜의 목적은 독소 노출이 식세포 백혈구가 병원체를 흡수하는 능력에 영향을 미쳤는지 여부를 결정하는 절차를 입증하는 것입니다. 이러한 프로토콜은 또한 특정 내포세포 메커니즘이 영향을 받는지 여부를 식별할 수 있습니다. 유세포분석기에서 이러한 분석을 수행하면 크기와 세포질 입도에 따라 백혈구 집단을 선택하여 백혈구 하위 집단이 차별적으로 영향을 받았는지 여부를 확인함으로써 추가적인 구별이 가능합니다. 이 방법은 세포 집단의 전자 게이팅에 의존합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 미시시피 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회(MSU-IACUC)의 승인을 받았습니다. 이 연구에 사용된 모든 제브라피쉬는 미시시피 주립 대학(MSU)의 수의과 대학의 특정 병원체가 없는 부화장에서 이전에 확립된 rag1^-/- 돌연변이 제브라피쉬의 동형접합 군체에서 사육되었습니다¹⁰. 야생형 제브라피쉬도 이 부화장에서 번식했습니다. 이러한 연구에서 독소 노출은 생체 내 또는 체외에서 수행될 수 있습니다. 생체 내 연구는 제브라피시를 독소에 노출시킨 후 백혈구를 분리하여 독소와 조직 미세환경이 어떻게 상호 작용하고 백혈구 기능에 영향을 미칠 수 있는지 나타냅니다. 시험관 내 연구는 백혈구를 분리한 다음 세포를 배양 웰의 독소에 노출시킵니다.

1. 시약 및 용액 준비

1. 형광 활성화 세포 분류(FACS) 완충액: (칼슘 또는 마그네슘이 없는 행크스 균형 염 용액(HBSS) + 0.05% 소 혈청 알부민(BSA)) ( 재료 표 참조). 세포 분리 전에 이것을 신선하게 준비하십시오.
2. 조직 배양 배지(TCM): 글루타맥스와 10% 소 태아 혈청이 보충된 RPMI-1640을 사용합니다( 재료 표 참조).
3. 사이토칼라신 D(CCD): 200 proof 앱솔루트 에탄올 1mL에 시판되는 제품( 재료 표 참조)을 재현탁하여 원액을 제조합니다. 980μL의 FACS 완충액에 20μL의 스톡 CCD를 추가하여 최종 농도 2.5μg/mL를 얻어 작업 용액을 준비합니다.
4. EDTA : 원액은 1mg / mL입니다. 900μL의 FACS 완충액에 100μL의 원액을 첨가하여 최종 농도 1mM를 얻어 작업 용액을 준비합니다.
5. Mannan: 1mg/mL 원액을 준비합니다( 재료 표 참조). 다음으로, 900μL의 FACS 완충액에 100μL의 원액을 첨가하여 최종 농도 500μg/mL를 얻어 작업 용액을 준비합니다.
6. Lucifer Yellow(10 μg/mL)(LY, 형광 염료), Dextran-40(DX-40, 500 μg/mL) 및 Dextran-70(DX-70, 500 μg/mL)을 시판되는 시약(재료 표 참조)을 멸균수에 재현탁하여 각각 1 mg/mL 용액을 만들어 별도로 준비합니다.
7. 플루오레세인(FITC) 박테리아: 빛으로 보호된 환경에서 37°C에서 하룻밤 동안 50μg/mL FITC가 보충된 100mL Luria Bertani(LB) 배지에서 진탕하여 Escherichia coli DH5α( 재료 표 참조)를 성장시켜 540nm에서 0.8의 광학 밀도(OD)를 얻습니다.
   1. 박테리아(3x)를 인산염 완충 식염수(PBS)로 1000 x g 에서 10분 동안 원심분리한 후 60°C에서 20분 동안 가열합니다. 1회 더 씻은 다음 박테리아 농도를 OD₅₄₀ 0.8로 조정합니다. 이것은 재고 솔루션이 될 것입니다.
   2. 원액(1mL 스톡: 99mL FACS 완충액)을 1:100으로 희석하여 작업 용액을 준비합니다. 최종 농도를 1.8 x 10⁸ cells/mL로 조정합니다.

