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방법 논문

Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells에서 망막 오가노이드 생성

4.7K 조회수

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DOI:

10.3791/64509

⸱

2022년 12월 9일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Ocular Regeneration, Prof. Brien Holden Eye Research Centre, LV Prasad Eye Institute, 2Manipal Academy of Higher Education, 3Schepens Eye Research Institute, Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 hiPSC를 안구 클러스터로 분화하고 부착 및 현탁 배양 시스템을 모두 포함하는 단순화된 배양 조건을 사용하여 신경-망막 오가노이드를 생성하는 효율적인 방법을 설명합니다. RPE 및 각막 상피와 같은 다른 안구 세포 유형도 망막 배양의 성숙한 안구에서 분리할 수 있습니다.

초록

만능 줄기 세포는 체외 질병 모델링 연구 및 재생 요법 개발에 유용한 복잡한 조직 오가노이드를 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜은 망막 분화의 처음 4주 동안 뚜렷하고 자가 조직화된 안구 필드 원시 클러스터(EFP)가 출현할 때까지 부착성 단층 배양으로 구성된 하이브리드 배양 시스템에서 망막 오가노이드를 생성하는 더 간단하고 강력하며 단계적인 방법을 설명합니다. 또한, 각 EFP 내의 도넛 모양, 원형 및 반투명 신경-망막 섬을 수동으로 채취하여 망막 분화 배지에서 1-2주 동안 비부착성 배양 접시를 사용하여 현탁액 하에서 배양하여 다층 3D 광학 컵(OC-1M)을 생성합니다. 이 미성숙 망막 오가노이드는 PAX6+ 및 ChX10+ 증식, 다능성 망막 전구체를 함유하고 있습니다. 전구체 세포는 오가노이드 내에서 선형적으로 자가 조립되며 뚜렷한 방사형 줄무늬로 나타납니다. 현탁 배양 후 4주에 망막 전구체는 유사분열 후 정지 및 계통 분화를 거쳐 성숙한 망막 오가노이드(OC-2M)를 형성합니다. 광수용체 계통 커밋된 전구체는 망막 오가노이드의 가장 바깥쪽 층 내에서 발생합니다. 이러한 CRX+ 및 RCVRN+ 광수용체 세포는 형태학적으로 성숙하여 내부 세그먼트와 같은 확장을 표시합니다. 이 방법은 인간 배아 줄기 세포(hESC)와 유도만능 줄기 세포(iPSC)를 사용하여 망막 오가노이드를 생성하는 데 채택할 수 있습니다. 모든 단계와 절차는 복제 가능성을 보장하고 기초 과학 및 중개 연구에서 더 넓은 응용 분야를 위해 명확하게 설명되고 시연됩니다.

서론

망막은 척추동물의 눈 뒤쪽에 존재하는 빛에 민감한 조직으로, 광전달 경로로 알려진 생화학적 현상에 의해 빛 신호를 신경 자극으로 변환합니다. 망막의 광수용체 세포에서 생성된 초기 신경 자극은 다른 망막 중간 뉴런과 망막 신경절 세포(RGC)로 변환되어 뇌의 시각 피질에 도달하여 이미지 인식 및 시각 반응을 돕습니다.

세계보건기구(WHO)에 따르면 약 150만 명의 어린이가 맹인이며 그 중 100만 명이 아시아에 있습니다. 유전성 망막 이영양증(Inherited Retinal Dystrophy, IRD)은 전 세계 인구 4,000명 중 1명에게 영향을 미치는 주요 실명 질환이며1,2,3, 개발도상국에서는 연령 관련 황반변성(AMD)과 관련된 실명 유병률이 0.6%-1.1%에 이른다4. IRD는 망막 발달 및 기능에 관여하는 300개 이상의 서로 다른 유전자의 유전적 결함에 의해 발생한다5. 이러한 유전적 변화는 정상적인 망막 기능의 파괴와 망막 세포, 즉 광수용체 세포와 망막 색소 상피(RPE)의 점진적인 퇴행을 초래하여 심각한 시력 상실 및 실명을 초래합니다. 각막, 수정체 등과 관련된 다른 실명 상태에서 엄청난 진전이 이루어졌습니다. 그러나 망막 이영양증과 시신경 위축은 현재까지 입증된 치료법이 없습니다. 성체 인간 망막에는 줄기세포가 없기 때문에6, 배아줄기세포(ESC)와 환자 유래 유도만능줄기세포(iPSC)와 같은 대체 공급원은 원하는 세포 유형을 무제한으로 공급할 수 있으며, 체외 질환 모델링 연구 및 재생 요법 개발에 필요한 복잡한 조직 오가노이드 개발에 큰 가능성을 지니고 있다7. 8,9,10.

