이 작업에서는 재조합 G 단백질 결합 수용체(GPCR)에서 소분자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 384웰 플레이트에 대한 고처리량 세포 내 칼슘 형광 분석에 대해 설명합니다. 표적, 소열 진드기, Rhipicephalus microplus 의 키닌 수용체는 CHO-K1 세포에서 발현됩니다. 이 분석은 하나의 "이중 첨가" 분석에서 동일한 세포를 사용하여 작용제와 길항제를 식별합니다.
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이 논문에서
요약
초록
G 단백질 결합 수용체 (GPCR)는 수용체의 가장 큰 수퍼 패밀리를 나타내며 수많은 인간 약물의 표적입니다. GPCR에 대한 무작위 소분자 라이브러리의 고처리량 스크리닝(HTS)은 제약 산업에서 표적별 약물 발견을 위해 사용됩니다. 이 연구에서는 치명적인 인간 및 수의학 병원체 벡터의 생리학적 연구를 위한 프로브로서 무척추동물 특이적 신경펩티드 GPCR의 새로운 소분자 리간드를 식별하기 위해 HTS를 사용했습니다.
무척추 동물 특이 적 키닌 수용체는 이뇨, 수유 및 소화를 포함하여 무척추 동물의 많은 중요한 생리적 과정을 조절하기 때문에 표적으로 선택되었습니다. 또한, 많은 무척추 동물 GPCR의 약리학은 특성이 좋지 않거나 전혀 특성화되지 않습니다. 따라서 다른 후생 동물, 특히 인간의 관련 GPCR과 관련하여 이러한 수용체 그룹의 차별적 약리학은 수퍼 패밀리로서 GPCR의 구조-활성 관계에 지식을 추가합니다. HTS 분석은 소열 진드기 또는 남부 소 진드기 인 Rhipicephalus microplus에서 키닌 수용체의 리간드를 발견하기 위해 384 웰 플레이트의 세포에 대해 개발되었습니다. 틱 키닌 수용체는 CHO-K1 세포에서 안정적으로 발현되었다.
키닌 수용체는 내인성 키닌 신경 펩티드 또는 다른 소분자 작용제에 의해 활성화 될 때 칼슘 저장소에서 세포질로의Ca 2+ 방출을 유발합니다. "이중 첨가" 접근법과 결합된 이 칼슘 형광 분석은 동일한 분석 플레이트에서 기능성 작용제와 길항제 "적중" 분자를 검출할 수 있습니다. 각각의 분석은 320개의 무작위 소분자의 어레이를 운반하는 약물 플레이트를 사용하여 수행되었다. 0.7의 신뢰할 수 있는 Z' 계수가 얻어졌고, HTS가 2μM 최종 농도일 때 3개의 작용제 및 2개의 길항제 히트 분자가 확인되었습니다. 여기에 보고된 칼슘 형광 분석은Ca2+ 신호전달 캐스케이드를 활성화하는 다른 GPCR을 스크리닝하도록 조정할 수 있습니다.
서론
효모에서 인간으로 존재하는 G 단백질 결합 수용체 (GPCR)는 많은 유기체에서 수용체의 가장 큰 수퍼 패밀리를 나타냅니다1. 그들은 동물의 거의 모든 생물학적 과정을 조절하는 데 중요한 역할을합니다. 절지동물의 게놈에는 50-200개의 GPCR이 있으며, 이는 그들이 가장 큰 막 수용체 수퍼패밀리2를 대표한다는 것을 의미합니다. 이들은 서열 유사성과 기능에 따라 6개의 주요 클래스인 AF로 분류됩니다3. GPCR은 호르몬, 신경 펩티드, 생체 아민, 글루타메이트, 양성자, 지방 당 단백질 및 광자4와 같은 다양한 세포 외 신호를 전달합니다. GPCR은 이종 삼량체 G 단백질 (Gα, Gβ 및 Gγ)에 결합하여 다운 스트림 신호를 전송합니다. Gαs 또는 Gαi/o 단백질에 결합된 GPCRs는 각각 아데닐릴 사이클라제를 활성화 또는 억제함으로써 세포내 3',5'-사이클릭 아데노신 모노포스페이트 (cAMP) 수준을 증가 또는 감소시킨다. Gαq/11에 결합된 GPCR은 포스포리파아제 C(PLC)-이노시톨-1,4,5-삼인산(IP3) 경로를 활성화하....