2. 제브라피시 관리

1. 제브라피시를 탈염소 처리된 도시 물에서 단일 통과 흐름 스루 시스템으로 유지하고 고단백 어분과 살아있는 아르테미아를 포만감까지 공급합니다.
2. 생후 6개월이 되면 수조에서 혼성 제브라피시를 제거하고 실험에 사용하기 위해 실험실로 운반합니다. 이 연령은 신장 골수에서 최적의 백혈구 수를 분리하는 데 사용할 수 있는 가장 좋은 연령입니다⁹.

3. 세포 격리

1. 확립^{된 방법에 따라} 10마리의 제브라피시를 트리카인(~100mL, 4mg/mL 인산염 완충 트리카인 메탄 설포네이트/물고기 물 리터)에 넣고 안락사시킵니다(재료 표 참조).
2. 40μm 세포 여과기를 50mL 코니컬 원심분리 튜브에 넣습니다.
3. 신장 골수 조직⁽⁹ )을 제거하고 3mL의 조직 배양 배지가 있는 C-튜브에 넣고 조직 해리기를 사용하여 조직을 균질화합니다. 이 절차가 선호됩니다.
4. 또는 세포 여과기에서 3mL 주사기의 고무 끝으로 조직을 파괴합니다. 조직이 균질화(또는 파괴)된 후 50mL 원뿔형 튜브 위에 놓인 40μm 세포 여과기를 통해 현탁액을 붓습니다.
5. 여과된 현탁액을 500 x g 에서 16°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 붓습니다. 3mL의 TCM에 세포를 재현탁합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다.
6. 실온에서 3mL 멸균 여과된 밀도 구배 배지(1.077g/mL)에 세포를 조심스럽게 층을 이룹니다.
7. 다음으로, 800 x g 에서 16°C에서 20분 동안 원심분리합니다. 브레이크가 가장 낮은 설정에 있는지 확인하여 원심분리기가 멈출 때 셀이 다시 부유하지 않도록 합니다.
8. 계면에서 14mL 원형 바닥 튜브로 연결되는 불투명한 버피 층을 제거합니다.
9. 5mL의 TCM을 첨가하고 파스퇴르 피펫과 혼합하여 세포를 세척합니다. 300 x g 에서 16°C에서 5분간 원심분리기.
10. 상층액을 버리고 세포 펠렛을 TCM에 재현탁하여 약 1 x 10⁶ cells/mL를 생성하면서 단계를 반복합니다.

4. 세포 생존율 분석

1. 세포 생존력을 모니터링하려면 프로피듐 요오드화물(PI) 염색을 사용하여 세포 사멸을 평가합니다.
   1. 분석할 세포의 5μL/mL 농도에서 PI(200μg/mL)를 추가합니다. PE/Texas Red 채널에서 읽어보세요.
      참고: Propidium iodide는 죽은 세포의 막에 있는 구멍을 통해 확산되어 염색됩니다. 본 연구에서 평가된 생존율은 85%였다.

5. 독소 배양

1. 분리된 세포 현탁액에서 200μL의 세포를 6웰 조직 배양 플레이트의 각 웰(대조군용 3웰, 독소 노출용 3웰)로 분취합니다. 이를 통해 복제를 세 번 실행할 수 있습니다.
2. 각 웰에 2mL TCM을 추가합니다.
3. 3개의 웰에 독소(~2.5μg/mL)를 추가합니다.
   알림: 독소 농도는 실험을 시작하기 전에 최적화해야 하며 분석에 사용된 독소에 따라 달라집니다.
4. 원하는 노출 시간을 위해 조직 배양 플레이트를 배양합니다. 원하는 노출 시간은 실험을 시작하기 전에 최적화해야 하며 분석에 사용된 독소에 따라 달라집니다. 본 연구에서 노출 시간은 ~1시간이었습니다.
5. 노출 시간 후, 조직 배양 플레이트를 얼음 위에 10분 동안 놓습니다.
6. 각 웰의 세포를 위아래로 조심스럽게 피펫팅하여 플레이트에서 부착 세포를 제거합니다.
7. 플레이트에서 세포를 14mL 둥근 바닥 원심분리 튜브로 제거합니다.
8. 300 x g 에서 16°C에서 5분 동안 셀을 원심분리합니다. 3mL의 FACS 완충액에 세포를 재현탁합니다. 단계를 두 번 반복합니다.
9. 1.5mL의 FACS 완충액에 세포를 재현탁합니다.
   참고: 생체 내 연구의 경우 제브라피시를 독소(위에서 언급한 것과 유사한 농도)에 노출시킨 다음 세포를 분리합니다.