수년간의 망막 연구를 통해 초기 망막 발달을 조율하는 분자 사건에 대한 더 나은 이해가 이루어졌습니다. PSC에서 망막 세포와 3D 오가노이드를 생성하는 대부분의 프로토콜은 알려진 생물학적 과정을 단계적으로 조절하기 위해 성장 인자와 소분자의 복잡한 칵테일에서 세포를 배양함으로써 시험관 내에서 이러한 발달 사건을 요약하는 것을 목표로 합니다. 이렇게 생성된 망막 오가노이드는 망막 신경절 세포(RGC), 중간 뉴런, 광수용체 및 망막 색소 상피(RPE)와 같은 주요 망막 세포로 구성됩니다.11,12,13,14,15,16,17,18,19. 망막 오가노이드를 사용하여 IRD를 모델링하려는 성공적인 시도에도 불구하고, 분화 중 성장 인자와 소분자의 복잡한 칵테일에 대한 요구 사항과 망막 오가노이드 생성의 상대적으로 낮은 효율은 대부분의 프로토콜에서 주요 과제를 제기합니다. 그들은 주로 배아체의 형성을 포함하고, 시험관 내 발달의 여러 단계에서 복잡한 배양 조건을 사용하여 망막 계통으로의 단계적 분화를 포함합니다20,21,22.

여기에서는 건강한 대조군 및 망막 질환 특이적 hiPSC에서 복잡한 3D 신경-망막 오가노이드를 개발하는 간단하고 강력한 방법이 보고되었습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 배아체 형성 없이 거의 합류에 가까운 hiPSC 배양의 직접적인 분화를 활용합니다. 또한 배양 배지의 복잡성이 단순화되어 새로운 연구자들이 쉽게 채택할 수 있는 비용 효율적이고 재현 가능한 기술입니다. 여기에는 망막 분화의 처음 4주 동안 뚜렷하고 자기 조직화된 안구 필드 원시 클러스터(EFP)가 출현할 때까지 부착성 단층 배양으로 구성된 하이브리드 배양 시스템이 포함됩니다. 또한, 각 EFP 내의 원형 신경-망막 섬을 수동으로 채취하여 1-2주 동안 현탁 배양에서 성장시켜 PAX6+ 및 CHX10+ 증식 신경-망막 전구체로 구성된 다층 3D 망막 컵 또는 오가노이드를 준비합니다. 100μM 타우린 함유 배지에서 추가로 4주 동안 망막 오가노이드를 장기간 배양한 결과 RCVRN+ 및 CRX+ 광수용체 전구체와 기본적인 내부 세그먼트 유사 확장을 가진 성숙 세포가 출현했습니다.

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프로토콜

hiPSC와 관련된 모든 실험은 표준 실험실 관행, 윤리 및 생물 안전 지침을 준수하고 기관 윤리 위원회(IEC), 줄기 세포 연구를 위한 기관 위원회(IC-SCR) 및 기관 생물 안전 위원회(IBSC)와 같은 규제 기관의 승인을 받아 무균적으로 수행되었습니다.

