제브라피쉬의 심장 림프 기능 연구를 위한 심근내 주사

Summary

현재 프로토콜은 형광 마이크로스피어(MS) 및 양자점(QD)을 살아있는 물고기의 심근으로 효율적이고 안정적으로 전달하여 시간이 지남에 따라 추적(추적)할 수 있도록 합니다.

Abstract

제브라피시는 배아 후 발달 및 재생 중 심혈관 형성 및 기능을 연구하는 데 중요한 모델임이 입증되었습니다. 본 프로토콜은 제브라피시 심근에 형광 추적자를 주입하여 심장 림프관으로의 간질액 및 파편 흡수를 연구하는 방법을 설명합니다. 이를 위해 마이크로스피어(직경 200nm)와 양자점(직경 <10nm)을 살아있는 제브라피쉬의 심근에 도입하며, 이는 체외 컨포칼 현미경을 사용하여 추적할 수 있습니다. 그런 다음 이러한 추적자를 몇 시간에 걸쳐 간헐적으로 추적하여 심근에서 심장 림프관으로 들어가는 과정을 추적합니다. 양자점은 심장 림프관을 통해 심장에서 멀리 운반되는 반면, 더 큰 미세구는 3주 이상 주입 부위에 남아 있습니다. 이 심근 주사 방법은 캡슐화된 MS 또는 하이드로겔을 주입하여 세포, 단백질 또는 관심 화합물을 심장의 표적 부위에 국소적으로 방출하는 것을 포함하여 다른 용도로 확장될 수 있습니다.

Introduction

림프계는 조직과 체액의 균형을 유지하고, 부상 후 면역 반응을 조절하며, 장내 지질을 흡수하는 데 필수적입니다¹. 축적된 증거는 다양한 질병 및 발달 상황에서 림프계의 광범위한 역할을 뒷받침합니다. 그러나 기계론적 연구는 림프관을 시각화하기 어려울 수 있고 그 기능이 불확실할 수 있기 때문에 방해를 받습니다. 초기 이미징 기술은 주입된 추적자를 간질적으로 흡수한 다음 림프관 네트워크를 통해 운반하여 검출 및 시각화를 가능하게 하는 림프계의 자연적인 능력에 의존했습니다¹. 이 방법은 림프관을 시각화하는 데 사용할 수 있을 뿐만 아니라 조직에서 유체 및 거대분자를 흡수하는 능력을 정량화하는 데에도 사용할 수 있습니다.

이 광대한 림프망은 또한 심장 림프계를 포함하고 있으며, 이는 제브라피시 재생에 필수적인 역할을 하는 것으로 밝혀졌습니다 ^2,3,4. 서로 다른 종에 걸친 림프 기능의 차이점과 유사점을 이해하는 것은 이 지식을 임상적으로 활용하는 데 매우 중요합니다. 따라서 다양한 모델 유기체에서 림프 기능을 측정하고 시각화할 수 있는 기술을 탐구할 필요가 있습니다 ^5,6. 림프관은 조직에서 멀리 떨어진 한 방향으로 액체를 운반하는 뭉툭한 끝 혈관입니다⁷. 심장 조직에서 림프 배출을 관찰하기 위해 형광 염료의 심근 내 주사가 필요합니다. 심근 주사는 또한 심근 경색 후 심장 기능 개선을 테스트하기 위해 줄기 및 전구 세포 또는 하이드로겔과 같은 외인성 화합물을 이식하기 위해 임상 및 전임상 포유류 모델에서 사용되었습니다 ^8,9,10. 제브라피시 심근 주사는 자세히 설명되지 않았으며, 이로 인해 제브라피시 심장에 대한 이러한 실험적 접근 방식의 사용이 제한되었습니다.

제브라피쉬의 심낭 공간으로의 주사와 심장 내강 내의 전신 혈류는 이전에 자세히 설명되었으며^{, 11,12} 성체 제브라피쉬에서 형광 추적자의 성공적인 심근 주사가 보고되었습니다². 본 논문은 성체 제브라피쉬에서 심근 주사를 수행하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 여러 형질전환 제브라피시 계통은 림프관을 식별할 수 있습니다. 그러나 림프 배액을 이해하기 위한 접근 방식을 모색하거나 형질전환 마커가 없는 경우 림프관을 시각화할 필요가 있습니다. 여기에는 형광 추적자, 마이크로스피어(MS) 및 양자점(QD)이 사용되어 심장 림프관으로의 주입 부위와 유체 흐름을 시각화합니다. QD는 직경이 <10nm인 형광 나노결정으로, 많은 생체 의학 응용 분야에 사용할 수 있도록 광학 특성을 조정하고 조정할 수 있습니다^13,14. QD는 림프관에 의해 쉽게 흡수되지만 간간으로 주입될 경우 혈액 혈관 구조에 의해 흡수되지 않습니다^15,16. MS는 직경 약 200nm의 형광 코팅된 폴리스티렌 비드입니다¹⁵. 따라서 MS는 QD보다 훨씬 크고 심근에 주입할 때 훨씬 더 지속적이어서 주사 부위를 일관되게 식별할 수 있습니다. 이 방법은 심장 재생 중 림프 기능을 연구하는 데 유용하지만 코팅된 비드, 하이드로겔 또는 세포 제제의 안정적인 국소 도입을 사용하여 심장 생물학의 다양한 측면을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.