6. 세포내이입 분석실험

1. 100 μL의 세포를 5 mL 유세포 분석 튜브에 분취합니다. 각 웰에서 4개의 복제 튜브로 튜브에 다음과 같이 라벨을 붙입니다: (1) LY, (2) DX40, (3) DX70, (4) FITC-E. 대장균.
2. 1.6 단계 및 1.7 단계에서 언급 한대로 형광 염료를 적절한 튜브에 첨가하십시오 : 튜브 (1)에 LY 50 μL, 튜브 (2)에 50 μL DX40; 50 μL DX70 - 튜브(3); 50 μL FITC-E. 대장균 을 튜브에 (4).
3. 1시간 동안 배양합니다. 각 튜브에 200μL의 FACS 완충액을 추가합니다.
4. 400 x g 에서 16°C에서 5분 동안 셀을 원심분리합니다. 상등액을 붓고 200μL의 FACS 완충액에 세포를 재현탁합니다. 이 단계를 세 번 반복합니다. 유세포 분석을 수행합니다.

7. 유세포 분석

1. 유세포 분석을 수행하여 세포 집단을 시각화하고 데이터를 수집합니다. 자세한 내용은 Hohn et ^al.9 를 참조하십시오.
2. 첫 번째 단계에서 표적 세포 집단을 식별합니다. 측면 산란(SSC)(일반적으로 수직 축)을 사용하여 맨 왼쪽에 있는 파편과 작은 pycnotic 세포를 제거하고 전방 산란(FSC)(일반적으로 수평 축)을 사용하여 플롯 하단의 동일한 파편을 제거합니다.
3. doublet reads(두 번 계수된 셀)를 제거합니다. 이는 펄스 기하학 게이트(FSC-H x FSC-A)를 사용하여 수행됩니다.
4. 배경 신호를 확인합니다. 사용된 각 형광 색소에 대해 Cells Only Fluorescence Control과 Isotype Fluorescence Control을 실행하여 배경 형광 수준을 식별합니다.
   참고: 각 형광 색소는 세포 자가형광 및 비특이적 결합의 영향을 받는 고유한 수준의 배경 형광을 가지고 있습니다. 이것은 진정한 양성 신호와 배경 형광을 구별합니다. 형광을 기반으로 세포 집단을 식별하고 게이팅할 때 이러한 제어 값은 양성 이벤트의 수에서 차감되고 결과 숫자는 분석에 사용되는 수입니다.
5. 샘플을 실행하고 게이트할 세포 집단을 식별합니다. FSC 및 SSC를 사용하여 혼합물 세포 내에서 다양한 세포 집단을 형태학적으로 특성화하고 식별할 수 있습니다.
   참고: FSC는 주로 세포의 크기와 관련이 있습니다. 세포가 클수록 정방향으로 더 많은 빛을 산란시켜 FSC 값이 높아지는 반면, 세포가 작을수록 빛을 덜 산란시키고 FSC 값이 낮습니다. 다양한 크기의 셀이 클러스터로 그룹화됩니다. 예를 들어, 림프구가 더 작으면 과립구에 비해 FSC 값이 낮은 별도의 클러스터로 나타날 수 있습니다. SSC는 셀의 세분성, 복잡성 및 내부 구조와 관련이 있습니다. 세포질 입도가 더 높은 세포는 더 높은 SSC 값을 갖습니다. 유사한 세포가 함께 모입니다. 예를 들어, 호중구는 세포질 과립을 가지고 있으며 림프구보다 더 높은 SSC 값으로 군집합니다.
6. 모든 샘플을 실행하고 FSC/SSC를 기반으로 추가 분석을 위해 세포 집단에 게이트를 적용합니다. 게이트 영역은 세포 밀도와 관심 개체군에 따라 적용됩니다.
7. 히스토그램에 게이트 영역을 플로팅하여 청색 레이저로 495nm/519nm에서 형광에 대한 각 게이트의 FITC의 MFI(Mean Fluorescence Intensity)를 분석합니다.
8. 분석 프로그램에서 탁월한 성능을 발휘하기 위해 소프트웨어에 의해 결정된 세포 수를 내보냅니다.
9. 통계 소프트웨어 패키지의 데이터를 분석합니다( Table of Materials(재료표 참조).
10. 대조 세포의 각 집단의 MFI를 독소에 노출된 세포 집단의 MFI와 비교합니다.