1. iPSC 배양액과 망막 분화 배지 및 시약의 제조

  1. iPSC 배양 및 유지 배지
    1. 배양 및 정상 hiPSC 라인23 (hiPSC-F2-3F1) 및 CRISPR 편집된, RB1-/- hiPSC 라인 (LVIP15-RB1-CS3, 인간 RB1 유전자의 엑손 18 내에서 이중대립유전자, 프레임시프트 결실 10 bp)을 피더-없는 배양 조건 하에서 마트리겔 코팅 (basement membrane matrix coated; Table of Materials) 배양 플레이트 상에서 유지하였다.
      참고: 이 프로토콜은 기저막 매트릭스를 재조합 비트로넥틴(VTN-N) 코팅으로 교체하여 완전히 이종-제로 만들 수 있습니다. 50x Essential 8 보충제(Essential 8 배지 키트와 함께 제공됨, 재료 표 참조)와 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 용액을 추가하여 완전한 Essential 8 배지를 준비합니다. 대안적으로, hiPSC는 완전한 mTeSR1 배지를 사용하여 배양될 수도 있다.
  2. 세포 해리 용액(1x CDS)
    1. 인간 iPSC의 효소 없는 해리 및 계대시징을 위해 1x Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)에 0.5mM EDTA, pH 8.0 및 30mM NaCl을 포함하는 CDS를 준비합니다( 재료 표 참조).
    2. 1x CDS 100mL를 준비하려면 1x DPBS 99mL에 0.5M EDTA 100μL와 3M NaCl 원액 1mL를 넣고 잘 섞은 다음 0.22μm 필터를 사용하여 여과 멸균합니다.
  3. 분화 유도 매체(DIM)
    1. 10% 녹아웃 혈청 대체물(KOSR), 1x 비필수 아미노산(NEAA), 2mM GlutaMax, 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신, 200μM L-아스코르브산 및 1% N2 보충제가 보충된 DMEM-F12 기본 배지를 사용하여 DIM을 준비합니다( 재료 표 참조).
  4. 망막 분화 배지(RDM)
    1. 10% 녹아웃 세럼(KOSR), 1x 비필수 아미노산(NEAA), 2mM GlutaMax, 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신, 200μM L-아스코르브산 및 2% B27 보충제(비타민 A 포함)가 보충된 DMEM-F12 기본 배지를 사용하여 RDM을 준비합니다( 재료 표 참조).
  5. 세포외 기질 코팅된 세포 배양 표면
    1. hESC 인증 기저막 매트릭스를 얼음 양동이, 바람직하게는 4-8°C의 냉장고 내부에서 밤새 해동합니다. 해동된 100x 매트릭스 스톡(5mL)을 얼음처럼 차가운 DMEM-F20 기본 배지 20mL를 첨가하여 1:5의 비율로 희석하고 부드럽게 소용돌이치며 혼합하여 20x 스톡 용액을 제조합니다.
      1. 미리 냉각된 피펫 팁과 멸균 미세 원심분리기 튜브를 사용하여 얼음 위에 0.5mL 분취량을 준비합니다. 바이알에 20x 스톡으로 라벨을 붙이고 -80°C 냉동고에서 최대 6개월 동안 냉동 보관합니다.
    2. 세포 배양 표면(배양 접시 또는 6웰 플레이트)을 코팅하기 위해 20x 매트릭스의 분취량을 얼음 위에서 해동하고 얼음처럼 차가운 DMEM-F12 기본 배지를 사용하여 1:20의 비율로 희석하여 100mm 접시 또는 6웰 플레이트(1.5mL/웰)를 코팅하기에 충분한 1x 매트릭스 코팅 용액 10mL를 준비합니다.
      알림: 매트릭스 용액을 취급하기 전에 얼음처럼 차갑고 멸균된 DPBS를 흡인하여 피펫/마이크로팁을 미리 냉각하십시오. 매트릭스의 해동 및 모든 취급은 실온에서 중합 및 겔화를 방지하기 위해 사전 냉각된 피펫/마이크로팁을 사용하여 얼음 위에서 이루어져야 합니다.
    3. 1.5 mL의 1x 매트릭스 코팅 용액을 6-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 균일한 코팅을 보장하기 위해 플레이트를 부드럽게 소용돌이치게 하고, 플레이트를 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 인큐베이션한다. 배양 표면에 매트릭스가 균일하게 코팅되도록 플레이트를 최소 1시간 동안 그대로 두십시오.
    4. 세포를 파종하기 전에 5mL 멸균 피펫을 사용하여 코팅 용액을 흡인하고 액체 폐기물을 버립니다. 즉시 새로운 배양 배지(6웰 플레이트의 2mL/웰)를 추가하고 150,000-200,000 세포/웰의 밀도로 세포를 시딩합니다. 취급 중에 플레이트를 건조시키지 마십시오.
      참고: 또는 최종 농도 0.5μg/mL의 재조합 비트로넥틴(VTN-N) 코팅을 무이종 배양 프로토콜에 사용할 수 있습니다.

