Method Article

제브라피쉬의 심장 림프 기능 연구를 위한 심근내 주사

DOI:

10.3791/64504

⸱

September 20th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Research Institute, Weill Cornell Medicine, 2Department of Cell and Developmental Biology, Weill Cornell Medicine, 3The Saban Research Institute and Heart Institute, Children's Hospital Los Angeles

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

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현재 프로토콜은 형광 마이크로스피어(MS) 및 양자점(QD)을 살아있는 물고기의 심근으로 효율적이고 안정적으로 전달하여 시간이 지남에 따라 추적(추적)할 수 있도록 합니다.

Abstract

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제브라피시는 배아 후 발달 및 재생 중 심혈관 형성 및 기능을 연구하는 데 중요한 모델임이 입증되었습니다. 본 프로토콜은 제브라피시 심근에 형광 추적자를 주입하여 심장 림프관으로의 간질액 및 파편 흡수를 연구하는 방법을 설명합니다. 이를 위해 마이크로스피어(직경 200nm)와 양자점(직경 <10nm)을 살아있는 제브라피쉬의 심근에 도입하며, 이는 체외 컨포칼 현미경을 사용하여 추적할 수 있습니다. 그런 다음 이러한 추적자를 몇 시간에 걸쳐 간헐적으로 추적하여 심근에서 심장 림프관으로 들어가는 과정을 추적합니다. 양자점은 심장 림프관을 통해 심장에서 멀리 운반되는 반면, 더 큰 미세구는 3주 이상 주입 부위에 남아 있습니다. 이 심근 주사 방법은 캡슐화된 MS 또는 하이드로겔을 주입하여 세포, 단백질 또는 관심 화합물을 심장의 표적 부위에 국소적으로 방출하는 것을 포함하여 다른 용도로 확장될 수 있습니다.

Introduction

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림프계는 조직과 체액의 균형을 유지하고, 부상 후 면역 반응을 조절하며, 장내 지질을 흡수하는 데 필수적입니다1. 축적된 증거는 다양한 질병 및 발달 상황에서 림프계의 광범위한 역할을 뒷받침합니다. 그러나 기계론적 연구는 림프관을 시각화하기 어려울 수 있고 그 기능이 불확실할 수 있기 때문에 방해를 받습니다. 초기 이미징 기술은 주입된 추적자를 간질적으로 흡수한 다음 림프관 네트워크를 통해 운반하여 검출 및 시각화를 가능하게 하는 림프계의 자연적인 능력에 의존했습니다1. 이 방법은 림프관을 시각화하는 데 사용할 수 있을 뿐만 아니라 조직에서 유체 및 거대분자를 흡수하는 능력을 정량화하는 데에도 사용할 수 있습니다.

이 광대한 림프망은 또한 심장 림프계를 포함하고 있으며, 이는 제브라피시 재생에 필수적인 역할을 하는 것으로 밝혀졌습니다 2,3,4. 서로 다른 종에 걸친 림프 기능의 차이점과 유사점을 이해하는 것은 이 지식을 임상적으로 ....

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Protocol

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모든 동물 절차는 Weill Cornell Medicine의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 2020-0027)의 승인을 받았으며 적절한 지침을 따랐습니다. 다음 실험은 성체의 경우 수정 후 14-20개월, 청소년의 경우 수정 후 35일 된 수컷 및 암컷 AB 야생형 제브라피시를 대상으로 수행되었습니다.

1. 바늘 당기기 및 시약 준비

  1. 니들 풀러(그림 1A, B)를 사용하여 1.2mm OD(외경) 표준 붕규산 유리 모세관을 최적의 설정을 사용하여 두 개의 바늘로 당깁니다. 이 경우, 열 525; 65 당기기; 속도 60; 시간 250.
  2. Vortex는 상업적으로 얻은 MS(물 내 1% 고형물) 및 QD(2μM, 재료 표 참조)의 스톡 콜로이드 용액.
    참고: MS 콜로이드 용액은 색상이 흰색이며 주입 시 쉽게 볼 수 있습니다.
  3. 바늘 막힘을 최소화하기 위해 0.45μm 주사기 필터( 재료 표 참조)를....