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프로토콜
1. 세포 유지 관리
참고: R. 마이크로플러스의 키닌 수용체를 안정적으로 발현하는 CHO-K1 세포주(BMLK3)는 Holmes et al.16에 의해 개발되었습니다. 세포주의 발달에 대한 세부사항은 다른 곳에 제시되어 있다14. 다음 모든 단계는 클래스 II 생물 안전 캐비닛의 멸균 조건에서 수행됩니다.
- 표적 수용체의 발현을 보장하기 위해 선택적 배지(10% 소 태아 혈청[FBS] 및 800μg/mL G418 황산염을 포함하는 F-12K 배지)에서 재조합 세포주를 성장시킵니다. 수용체를 안정적으로 발현하는 세포를 1mL의 냉동 배지(90% FBS 및 10% 디메틸설폭사이드[DMSO])에 -80°C 냉동고의 2mL 극저온에 보관합니다.
알림: 냉동 세포를 장기간 보관하려면 액체 질소에 보관하십시오. - 세포 배양 전에 모든 배지를 예열합니다. 생물안전 캐비닛에서 예열된 선택 배지 13mL(10% FBS 및 800μg/mL G418 황산염을 포함하는 F-12K 배지)를 T-75 플라스크에 옮기고 생물안전 캐비닛에 보관합니다. 동결된 BMLK 3 세포(~1.....
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결과
320개의 무작위 소분자로 구성된 사내 약물 플레이트(SAC2-34-6170)를 예로 이 HTS 분석을 시연하는 데 사용했습니다. HTS는 Z' 계수가 0.7인 우수한 분석 품질을 가졌습니다(표 1). 이 Z' 인자는 시험된 화합물34와 무관한 분석 품질을 반영한다. 0.5 이상의 Z' 계수는 양성 대조군과 음성 대조군의 RFU 사이의 양호한 분석 신호 동적 범위를 나타냅니다. Z' 계수가 0.5 미만인 분석은 최적이 아닌 신호 동적 범위를 가지며 일반적으로 적중 선택에 대한 정보가 아니므로 폐기됩니다. 양성 대조군(64개의 양성 대조군 반응의 평균 RFU,μ c+ = 130,139)의 반응(상대 형광 단위, RFU로 측정)은 음성 대조군(64개의 음성 대조군 반응의 평균 RFU, μc-= 6,675)보다 평균 19배 높았습니다. 여기에서 "작용제 히트"를 선택하기 위한 컷오프 .......
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토론
HTS의 목표는 대량의 소분자를 스크리닝하여 적중 분자를 식별하는 것입니다. 따라서 이 예제의 결과는 기존 HTS 실험의 작은 부분만을 나타냅니다. 또한, 확인된 적중 분자는 동일한 재조합 세포주 및 빈 벡터만 운반하는 CHO-K1 세포주에 대한 용량 의존적 분석과 같은 다운스트림 분석에서 검증되어야 하며, 이는 소분자를 저장하기 위해 동시에 수행할 수 있습니다. 세포독성 분석은 제2 첨가에서의 반응의 부족이 세포 사멸로 인한 것이 아님을 입증하는 데 도움이 될 것이다. 다른 생물학적 분석은 시험관 내에서 분리된 조직에서의 활성을 검증하기 위해, 또는 살아있는 절지동물에 소분자를 적용하거나 공급함으로써 수행되어야 한다. 진드기 키닌 수용체의 소분자 리간드 확인의 전체 파이프라인은 이전 간행물31에서 찾을 수 있습니다. 이 파이프 라인을 통해 틱 키닌 수용체의 총 36 개의 길항제 히트가 확인되었습니다. 이들 길항제 중 3 개는 조직 수축 억제 분석에서 추가로 시험되었고,.......