2. 인간 iPSC 배양 확립

  1. hiPSC의 해동 및 부활
    1. 6웰 플레이트의 웰 하나를 1x 멤브레인 매트릭스 용액으로 코팅합니다. 배양 표면의 중합 및 균일한 코팅을 허용하기 위해 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
    2. 1시간 배양 후, 코팅 용액을 제거하고 세포를 소생시키기 전에 10μM의 Rho-키나제 억제제 Y-27632(10mM 스톡의 1μL/mL, 재료 표 참조)를 함유하는 예열된 완전 필수 8 배지 1mL를 추가합니다.
    3. 액체 질소 용기에서 hiPSC 극저온 스톡(1 x 106 cells/vial)을 제거합니다. 37°C 수조에서 부드럽게 소용돌이치면서 극저온 제품을 빠르게 해동합니다.
      알림: 바이알을 완전히 해동하지 마십시오. 통과 번호를 기록하고 바이알을 표면 멸균한 다음 70% 이소프로필 알코올이 함유된 보푸라기가 없는 면봉을 사용하여 물기를 닦아냅니다.
    4. 멸균된 1mL 피펫 팁을 사용하여 Y-27632가 없는 2mL의 예열된 완전 Essential 8 배지로 구성된 신선한 15mL 튜브에 극저온 내용물을 흡인합니다. 튜브를 실온에서 4분 동안 1,000 x g 로 원심분리합니다. 상청액을 버리십시오.
    5. 10μM Y-27632를 포함하는 완전한 Essential 8 배지 1.0mL에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
    6. 이 세포 현탁액을 벽을 따라 분배하여 매트릭스를 방해하지 않고 매트릭스 코팅 표면에 추가합니다. 세포의 균일한 분포를 보장하기 위해 플레이트를 십자형으로 부드럽게 흔듭니다.
    7. 플레이트를 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 인큐베이션하여 세포가 부착되고 증식을 시작할 수 있도록 합니다.
    8. 12-24시간 후, 사용한 배지를 교체하고 Y-27632가 없는 예열된 완전 에센셜 8 배지에서 배양물을 유지합니다.
    9. 24시간마다 배양 배지를 교체하고 70%-80% 합류점에 도달하면 배양을 계대시킵니다.
      참고: hiPSC 배양에 대해 1:6의 분할 비율을 일상적으로 따르며 3-4일의 일정한 간격으로 계대합니다.
  2. 망막 계통 분화를 시작하기 위한 hiPSC의 계대배양 및 도금
    1. 6웰 플레이트에서 70%-80% 융합 인간 iPSC 배양에서 사용한 배지를 흡인합니다.
    2. 1mL의 CDS(단계 1.2)를 각 웰에 넣고 세포가 둥글게 될 때까지 37°C에서 5-7분 동안 배양합니다. 세포가 분리되지 않도록 주의하면서 CDS를 조심스럽게 제거하고 신선한 Essential 8 배지 2mL를 추가하고 피펫을 사용하여 부드럽게 분쇄합니다.
    3. 6-세포 플레이트의 한 웰에서 15mL 원심분리기 튜브로 세포 현탁액을 수집하고 실온에서 4분 동안 1,000 x g 로 튜브를 회전시킵니다. 상청액을 버리십시오.
    4. 1.2mL의 Essential 8 배지에 세포 펠릿을 재현탁하고 200μL의 세포 현탁액(1:6 분할 비율)의 세포 200μL를 1.5μM Y-27632가 포함된 1.5mL의 iPSC 배양 배지가 포함된 매트릭스 코팅된 6웰 플레이트의 각 웰에 분주합니다.
    5. 12-24시간 후, 사용한 배지를 교체하고 Y-27632가 없는 예열된 완전 에센셜 8 배지에서 배양물을 유지합니다.