8. 독소가 세포세포기전에 미치는 영향 및 억제제인 CCD, EDTA 및 만나가 세포기전에 미치는 영향

참고: 액체나 입자를 흡수하기 위해 세포 세포질은 활발하게 움직입니다. 이러한 이동에는 여러 가지 구조적 요소와 신호 경로가 필요합니다. 생물 독소는 이러한 요소 또는 경로에 영향을 미칠 수 있습니다. 특이적 특성화 억제제의 효과를 비교하는 것은 생물독소가 어떻게 작용할 수 있는지 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다¹¹.

1. 3단계에서 설명한 대로 세포 분리를 수행합니다.
2. 100 μL의 세포를 5 mL 유세포 분석 튜브(각 웰에서 4개의 복제 튜브 포함)로 부분 표본 추출합니다.
   참고: 다음과 같이 튜브에 라벨을 붙입니다: (5) CCD + LY(CCD는 미세필라멘트 및 미세소관 재배열을 억제하여 피노사이토시스를 억제합니다. LY는 미세피노세포증(micropinocytosis)에 의한 액체 흡수를 평가하는 데 사용됩니다⁾⁹. (6) EDTA + DX40 (EDTA는 Ca²⁺ 의존성 수용체 매개 식세포작용 및 미세피노세포작용(micropinocytosis)을 차단함; 흡수가 칼슘 의존성 기전을 포함하는지 측정). (7) EDTA + DX70. (8) EDTA + FITC-E. 대장균. (9) 만난 + DX40 (만난은 만노스 수용체에 의한 특정 흡수를 억제하여 MR 의존성 세포내이입⁹를 측정). (10) 만난 + DX70. (11) 만난 + FITC-E. 대장균.
3. 억제제 추가: 튜브에 1μL의 CCD(5); 10 μL EDTA - 튜브 (6-8); 100 μL 만난에서 튜브로(9-11). 1단계에서 언급한 농도를 따릅니다. 5분 동안 배양합니다.
4. 적절한 튜브에 형광 2 차 추가 : 튜브 (1) 및 (5)에 50 μL의 LY; 50 μL의 DX40을 튜브 (2), (6) 및 (9)로; 튜브 (3), (7) 및 (10)에 대한 DX70 50 μL; 50 μL의 FITC-E. 대장균 을 튜브 (4), (8) 및 (11)에 연결합니다. 30분 동안 배양합니다.
5. 각 튜브에 200μL의 FACS 완충액을 추가합니다. 400 x g , 16°C에서 5분 동안 원심분리기
6. 상등액을 붓고 200μL의 FACS 완충액에 세포를 재현탁합니다. 8.5-8.6단계를 두 번 반복합니다.
7. 7단계에 따라 유세포분석기에서 샘플을 실행합니다.

