여기에서는 최적화된 차등 초원심분리 방법을 통해 간암 조직에서 유래한 작은 세포외 소포의 농축을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
조직에서 유래한 작은 세포외 소포(sEV)는 소스 세포의 기능 상태와 조직의 간질 공간의 특성을 반영할 수 있습니다. 이러한 sEV의 효율적인 농축은 생물학적 기능 연구의 중요한 전제 조건이며 임상 검출 기술 및 치료용 운반체 기술 개발의 핵심입니다. sEV는 일반적으로 심하게 오염되어 있기 때문에 조직에서 분리하기가 어렵습니다. 이 연구는 간암 조직에서 고품질 sEV를 빠르게 농축하는 방법을 제공합니다. 이 방법은 소화 효소(콜라게나제 D 및 DNase Ι)를 조직과 배양하고, 70μm 세포 여과기를 통한 여과, 차등 초원심분리, 0.22μm 멤브레인 필터를 통한 여과의 4단계 공정을 포함합니다. 차동 초원심분리 단계의 최적화와 여과 단계의 추가로 인해, 이 방법에 의해 얻어진 sEV의 순도는 고전적인 차동 초원심분리에 의해 달성된 것보다 더 높다. 조직 유래 sEV 연구를 위한 중요한 방법론과 지원 데이터를 제공합니다.
서론
작은 세포외 소포체(sEV)는 직경이 약 30nm에서 150nm이며 다양한 세포에서 분비된다1. 그들은 지질, 단백질, DNA 및 RNA와 같은 중요한 생물학적 분자를 다양한 기관, 조직, 세포 및 세포 내 부분으로 운반하여 조직 세포와 통신하고 국소 또는 먼 미세 환경을 조절할 수 있습니다. 따라서, 그들은 또한 수신자 셀(2,3)의 동작을 변경할 수 있다. 특정 sEV의 분리 및 정제는 질병의 발달 및 경과 동안 생물학적 거동을 연구하기 위한 필수 전제 조건입니다. 금본위제로 간주되는 차등 초원심분리는 일반적으로 sEV가 일반적으로 상주하는 조직에서 분리하는 데 사용됩니다4. 조직 파편, 세포 파편, 큰 소포 및 세포 사멸체는 이 기술로 제거할 수 있으며 sEV만 남습니다.
콜라게나제 D와 DNase I은 세포나 소포의 분자적 특성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으며, 두 효소의 특성은 세포외 기질에서 소포의 방출에 기여한다 5. 이 효소는 인간 전이성 흑색종 조직, 결장암 조직 및 결장 점막 조직에서 s....
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프로토콜
인간 간암 조직은 간난 의과 대학 제 1 부속 병원에서 간암 진단을받은 환자로부터 수집되었습니다. 모든 환자는 정보에 입각한 동의서에 서명했으며 인체 조직 샘플 수집은 간난 의과대학 제1부속병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 장비 및 소프트웨어와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 준비
- 인큐베이터에 전사 탈색 쉐이커를 넣고 온도를 37°C로 설정합니다. 필요한 다른 모든 장비에 대해서는 그림 1 을 참조하십시오.
- 메스와 집게에 75% 알코올을 뿌려 청소하십시오.
- 콜라게나제 D 6mg(4mg/mL)과 DNase Ι 24μL(80U/mL)를 측정하여 RPMI-1640 염기성 배지 1.5mL에 첨가하여 소화액을 준비합니다. 첨가제가 완전히 녹을 때까지 부드럽게 뒤집어 혼합하십시오.
- 미리 70μm 및 0.22μm 세포 여과기를 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 적십니다.
- 해동 후 간 조직을 고정하기 위해 아이스박스에 100mm 멸균 세포 배양 접시를 놓습니다.
- 간세포 암종 조직....
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결과
인간 간암 조직의 sEV는 간암 환자의 진단, 치료 및 예후에 중요한 역할을 했습니다. 이 방법은 일반적인 실험실 장비를 사용하여 간암 조직에서 파생된 sEV를 분리하고 정제했습니다. 이것은 sEV 연구에 대한 방법론적 지원을 제공할 수 있습니다. 그림 2는 간암 조직에서 sEV를 농축하는 일반적인 과정을 보여줍니다. 조직의 세포간 공간에 있는 sEV는 조직 절단과 효소 가수분해를 통해 완전히 방출됩니다. 또한, 소화 용액은 70 μm 필터로 여과되어 큰 조직 조각을 제거한다. 또한, 작은 조직 파편, 세포 파편, 큰 소포 및 세포사멸체를 제거하기 위해 차등 원심분리 단계(500×g, 3,000×g 및 12,000×g)를 수행했습니다(그림 3A-C).