    6. 배양이 70%-80% 합류에 도달할 때까지 24시간마다 배양 배지를 교체합니다.

3. hiPSC를 눈 영역과 망막 계통으로 분화

알림: 분화 과정의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다.

  1. hiPSC 배양이 70%-80% 합류에 도달하면 분화 절차를 시작합니다.
  2. 0일째에 hiPSC 유지 배지를 1ng/mL bFGF 및 1ng/mL Noggin을 포함하는 DIM(단계 1.3)으로 변경합니다. 6-웰 플레이트의 웰 당 2.0 mL의 배지를 첨가하고, 세포를 5%CO2 인큐베이터에서 37°C로 유지하였다.
    참고: bFGF의 점진적인 중단은 PSC의 분화를 유도하고, 초기 단계에서 증가하는 농도의 Noggin(여러 BMP의 억제제)의 첨가는 외배엽 계통 분화 및 신경화11,12를 유도하고 중배엽 및 내배엽 투입을 차단합니다. 또는 Noggin을 LDN193189로 대체 할 수 있습니다. 이전에 보고된 이중 SMAD 억제 전략과 달리20,21, 이 프로토콜은 Activin 또는 SB-431542의 추가를 요구하지 않습니다.
  3. 1일째에 폐 배지를 교체하고 1ng/mL bFGF 및 10ng/mL Noggin이 포함된 DIM을 추가합니다. 6-웰 플레이트의 웰당 2.0mL를 추가합니다. 세포를 5%CO2 인큐베이터에서 37°C로 유지하여 인큐베이션한다.
  4. 2-3일째에 사용한 배지를 제거하고 10ng/mL Noggin만 포함된 DIM을 추가합니다. 6-웰 플레이트의 웰당 2.0mL를 추가하고 24시간마다 배지를 교체합니다. 세포를 5%CO2 인큐베이터에서 37°C로 유지하여 인큐베이션한다.
    참고: 사용하기 전에 항상 배양 배지를 30-37°C로 예열하십시오. 과잉 부유물 및 죽은 세포는 초기 분화 배양에서 관찰될 수 있다. 이러한 조건 하에서, 배양물을 1x DPBS로 한번 세척하고, 망막 분화 배지를 첨가한다. 사용 된 배지에 대한 무균 테스트는 매주 또는 필요에 따라 수행 할 수 있습니다.
  5. 4일째에 사용한 매체를 제거하고 RDM을 추가합니다(1.4단계). 6-웰 플레이트의 웰 당 2.0 mL를 첨가하고, 매일 새로운 배지를 교체하면서 5%CO2 인큐베이터에서 37°C의 RDM에서 배양을 계속 유지한다.
    참고 : 또는 PSC를 5 x 10 3 cells/100 μL/well의 세포 밀도에서 비부착성 및 둥근 바닥 96웰 플레이트에서1-3 일부터 현탁 배양으로 성장시켜 DIM에서 동일한 배양 조건에서 배아체(EB)를 형성할 수 있습니다. 4일째에 잘 형성된 EB는 RDM을 함유하는 매트릭스 코팅 플레이트에 도금될 수 있으며 부착이 허용됩니다. 증식하고, 아래에 기술된 바와 같이 분화한다.
  6. 14-18일 경에 초기 안구 전구체로 구성된 신경 로제트 유사 도메인의 출현에 대해 10배 배율로 현미경으로 배양을 관찰합니다(그림 2B).
  7. 약 21-28일(3-4주)에 현미경으로 배양을 4배 및 10배 배율로 관찰하여 신경 상피와 안구 표면 상피의 연속적인 파생물로 둘러싸인 원형 3D 신경-망막 구조의 중앙 섬과 함께 자가 조직화되고 뚜렷한 EFP의 출현을 관찰합니다(그림 2C, D).
    참고: 정상 hiPSC 망막 분화 배양액의 6웰 플레이트의 웰당 약 20-30개의 EFP를 관찰할 수 있습니다. 이 숫자는 유전적 배경과 망막 계통 분화 가능성에 따라 다른 질병 특이적 hiPSC 계통에 따라 달라질 수 있습니다.