결과

세포내이입 분석법은 구배에서 분리되고 식세포와 림프구에 대해 게이트된 혼합 백혈구를 사용하여 특정 세포 메커니즘이 독소 노출에 의해 변경되었는지 여부를 확인합니다. 첫째, 셀은 크기와 세분성¹⁰에 따라 게이트됩니다. 사멸 세포, 단편화 세포 또는 죽어가는 세포는 산점도의 왼쪽 하단 모서리에 시각화되며 식세포작용에 대해 분석되지 않고 제거됩니다. 식세포 게이트에는 대식세포, 자연살해(NK 세포) 및 과립구가 포함되며, 림프구 게이트에는 림프구, 식세포 B 세포 및 비특이적 세포독성 세포(NCC)가 포함됩니다(그림 1).

식세포작용(Phagocytosis)은 청색 레이저로 495 nm / 519 nm에서 형광을 판독하여 알 수 있듯이 FITC 표지 입자의 흡수에 의해 결정됩니다. 배경 자가형광 및 비특이적 결합 형광은 대조군 세포와 동형대조군에서 방출되는 평균 형광 강도(MFI)를 고려하여 제거됩니다. 사용할 농도를 설정하기 위해 각 억제제에 대해 용량-반응 곡선을 수행해야 합니다. 테스트 중인 독소에 노출된 세포의 유세포 분석 결과가 억제제에 노출된 세포의 결과와 동일한 경우, 독소가 유사한 효과를 일으키고 있으며 해당 내세포 메커니즘을 억제하고 있을 수 있습니다. 독소와 억제제의 반응이 부가적인 경우, 이는 독소가 억제제와 다른 기전에 의해 세포내이입증을 억제하고 있을 수 있음을 시사합니다.

처리되지 않은 세포와 테스트 중인 독소로 처리된 세포(그림 2), 독소 또는 억제제로 처리된 세포(그림 3A) 및 억제제만 처리된 세포(그림 3B)를 비교했습니다. 대표적인 결과는 마이크로시스틴으로 처리된 세포가 CCD로 처리된 세포와 유사하게 억제되었음을 보여줍니다. 이러한 결과는 마이크로시스틴이 마이크로피노세포증에 의한 액체 흡수를 억제한다는 것을 보여줍니다. 게이트 세포는 일원 분산 분석으로 분석되며, 결과는 FITC에 양성인 평균 세포 수로 보고되어야 합니다.

그림 1: 전방 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC) 특성을 기반으로 야생형 제브라피시 신장 조직에서 분리된 백혈구의 대표적인 유세포 분석 산점도. 식세포 게이트에는 대식세포/단핵구 및 과립구(게이티드 세포의 23%)가 포함됩니다. 림프구 게이트에는 림프구, 식세포 B 세포 및 비특이적 세포독성 세포(NCC)(게이트 세포의 26%)가 포함됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 독소에 노출된 후 그림 1 에서 개폐된 식세포 세포의 평균 형광 강도(MFI). 튜브 (1)은 염색되지 않은 세포를 보여주는 반면 튜브 (2)의 세포는 LY의 흡수를 통해 형광을 방출합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 그림 1에서 개폐된 식세포의 평균 형광 강도(MFI). 시토칼라신 D(CCD) 억제제(A)의 존재 없이 루시퍼 옐로우(LY)의 흡수; CCD의 존재와 함께 LY의 흡수. 튜브 (1)은 염색되지 않은 세포를 보여주는 반면 튜브 (2)의 세포는 LY의 흡수를 통해 형광을 방출합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 프로토콜과 관련된 단계의 개요. *물고기가 생물독소에 노출되는 기간과 정도는 사용된 특정 생물독소와 다른 기관의 동물 관리 및 생물 안전성 규정 및 프로토콜에 따라 다릅니다. **사용된 원하는 농도와 사용된 노출 시간은 실험 전에 최적화되어야 하며 사용하는 독소에 따라 다릅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

제브라피시 백혈구를 이용한 유세포 분석법을 활용하면 면역 체계를 자세히 연구하고, 환경 독소의 영향을 평가하고, 독성학 연구를 촉진할 수 있는 강력하고 다재다능한 접근 방식을 제공할 수 있습니다. 이는 독소가 면역 세포와 면역 반응에 미치는 영향을 빠르고 효과적으로 평가할 수 있는 방법을 제공합니다. 그 결과 관련된 체액성 요인이 드러나고 물고기의 생리와 신진대사가 환경 생물 독소와 어떻게 상호 작용하는지 시사합니다. 프로토콜의 개요는 그림 4에 나와 있습니다.