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 USDA-NIFA-AFRI 동물 건강 및 웰빙 상 (수상 번호 2022-67015-36336, PVP [프로젝트 디렉터])과 텍사스 A & M AgriLife 연구 곤충 벡터 질병 보조금 프로그램 (FY'22-23)의 경쟁 기금에서 P.V.P.로 지원되었습니다. 농업 생명 과학 대학 TAMU의 A.W.E.S.O.M.E. 교수 그룹은 원고 편집에 도움을 준 것으로 인정 받았습니다. 보충 표 S2 에는 텍사스 A&M 대학과 텍사스 A&M AgriLife Research의 James Sacchettini 박사 실험실에서 얻은 사내 무작위 소분자 라이브러리의 데이터가 포함되어 있습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 트립신-EDTA | Gibco Invitrogen | 15050-065 | with phenol red |
| 0.4% trypan blue | MilliporeSigma | T8154 | 액체, 멸균 |
| 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브 | Thermo Fisher | AM12400 | RNase-free Microfuge Tubes |
| 5 mL 혈청학 피펫 | Corning | 29443-045 | Corning Costar Stripette 개별 포장 |
| 10 mL 혈청학 피펫 | Corning | 29443-047 | Corning Costar 스트라이프 개별 포장 |
| 15mL 원추형 튜브 | Falcon | 352196 | sterile |
| 20 µ L 필터 팁 | 미국 Scientifc Inc. | P1121 | 멸균, 장벽 |
| 25 mL 혈청학 피펫 | Corning | 29443-049 | Corning Costar Stripette 개별 포장 |
| 50 mL 원뿔형 튜브 | Corning | 430828 | 눈금, 멸균 |
| 150 mL 자동 친화적 예비 | Integra Bioscience | 6317 | 멸균, 1일차에 세포 파종을 위해 개별 포장 |
| 150 mL 자동 친화성 예비 | Integra Bioscience | 6318 | 멸균, 적층형, 2일차에 염료 로딩 |
| 384/ 12.5 µ L 저보유 팁 | Integra Bioscience | 6405 | 긴, 멸균 필터 |
| 384/ 12.5 &마이크로; L 팁 | Integra Bioscience | 6404 | 긴, 멸균 필터 |
| 384-웰 플레이트 | Greiner | 781091 | CELLSTAR, 투명 폴리스티렌, &마이크로; 투명, 블랙/플랫 |
| 알루미늄 플레이트 씰 | Axygen Scientific | PCR-AS-200 | 폴리에스터 기반 |
| 알루미늄 호일 랩 | Walmart | ||
| Biosafty 캐비닛 II | NuAire | NU-540-300 | |
| 셀 카운터 | Nexcelom | AutoT4 | |
| 셀 카운팅 슬라이드 | Nexcelom | SD-100 | 20 &마이크로; L 챔버 |
| CO2 가습 인큐베이터 | Thermo Fisher | Forma Series II | |
| 데스크 램프 | SunvaleeyTEK | RS1000B | |
| Dimethyl sulfoxide | MilliporeSigma | 276855 | 무수성, >99.9% |
| 약물 플레이트 | Corning | 3680 | |
| Dulbecco의 인산염 완충 식염수 | Corning | 21-031- CV | DPBS, 칼슘 및 마그네슘 |
| 없이 1x 에탄올 | Koptec | 2000 | |
| F-12K 영양 혼합물 | Corning | 45000-354 | (Kaighn's Mod.) with L-glutamine |
| Fetal bovine serum | Equitech-Bio | SFBU30 | |
| 형광 칼슘 분석 키트 | ENZO Lifescience | ENZ-51017 | 10x96 테스트 |
| G418 황산염 | Gibco Invitrogen | 10131-027 | Geneticin 선택적 항생제 50mg/mL |
| Hank's buffer | MilliporeSigma | 55037C | HBSS 수정, 칼슘 포함, 마그네슘 포함, 페놀 없이 |
| HEPES 버퍼 | Gibco Invitrogen | 15630-080 | 1 몰 |
| HTS 데이터 저장 플레이트폼 | CDD 금고 | https://www.collaborativedrug.com/ | |
| Liquid 취급 체계 | Integra Bioscience | Viaflo | 384/12.5 µ L |
| 플레이트 원심 분리기 | Thermo Fisher | Sorvall ST8 | |
| 플레이트 리더 | BMG 기술 | Clariostar | |
| Poly-D-lysine | MilliporeSigma | P6407 | |
| Rhimi-K-1 작용제 펩타이드 | Genscript | 사용자 정의 주문 | QFSPWGamide |
| T-75 플라스크 | Falcon | 353136 |
참고문헌
- Hanlon, C. D., Andrew, D. J. Outside-in signaling - A brief review of GPCR signaling with a focus on the Drosophila GPCR family. Journal of Cell Science. 128 (19), 3533-3542 (2015).
- Liu, N., Li, T., Wang, Y., Liu, S.
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재인쇄 및 허가
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