4. 망막 오가노이드 채취

  1. 망막 컵의 수동 따기를 위한 유리 파스퇴르 피펫의 화염 당기기.
    알림: 고압증기멸균 및 멸균 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 눈 필드 피킹을 하십시오.
    1. 분젠 버너를 켭니다. 멸균 파스퇴르 피펫을 가지고 한 손에는 베이스를, 다른 한 손에는 모세관 끝을 잡습니다. 유리가 유연해질 때까지 회전 운동으로 모세관 끝의 중간 근처 영역을 화염 살균 및 가열합니다. 그런 다음 화염에서 멀어지고 빠르게 바깥쪽으로 당겨 닫힌 루멘이 있는 미세한 모세관 팁을 만듭니다.
    2. 가는 팁을 화염 앞에서 수평으로 잡고 바깥쪽으로 빠르게 화염을 통과시켜 부드러운 후크 또는 L자형 모세관 팁을 만듭니다.
    3. 모세관 후크의 매끄러운 바깥쪽 곡률 영역을 미세한 스쿱으로 사용하여 EFP 클러스터에서 손상되지 않은 신경-망막 컵을 부드럽게 들어 올려 분리합니다.
      참고: 유리 모세관 후크의 매끄러운 각도는 세포에 손상을 입히거나 배양 표면에 흠집을 일으키지 않습니다. 이 간단한 도구는 그리드 패턴에서 개별 hiPSC 콜로니 분할 및 클론 확장 중에 작은 세포 클러스터로 계대하는 데에도 효과적으로 사용할 수 있습니다.
  2. 3D 망막 오가노이드를 생성하기 위한 망막 컵의 배양 및 유지.
    1. 25-30일째에 신경-망막 컵의 수확을 준비하기 전에 저부착 60mm 접시에 예열된 망막 분화 배지 4.0mL를 추가합니다.
    2. 0.63x-4.5x 배율의 실체 현미경으로 작업하여 개별 EFP에서 잘 형성된 신경망막 컵을 관찰하고 수동으로 선택합니다.
      참고: 색소가 있는 RPE 세포 파생물의 출현은 EFP와 중앙에 배치된 신경-망막 컵을 쉽게 식별하는 데 도움이 됩니다. 망막 컵은 CNS 뉴런 또는 신경 능선 세포에 의해 형성된 촘촘하게 채워진 구형 또는 불규칙한 클러스터와 대조적으로 선형으로 배열되고 자가 조립된 망막 줄기 세포에 의해 형성된 명확한 방사형 줄무늬를 가진 도넛 모양, 원형 및 반투명 3D 구조로 나타납니다(23).
    3. 화염으로 당겨진 목초지 피펫 후크를 사용하여 개별 EFP 내의 중앙 신경-망막 섬을 부드럽게 살짝 움직여 퍼냅니다.
    4. 1mL 마이크로피펫을 설정하여 100μL를 흡인하고 보어가 넓은 1mL 마이크로팁을 사용하여 플로팅 레티날 컵을 흡인하고 4.2.1단계에서 준비된 신선하고 부착력이 낮은 배양 접시에 옮깁니다.
      알림: 구멍 크기가 작고 흡입 압력이 높은 팁을 사용하면 전단이 발생하고 망막 컵의 무결성에 영향을 줄 수 있습니다. 망막 컵의 대략적인 치수는 직경이 약 1-2mm입니다.
    5. 망막 컵을 RDM에서 비-부착성 현탁액 배양물로 유지하고, 이들을 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 인큐베이션한다.
    6. 30-45 일 : 접시를 부드럽게 기울이고 망막 컵이 약 30 초 동안 안정되도록하여 매일 배지를 교체하십시오. 부분 공급 방법을 따라 사용한 배지의 절반 부피를 제거하고 동일한 부피의 새 배지로 교체하십시오.
      알림: 망막 컵의 손상을 방지하기 위해 반복적인 흡인과 이동을 피하십시오. 1-2주간의 현탁 배양 후, 망막 컵은 크기가 약간 커지고(1-3mm) PAX6 및 CHX10을 발현하는 선형으로 배열된 초기 신경-망막 전구체로 구성된 자가 조직화된 3D 망막 오가노이드(OC-1M)로 발달합니다(그림 3Bi).
    7. 45-60일: 신경-망막 전구체의 더 나은 생존 및 계통 분화 및 성숙한 망막 세포 유형(OC-2M)의 발달을 지원하기 위해 100μM 타우린을 함유한 RDM( 재료 표 참조)에서 추가로 4주 동안 망막 오가노이드를 배양합니다.
      참고: EFP에서 채취한 망막 또는 시신경 컵의 약 70%-80%는 손상되지 않은 상태로 유지되고 적층을 유지하며 4주간의 현탁 배양(OC-2M) 후 성숙한 망막 오가노이드로 발전합니다.
    8. 현탁 배양 4주째 성숙한 망막 오가노이드가 RCVRN+ 및 CRX+ 광수용체 전구체의 출현과 가장 바깥쪽 세포층에서 기초적인 내부 세그먼트와 같은 확장을 가진 성숙 세포의 출현을 보여주는지 확인하여 시험관 내에서 정상적인 망막 발달 및 성숙 과정을 요약합니다(그림 3Bii).
      참고: 신경-망막 컵을 제거한 후 분화 배양은 RDM에서 지속적으로 유지될 수 있습니다. 신경망막을 둘러싸고 있는 근위 상피 분출물에는 망막 색소 상피(RPE) 세포 전구체가 포함되어 있으며, 이 전구체는 더욱 확장 및 성숙하여 전형적인 조약돌 형태를 가진 색소 RPE 단층을 형성합니다(그림 4). 원위 파생물은 주로 수정체와 각막 상피에 기여하는 안구 표면 상피로 구성됩니다. 원하는 세포 유형은 EFP 파생물의 다양한 영역에서 수확하고 추가로 농축하여 순수 배양을 확립할 수 있습니다.