Protocol

모든 동물 절차는 Weill Cornell Medicine의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 2020-0027)의 승인을 받았으며 적절한 지침을 따랐습니다. 다음 실험은 성체의 경우 수정 후 14-20개월, 청소년의 경우 수정 후 35일 된 수컷 및 암컷 AB 야생형 제브라피시를 대상으로 수행되었습니다.

1. 바늘 당기기 및 시약 준비

1. 니들 풀러(그림 1A, B)를 사용하여 1.2mm OD(외경) 표준 붕규산 유리 모세관을 최적의 설정을 사용하여 두 개의 바늘로 당깁니다. 이 경우, 열 525; 65 당기기; 속도 60; 시간 250.
2. Vortex는 상업적으로 얻은 MS(물 내 1% 고형물) 및 QD(2μM, 재료 표 참조)의 스톡 콜로이드 용액.
   참고: MS 콜로이드 용액은 색상이 흰색이며 주입 시 쉽게 볼 수 있습니다.
3. 바늘 막힘을 최소화하기 위해 0.45μm 주사기 필터( 재료 표 참조)를 통해 500μL의 MS 스톡 콜로이드 용액을 필터링합니다.
4. MS만 사용하는 작업 콜로이드 용액을 준비하려면 여과된 MS 콜로이드 용액 100μL를 1x PBS(인산염 완충 식염수) 100μL로 희석합니다.
5. MS 및 QD의 작업 콜로이드 용액을 준비하려면 여과된 MS 콜로이드 용액 100μL와 QD 콜로이드 용액 100μL를 혼합합니다.
   참고: 실험에 따라 MS, QD를 혼합하거나 개별적으로 주입할 수 있습니다.
6. 그림 1D와 같이 입체경, 습식 스폰지, 미세 조작기, 주입기, 20μL 피펫, 트리카인 용액, 홍채 절제술 가위, 겸자, 당겨진 바늘, 마이크로로더 펨토팁, 회수 탱크 및 그물과 같은 필요한 시약 및 장비를 준비하고 배열합니다(재료 표 참조).
7. 인젝터 공기 공급 장치를 켜고 시간 지정 주입 펄스가 아닌 게이트 주입 펄스를 설정합니다.
   참고: 도구에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 일부 악기는 주입 페달을 악기 뒷면의 게이트 입력 포트에 삽입해야 합니다.

2. 주입 역 준비 및 얼룩말 준비

1. 해부 현미경을 켜고 초점을 조정합니다.
2. 마이크로로더 피펫 팁을 사용하여 제어 용액(예: 1x PBS의 0.05% 페놀 레드)을 로드합니다.
3. 마이크로인젝터의 바늘 홀더에 바늘을 삽입합니다.
4. 해부 현미경으로 당긴 바늘을 집게를 사용하여 끝에서 1mm 떨어진 곳으로 자릅니다.
   알림: 바늘을 가능한 한 좁게 자르는 것이 심근을 뚫는 데 가장 좋습니다. 그러나 바늘이 너무 좁으면 심장 조직을 관통하려고 할 때 구부러질 수 있습니다.
5. 적절한 사출 압력을 약 0.50kPa/7.3psi로 설정하고 균형 압력을 약 0psi로 설정하여 바늘로 액체가 수축되지 않도록 합니다(그림 1C).
6. 원하는 압력에 도달하면 주입 설정을 테스트하고 직경 1mm(<0.5μL) 미만의 광유에 용액 덩어리를 주입하는 데 걸린 시간을 기록합니다.
   참고: 이상적으로는 주입이 약 50nL/s로 유체를 방출하여 5초 내에 0.8mm의 대략적인 볼루스 직경을 제공해야 합니다. 바늘의 팁 직경에 따라 시간과 압력을 조정하여 5초 주입 동안 단일 물고기에 0.25-0.3 μL를 주입할 수 있습니다. 더 긴 주입 시간과 반대로 더 높은 주입 압력은 주입 중에 높은 간질 조직 압력을 극복할 수 있도록 하는 것이 바람직합니다.
7. 선택한 부피의 주입 용액(예: 10-15 μL, 그림 1B)을 니들에 넣고 2.5-2.6 단계를 반복합니다.
   알림: 게이트 주사를 사용하면 풋 페달을 밟고 있는 동안 주입할 수 있으므로 올바른 조직 내 주사 부위를 찾을 때까지 팁 위치를 조정할 수 있습니다.
8. 주입액이 적재된 바늘을 마이크로인젝터의 바늘 홀더에 삽입합니다.