고순도 sEV를.......
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토론
이 프로토콜은 간암 조직에서 sEV를 추출하는 반복 가능한 방법을 설명합니다. 고품질 sEV는 날카로운 조직 분리, 소화 효소 처리, 차등 초원심분리, 0.22μm 필터 멤브레인 여과 및 정제를 통해 얻을 수 있습니다. 다운스트림 분석의 경우 sEV의 고순도를 보장하는 것이 매우 중요합니다. 차등 원심 분리 과정에서 상청액 표면에 백색 물질 층 (알려지지 않은 조성)이 나타납니다. 이 층은 sEV를 오염시킬 수 있으므로 반복적인 원심분리(3,000 × g 및 12,000× g)와 0.22μm 멤브레인을 통한 여과(보충 표 S1)를 통해 가능한 한 많이 제거했습니다. 이 백색층의 간섭으로 인해 상층액을 흡인하는 동안 sEV를 잃을 위험이 있었습니다. 따라서 여러 번의 원심분리를 통해 조심스럽게 진행하고 백색 물질을 건드리지 않고 가능한 한 조심스럽게 상층액을 수집하는 것이 중요합니다.
이 프로토콜은 고품질 간 조직 유래.......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
저자들은 이 작업을 지원해 준 간난 의과대학 제1부속병원에 감사를 표한다. 이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 82260422)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.22 & 마이크로; m 멤브레인 필터 유닛 | Millex | SLGPR33RB | |
| 1 mL 멸균 주사기 | Hubei Xianming Medical Instrument Company | YL01329 | |
| 2% 우라닐 아세테이 | 전자 현미경 과학 | 22400-2 | |
| 4.7 mL 원심분리기 튜브 | Beckman Coulter | 361621 | |
| 6-well 세포 피부 플레이트 | LABSELECT | 11110 | |
| 50 mL 비커 | Tianjin Kangyiheng 실험 기기 판매 회사 | CF2100800 | |
| 70 µ m 세포 여과기 | Biosharp | BS-70-XBS | |
| 100 mm 세포 배양 접시 | CELL TER | CS016-0128 | |
| 600 µ L 원심분리기 튜브 | Axygen | MCT060C | |
| BCA 단백질 정량 키트 | Thermo Fisher | RJ240544 | |
| Beckman Coulter Optima-Max-TL | Beckman | A95761 | |
| BioRad Mini trans-blot | Bio-Rad | 1703930 | |
| BioRad Mini-Protean | Bio-Rad | 1645050 | |
| CD63 항체 | Abcam | ab134045 | |
| CD9 항체 | Abcam | ab263019 | |
| 원심분리기 5430R | Eppendorf | 5428HQ527333 | |
| 세정 용액 | NanoFCM | C1801 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| 구리 그물 | Henan Zhongjingkeyi Technology Company | DJZCM-15-N1 | |
| 건식 온도 조절기 | 항주 allsheng instruments company | AS-01030-00 | |
| FITC 안티 인간 CD9 항체 | Elabscience | E-AB-F1086C | |
| 글리신 | Solarbio | G8200 | |
| 염소 홀스래디시 퍼옥시다제(HRP) 결합 2차 항-마우스 항체 | Proteintech | SA00001-1 | |
| 염소 홀스래디시 퍼옥시다제 (HRP) 결합 2차 항토끼 항체 | Proteintech | SA00001-2 | |
| 메탄올 | Shanghai Zhenxing Chemical Company | ||
| 나노 입자 유세포 분석기 | NanoFCM INC | FNAN30E20112368 | |
| 인산가수 분해 효소 억제제 (PhosSTOP) | Roche | 4906845001 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Servicebio | G4202 | |
| 폴리 비닐 리덴 이불화물 멤브레인 | Solarbio | ISEQ00010 | |
| QC 비즈 | NanoFCM | QS2502 | |
| RPMI-1640 기본 매체 | 생물학 산업 | ||
| 메스 | Guangzhou Kehua Trading Company | NN-0623-1 | |
| 실리카 나노구체 | NanoFCM | S16M-Exo | |
| 전사 탈색 셰이커 TS-8 | Kylin-Bell | E0018 | |
| 투과 전자 현미경 | Thermo Scientific | Talos L120C | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| TSG101 항체 | Proteintech | 28283-1-AP | |
| 핀셋 | 광저우 Lige Technology Company | LG01-105-4X |
참고문헌
- Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
- Hou, R., et al. Advances in exosome isolation methods ....
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