5. 망막 오가노이드의 특성 분석

  1. 형태학적 및 분자적 특성 분석
    1. 부착된 EFP와 부유 망막 오가노이드를 위상차 현미경으로 4x 및 10x 배율로 관찰하고 형태와 치수를 문서화합니다.
    2. 다양한 성숙 단계(4.2.3-4.2.6단계)에서 약 20개의 망막 오가노이드를 광구경 1,000μL 팁을 사용하여 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 수집합니다. 오가노이드가 바닥에 가라앉도록 하고 배지를 흡인합니다. 1x PBS로 컵을 씻으십시오.
    3. 과량의 PBS를 제거하고 1.0mL의 TRIzol 시약을 추가합니다( 재료 표 참조). 실온에서 5분 동안 배양합니다. 튜브 유봉을 사용하여 조직을 균질화하고 1.0mL 피펫을 사용하여 분쇄합니다.
    4. 제조업체의 지침에 따라 RNA 분리 및 정제의 표준 시약 방법에 따라 전체 RNA를 준비합니다( 재료 표 참조).
    5. 아가로스 겔에서 RNA 품질을 확인하고 NanoDrop 분광 광도계를 사용하여 정량화합니다( 재료 표 참조).
    6. 제조업체의 지침에 따라 역전사 효소를 사용하여 총 RNA의 1-2μg을 cDNA로 전환합니다( 재료 표 참조). 유전자 특이적 프라이머 목록은 표 1 을 참조하십시오.
    7. 간략하게, 표 2 에 언급된 바와 같이 총 부피 10 μL의 RNA-프라이머 마스터 믹스를 준비하고, 열 순환기에서 5분 동안 65°C에서 튜브를 인큐베이션한다. 열 순환기에서 얼음으로 튜브를 2분 동안 옮깁니다.
    8. 한편, 표 3에 언급된 시약으로 마스터 믹스 2를 준비한다. 이 마스터 믹스를 5.1.7 단계에서 준비된 RNA-프라이머 믹스 튜브에 추가합니다. 부드럽게 섞는다.
    9. 샘플을 50°C에서 50분 동안 배양한 다음 85°C에서 5분 동안 배양한 다음 4°C에서 유지하여 반응을 중지합니다.
    10. 합성된 cDNA를 PCR 반응의 주형으로 사용하여 신경-망막 전구체 및 성숙 망막 세포 마커의 발현을 확인합니다.
    11. 각 샘플의 총 cDNA 주형, 즉 F2-UD (hiPSC-F2-3F1; 미분화 세포), OC-1M (현탁 배양에서 1주령 광학 컵), 및 OC-2M (현탁 배양에서 4주령 광학 컵)을 hE1fα 또는 GAPDH와 같은 하우스키핑 유전자를 사용하는 반정량적 PCR에 의해 표준화한다.
    12. 표 4에 언급된 바와 같이 반정량적 PCR을 위한 마스터 믹스를 준비하고, 증폭을 위해 테스트 샘플 튜브를 열 순환기에 배치합니다. PCR 증폭 조건은 표 5에 언급되어 있다.
  2. 조직학 및 면역조직화학
    1. 2.0mL 미세 원심분리기 튜브에 광학 컵을 수집하고 초과 배지를 흡인합니다(단계 4.2.3-4.2.6). 오가노이드를 1x PBS로 헹구고 세척하고 500μL의 4% 파라포름알데히드에 현탁하여 실온에서 밤새 고정합니다.
    2. 다음날, 탈 이온수로 컵을 씻으십시오. 컵을 95% 알코올(3회 교체, 각 15-20분), 100% 알코올(3회 교체, 각 15-20분), 절대 알코올과 자일렌을 1:1로 15분 동안 혼합하고, 자일렌(2회 교체, 각 15분), 파라핀(3회 교체, 각 15분). 이 조직을 매립하여 표준 절차에 따라 파라핀 블록을 준비합니다. 식히고 굳히십시오.
    3. 마이크로톰을 사용하여 얇은 절편(~4-5μm 두께)을 준비하고 표준 조직학 절차에 따라 실란 코팅된 현미경 슬라이드( 재료 표 참조)에 놓습니다.
    4. 탈파라핀화를 위해 슬라이드를 가열 블록에서 70°C에서 15-20분 동안 가열합니다. 왁스가 녹 으면 슬라이드를 크실렌 (3 회 교체, 각각 3-4 분)으로 씻어 파라핀을 완전히 제거합니다.
      참고: 파라핀을 불완전하게 제거하면 엄청난 양의 배경 소음이 있는 섹션의 불량/고르지 못한 얼룩이 발생합니다.
    5. 서로 다른 비율의 에탄올(100%, 90%, 80%)을 각각 3분 동안 사용하여 슬라이드를 다시 수화합니다. 슬라이드를 증류수로 헹구고 항원 회수를 진행합니다.
    6. 항원 검색을 시작하기 전에 구연산염 완충액(pH 6.0)을 Coplin 병( 재료 표 참조)에서 95-100°C에 도달할 때까지 전자레인지를 사용하여 예열합니다.
    7. 슬라이드를 예열된 구연산염 완충액에 담그고 전자레인지에서 15분 동안 항아리를 가열합니다. 오븐에서 코플린 병을 꺼내 실온에서 식히십시오.
    8. 메탄올과 과산화수소의 1:1 혼합물을 5분 동안 첨가하여 내인성 과산화효소에 대한 섹션을 차단한 다음 섹션을 1x PBS로 세 번 세척합니다.
    9. 0.5% Triton-X 100을 사용하여 15분 동안 섹션을 투과시킵니다. 슬라이드를 1x PBS로 세 번 씻습니다.
    10. 1시간 동안 1x PBS에서 10% Fetal Bovine Serum(FBS)으로 절편을 배양하여 1차 항체의 비특이적 결합을 차단합니다.
    11. 1차 항체와 함께 절편을 실온에서 1시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 슬라이드를 1x PBS로 각각 3-5분 동안 3회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다.
    12. 적절한 형광 염료 접합 2차 항체를 추가하고 45분 동안 배양합니다. 슬라이드를 1x PBS로 각각 3-5분 동안 세 번 세척합니다.
      참고: 항체와 각각의 희석액은 재료 표에 언급되어 있습니다. 망막 오가노이드 절편은 PAX6 및 CHX10을 사용하여 초기 신경-망막 전구체 세포를 검출하고 Recoverin 및 CRX를 사용하여 커밋된 망막 및 광수용체 전구체 세포를 검출하기 위해 면역 표지되었습니다. 유사하게, 항-PAX6 및 항-MITF는 RPE 전구체를 검출하는 데 사용되었고, 항-CRALBP 및 항-RPE65는 2D 단층 배양의 면역세포화학에 의해 착색된 성숙 RPE 세포를 검출하는 데 사용되었습니다.
    13. DAPI 또는 PI로 섹션을 카운터스테인으로 염색하고 페이드 방지 장착 매체를 사용하여 유리 슬라이드에 장착합니다( 재료 표 참조).
    14. 형광 또는 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 망막 오가노이드 및 RPE 배양의 면역 표지 섹션을 이미지화하고 문서화하여 서로 다른 망막 마커를 발현하는 다양한 세포층을 검사합니다.