그러나 이러한 방법에는 제한 사항이 있습니다. 유세포 분석을 위해 제브라피시 백혈구를 준비하는 것은 다른 모델에 비해 더 복잡할 수 있습니다. 제브라피쉬의 작은 크기는 혈액의 양과 분석에 사용할 수 있는 백혈구의 수를 제한할 수 있습니다 ^9,10. 이러한 절차에서는 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 조직을 분리해야 하며, 세포 생존율은 결과의 정확도에 영향을 미칠 수 있습니다. 마우스와 같은 모델과 비교했을 때, 제브라피시 세포 마커에 특이적인 항체와 같은 사용 가능한 면역학 도구의 범위는 제브라피시에 대해 더 제한적입니다. 이러한 제한으로 인해 제브라피시 백혈구에 대해 수행할 수 있는 분석의 깊이가 제한될 수 있습니다. 또한 유세포 분석 데이터를 해석하려면 특히 복잡한 면역 반응을 다룰 때 전문 지식이 필요합니다. 데이터를 잘못 해석하면 특히 환경 독소가 미치는 영향과 관련하여 잘못된 결론을 내릴 수 있습니다.

억제제가 첨가되지 않은 세포 샘플의 결과를 억제제가 있는 세포 샘플과 비교할 수 있습니다. 독소가 첨가된 세포 샘플의 결과는 억제제가 있는 세포 샘플과 비교해야 합니다. 세포골격 재배열이 영향을 받은 경우 LY 흡수가 제한됩니다. 독소가 DX-40 또는 DX-70 흡수를 억제하는 경우 다른 크기의 미립자가 식세포작용되지 않습니다. 세포가 FITC-E. 대장균을 흡수하지 않으면 독소가 식균작용을 억제한 것입니다.

요약하면, 제브라피시는 환경 독소가 면역 세포에 미치는 영향을 연구하기 위한 훌륭한 모델 역할을 합니다. 이 프로토콜은 유세포 분석법과 제브라피시 백혈구를 활용하여 생물독소를 스크리닝하는 방법을 간략하게 설명하며, 특히 세포내이입 및 식세포작용 과정에 중점을 둡니다¹¹. 이 연구의 목표는 독소 노출이 식세포 백혈구가 병원체를 흡수하는 능력에 영향을 미치는지 확인하고 특정 내포세포 메커니즘에 대한 잠재적 영향을 식별하는 것입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10% 소 태아 혈청	Gibco	A3160501
14 mL 둥근 바닥 원심분리기 튜브	BD Biosciences	352059
40 µ m 세포 균주	Corning	07-201-430
5 mL 유세포 분석 튜브	BD Biosciences	352235
50 mL 원추형 원심 분리기 튜브	Corning	14-959-49A
절대 에탄올	Fisher	BP2818-500
자동 세포 계수기	생존력 연구를 위한	Countess II FL
소 혈청 알부민 (BSA)	시그마	A3059
사이토칼라신 D (CCD)	시그마	C8273-5MG
덱스트란 40	시그마	FD40-100MG
덱스트런 70	시그마	46945-100MG-F
대장균 DH5α (또는 기타 실험실 박테리아 균주)	New England Biolabs	C29871
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)	Sigma	ED4SS
유동 분석 소프트웨어	Novoacea 소프트웨어
유세포 분석기	Novocyte 3000
Fluorescein	Fluka BioChemica	46950
칼슘 또는 마그네슘이 없는 균형 잡힌 염 용액	Sigma	H4891
Histopaque 1077	Sigma	10771-100ML
Lucifer Yellow	Sigma	L0259-25MG
Mannan	Sigma	M7504-250MG
인산염 완충 식염수	Sigma	P3813
RPMI-1640 with GlutaMax	Gibco	61870036
통계 소프트웨어	SPSS
독소
트리카인	웨스턴 케미컬 Inc	NC0342409