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Results

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주사 직후에는 심근 벽의 작은 흰색 영역이 보여야 합니다(그림 3F). 이 영역에는 주입된 MS 및 QD의 밝은 형광 표지가 표시됩니다(그림 4B, E). 또한, 시술 후 심낭 공간의 QD 및 MS로부터 심장 외부 표면에 약하고 산발적인 형광 반점이 있을 수 있습니다(그림 4B, E). 주입된 트레이서는 시간이 지남에 따라 추적할 수 있습니다. 이를 위해서는 물고기를 안락사시키고 심장을 채취하여 앞서 설명한 대로 컨포칼 현미경 아래에 놓아야 합니다16.

다발성 경화증은 주사 후 1일 후에도 여전히 주사 부위에서 관찰되며, 일부는 심방 및 구근 동맥(BA)의 외부 표면에 갇혀 있습니다(

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Discussion

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본 논문에서는 제브라피쉬의 심근에 외인성 물질을 도입하는 방법을 설명했습니다. 이 기술은 QD와 MS를 심근에 도입하여 항상성과 재생의 림프 기능을 연구하기 위해 개발되었습니다 2,18. 심근경색 후 림프관의 존재와 기능을 조사하기 위해 마우스의 심근에 QD를 도입하는 데에도 유사한 접근법이 사용되었습니다19,20.

심근에서 바늘 끝의 침투와 위치는 이 절차의 중요한 단계입니다. 유리 모세관은 조밀한 심근 조직을 관통할 수 있을 만큼 충분히 날카로워야 하며, 주사 부위를 배치할 때 심장을 들어 올리는 힘에 구부러지지 않을 만큼 단단해야 합니다. 이 두 가지 팁 속성 사이의 최적의 균형은 집게로 팁 크기를 줄이는 .......

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Disclosures

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저자는 공개할 내용이 없습니다.

Acknowledgements

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물고기를 돌봐준 Adedeji Afolalu, Chaim Shapiro, Soji Hosten, Chelsea Quaies(Weill Cornell Medicine)와 원고를 비판적으로 읽어준 Caroline Pearson(Weill Cornell Medicine)에게 감사의 뜻을 전합니다. Jingli Cao (Weill Cornell Medicine)는 해부 내시경과 카메라를 사용하여 원고를 비판적으로 읽는 것 외에도 수술 과정을 기록했습니다. 형질전환 제브라피시 라인을 위한 Nathan Lawson(매사추세츠 대학교 의과대학), Brant Weinstein(NICHD), Elke Ober(코펜하겐 대학교) 및 Stephan Schulte-Merker(WWU Münster). QD 및 이미징에 대한 자문을 제공해 주신 Daniel Castranova (NICHD)와 내시경 비디오 캡처 해부에 대한 지침을 제공해 주신 Yu Xia (Weill Cornell Medicine). 이 작업은 NM에 대한 NYSTEM 펠로우십, 미국 심장 협회 경력 개발상(AHA941434), 미국 국립보건원(NIH) 보조금(R01NS126209) 및 MH에 대한 Weill Cornell Medicine Startup Fund의 지원을 받았습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
결정화 접시VWR89000-288
해부 스코프Zeiss495010-0007-000
어류 시설 물N/A/ARO 물에 바다 소금과 중탄산 나트륨이 추가되어 전도도 226uS와 pH 7.35
포셉Dumont11252-20
유리 모세관 WPI1B120-3필라멘트
없음 ImageJhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
홍채 제거 가위Fine Scientific Tools15000-00
마이크로인젝터워너 인스트루먼트64-1735
마이크로로더 펨토팁Eppendorf5242 956.003
마이크로피펫 풀러 Sutter InstrumentP-97게이트 페달 입력
마이크로스피어Thermo Fisher ScientificB200블루
PBSCorning46-013-CM
양자 점 (QD)Thermo Fisher ScientificQ21061MPQtracker705 혈관 라벨
스폰지 임의의(1.5 × 5 × 3cm) (0.5 × 2.5 cm)
주사기 필터Corning431220
TricaineSigma-AldrichA5040농도 : 4 mg / mL
N스 홈이있는

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Munn, L. L., Padera, T. P. Imaging the lymphatic system. Microvascular Research. 0, 55(2014).
  2. Harrison, M. R., et al. Late developing cardiac lymphatic vasculature supports adult zebrafish heart function and regeneration. eLife. 8, 42762(2019).<....

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Intramyocardial InjectionCardiac Lymphatic FunctionZebrafish ModelFluorescent TracersMyocardial InjectionConfocal MicroscopyQuantum DotsMicrosphere TrackingCardiac RegenerationInterstitial Fluid Uptake
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