3. 주입

1. 중간에 물고기 모양의 윤곽선을 새겨 홈이 있는 스펀지를 준비합니다.
2. 결정화 접시에 4.2mL의 스톡 용액(4mg/mL)을 100mL의 어류 시설 용수( 재료 표 참조)에 희석하여 트리카인의 작업 농도를 준비합니다.
3. 제브라피쉬를 트리카인 용액에 넣어 아가미의 움직임이 줄어들고 수영이 멈출 때까지 마취합니다.
   참고: 마취된 제브라피쉬의 반응 상실을 확인하기 위해 꼬리를 꼬집습니다.
4. 제브라피쉬의 배쪽 쪽이 대물 렌즈를 향하도록 해부 현미경 아래의 축축한 홈이 있는 스폰지에 배치합니다(그림 2A 및 그림 3A).
5. 홍채 절제술 가위를 사용하여 가슴 지느러미 높이에서 작은 가로 절단을 만들고 흉강을 엽니다(보충 비디오 1).
6. 겸자로 심낭을 부드럽게 벗겨내어 심장의 정점을 드러냅니다(그림 3B).
7. 장전된 바늘 홀더를 손에 들고 바늘을 몸체 축에 대해 <30°의 예각으로 심실 정점을 향하게 합니다.
8. 심실 깊숙이 침투하지 않도록 0.1-0.2mm 바늘을 심장에 삽입합니다(그림 2B 및 그림 3B).
   참고: 바늘 끝 부분에 혈액이 가득 차면 바늘을 약간 집어넣어 MS 및 QD가 심실 내강에 주입되지 않도록 합니다.
9. 바늘을 심장 정점에 삽입한 상태에서 바늘 끝을 심장 기저부 쪽으로 이동하면서 바늘과 신체 축 사이의 각도를 줄여 심실을 몸에서 약간 들어 올립니다(그림 2C 및 그림 3C).
   참고: 바늘은 심근벽을 통해 희미하게 보일 수 있습니다.
10. 바늘 끝이 심근 표면 쪽으로 움직이도록 바늘을 머리 쪽으로 더 밉니다.
11. 미세 주입 장치의 페달을 ~1-5초 동안 또는 심장 조직 내에 흰 점이 보일 때까지 주입합니다(그림 2C 및 그림 3C, D).
12. 주사하는 동안 흉강에 주입액이 채워지기 시작하면 바늘 끝이 심근에 완전히 침투했음을 나타냅니다(그림 2D). 조직 내에 마이크로비즈가 쌓인 것이 보일 때까지 바늘을 천천히 빼냅니다.
13. 유체가 심실 내강에 주입되고 후속 심장 박동으로 제거되는 경우 바늘 끝을 재배치합니다(그림 2E). 이러한 상황에서는 바늘 끝을 들어 올리고 주입 압력으로 인해 조직에 흰 점이 생길 때까지 바늘을 머리 방향으로 밉니다.
14. 흰색 액체나 반점이 보이지 않으면 주사 바늘이 막힌 것입니다. 이러한 상황에서는 바늘을 완전히 집어넣으십시오. 실험을 계속하려면 바늘 끝을 약간 부러뜨리거나 바늘을 교체하십시오. 두 경우 모두 심근을 재주입하기 전에 주입 흐름을 확인하십시오.
15. 성공적인 주입 후 심근에서 바늘을 부드럽게 빼내고(그림 3F) 즉시 제브라피시를 어류 시설의 물이 있는 회수 탱크로 옮깁니다.
16. 트리카인에서 완전히 회복될 때까지 물고기를 모니터링하십시오.
17. 회수된 물고기를 2.8L 수조로 옮기고 심장 추출을 위해 원하는 시점까지 물고기 시설에 놓습니다.

4. 심장 적출 및 이미징

1. 결정화 접시에 4.2mL의 스톡 용액(4mg/mL)을 100mL의 어류 시설수에 희석하여 트리카인의 작업 농도를 준비합니다.
2. 아가미의 움직임이 멈추고 반응이 없을 때까지 트리카인 용액으로 제브라피쉬를 말기 마취합니다.
3. 제브라피시를 복부 쪽이 대물 렌즈를 향하도록 배치된 해부 현미경 아래에 있는 축축한 홈이 있는 스폰지로 옮깁니다.
4. 가슴 지느러미 높이에서 홍채 절제술 가위로 가슴의 복벽을 엽니다.
5. 심낭을 열고 심장의 유출 경로를 찾습니다. 집게를 사용하여 구근 동맥(BA) 앞쪽의 대동맥을 잡고 심실 기저부로 조심스럽게 위로 당깁니다.
6. 심장의 전극을 올린 상태에서 복부 대동맥/부비동 정맥을 절단하여 심장을 분리하고 PBS가 들어 있는 35mm 페트리 접시에 넣습니다.
7. 겸자를 사용하여 혈전을 제거하고 15분 동안 4% PFA(wt/vol)로 심장을 고정합니다.
8. 사용된 형광 파장을 수집할 수 있는 현미경을 사용하여 심장을 이미지화합니다.
   참고: 예시 날짜에서는 405, 488, 567 및 647 레이저 라인이 있는 컨포칼 현미경이 사용되었습니다.
9. 이미지 분석을 위해 ImageJ/Fiji 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용합니다.
   참고: QD 또는 MS 농축 계산은 높거나 낮은 임계값 을 사용하여 수행되었으며 림프관 채널과 함께 선택 기능을 생성하여 먼저 림프관 영역과 혈관 신호가 없는 영역을 선택했습니다. 그런 다음 Measure 기능을 사용하여 두 선택의 비율을 계산한 QD 또는 MS 채널의 픽셀 강도를 측정했습니다.

Results

주사 직후에는 심근 벽의 작은 흰색 영역이 보여야 합니다(그림 3F). 이 영역에는 주입된 MS 및 QD의 밝은 형광 표지가 표시됩니다(그림 4B, E). 또한, 시술 후 심낭 공간의 QD 및 MS로부터 심장 외부 표면에 약하고 산발적인 형광 반점이 있을 수 있습니다(그림 4B, E). 주입된 트레이서는 시간이 지남에 따라 추적할 수 있습니다. 이를 위해서는 물고기를 안락사시키고 심장을 채취하여 앞서 설명한 대로 컨포칼 현미경 아래에 놓아야 합니다¹⁶.

다발성 경화증은 주사 후 1일 후에도 여전히 주사 부위에서 관찰되며, 일부는 심방 및 구근 동맥(BA)의 외부 표면에 갇혀 있습니다(

Discussion

본 논문에서는 제브라피쉬의 심근에 외인성 물질을 도입하는 방법을 설명했습니다. 이 기술은 QD와 MS를 심근에 도입하여 항상성과 재생의 림프 기능을 연구하기 위해 개발되었습니다 ^2,18. 심근경색 후 림프관의 존재와 기능을 조사하기 위해 마우스의 심근에 QD를 도입하는 데에도 유사한 접근법이 사용되었습니다^19,20.

심근에서 바늘 끝의 침투와 위치는 이 절차의 중요한 단계입니다. 유리 모세관은 조밀한 심근 조직을 관통할 수 있을 만큼 충분히 날카로워야 하며, 주사 부위를 배치할 때 심장을 들어 올리는 힘에 구부러지지 않을 만큼 단단해야 합니다. 이 두 가지 팁 속성 사이의 최적의 균형은 집게로 팁 크기를 줄이는 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
결정화 접시	VWR	89000-288
해부 스코프	Zeiss	495010-0007-000
어류 시설 물	N/A	/A	RO 물에 바다 소금과 중탄산 나트륨이 추가되어 전도도 226uS와 pH 7.35
포셉	Dumont	11252-20
유리 모세관	WPI	1B120-3	필라멘트
없음 ImageJ			https://imagej.nih.gov/ij/download.html
홍채 제거 가위	Fine Scientific Tools	15000-00
마이크로인젝터	워너 인스트루먼트	64-1735
마이크로로더 펨토팁	Eppendorf	5242 956.003
마이크로피펫 풀러	Sutter Instrument	P-97	게이트 페달 입력
마이크로스피어	Thermo Fisher Scientific	B200	블루
PBS	Corning	46-013-CM
양자 점 (QD)	Thermo Fisher Scientific	Q21061MP	Qtracker705 혈관 라벨
스폰지		임의의	(1.5 × 5 × 3cm) (0.5 × 2.5 cm)
주사기 필터	Corning	431220
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040	농도 : 4 mg / mL