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결과

hiPSC를 눈 계통으로 분화하는 것은 그림 1에 설명된 바와 같이 보충제와 성장 인자를 포함하는 다양한 배양 배지에서 세포를 서로 다른 시점에서 순차적인 단계로 배양함으로써 달성됩니다. 상기 hiPSC 배양물은 만능줄기세포 유지 배지인 Essential 8 배지에서 유지된다. 70%-80% 밀도에 도달하면(그림 2A), 배지는 0일(3.2단계 참조)에 1ng/mL bFGF, 1ng/mL Noggin 및 1% N2 보충제를 포함하는 분화 유도 배지(DIM)로 교체됩니다. 신경 유도 N2 보충제와 함께 BMP 신호 전달 억제제 인 Noggin은 중배엽 및 내배엽 투입을 차단하여 세포를 신경 외배엽 계통으로 유도하는 데 중요한 역할을합니다. 1일, 2일,3 일에 Noggin의 농도가 10 ng / mL로 증가합니다 (3.3 및 3.4 단계 참조). 4일째

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토론

hiPSC는 시험관 내에서 장기 및 조직 발달을 연구하는 강력한 도구입니다. 건강한 hiPSC와 질병 특이적 hiPSC를 망막 계통으로 구별하여 질병 표현형을 요약하면 다양한 형태의 유전성 망막 이영양증의 병태생리학에 대한 새로운 통찰력을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다. PSC를 망막 세포 유형으로의 시험관 내 분화를 위해 여러 프로토콜이 설명되고 채택되었습니다. 대부분은 N1, N2 및 B27 보충제와 같은 재조합 성장 인자, 보충제, 소분자 및 시약의 복잡한 칵테일을 포함하는 배양 배지의 사용을 포함합니다. BMP 및 TGFβ 신호전달 차단제, 예컨대 Noggin, SB431542, LDN193189, 및 폴리스타틴, 또는 유도제, 예컨대 Activin A, Lefty, 및 IDE1; DKK1, SFRP, IWP-2 및 IWR-1-endo와 같은 표준 Wnt 신호 차단제 또는 CHIR99021, SB216763 및 CKI-7과 같은 유도제; FGF 수용체 신호전달 차단제, 예컨대 PD0325...

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공개 사항

모든 저자는 이해 상충이나 재무 공개가 없습니다.

감사의 글

저자는 유전학자인 Dr. Chitra Kannabiran의 과학적, 기술적 지원을 인정합니다. Subhadra Jalali 박사, 망막 컨설턴트; Milind Naik 박사, 안과 성형 외과 의사; 하이데라바드에 있는 LV Prasad Eye Institute의 안과 종양 전문의인 Dr. Swathi Kaliki는 정상 및 환자 맞춤형 iPSC 라인 생성을 위해 노력하고 있습니다. 저자는 과학 및 공학 연구위원회, 과학 기술부 (IM), (SB / SO / HS / 177 / 2013), 생명 공학부 (IM), (BT / PR32404 / MED / 30 / 2136 / 2019) 및 ICMR (S.M., D.P.), UGC (TA) 및 CSIR (V.K.P.), 인도 정부의 선임 연구원.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.22 & 마이크로; m 주사기 필터TPP99722 
15 mL 원심분리기 튜브TPP91015
50 mL 원심분리기 튜브TPP91050
6 well platesTPP92006
Anti-Chx10 항체; 마우스 단클론Santa CruzSC3655191:50 희석
Anti-CRX 항체; 토끼 단클론Abcamab1406031:300 희석
Anti-MiTF 항체, 마우스 단클론Abcamab32011:250 희석
Anti-Recoverin 항체; 토끼 다클론성         MilliporeAB55851:300 희석
B-27 보충제(50개), 무혈청Thermo Fisher17504044
염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)Sigma AldrichF0291
원심분리기 5810REppendorf
Coplin Jar(50mL)Tarson
Corning Matrigel hESC 인증 매트릭스코닝
CryoTubesThermo FisherV7884
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium)Thermo Fisher10565-018
DreamTaq DNA polymeraseThermo FisherEP0709
Dulbeco' s 인산염 완충 식염Thermo Fisher14190144
필수 8 매체 키트Thermo FisherA1517001
Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA)Sigma AldrichE5134
Falcon Not TC-treated Petri Dish, 60 mm 코닝351007
태아  소  혈청, 자격, 미국 Gibco26140079
GelDocXR+와 이미지 랩 소프트웨어BIO-RADAgarose Gel 문서화 시스템 
GlutaMAX 보충제Thermo Fisher35050061
염소 항 마우스 IgG (H + L), Alexa Fluor 488InvitrogenA110011 : 300 희석
염소 항 마우스 IgG (H + L), Alexa Fluor 546InvitrogenA110301 : 300 희석
염소 항 토끼 IgG (H + L), Alexa Fluo 546InvitrogenA110351 : 300 희석
염소 항 토끼 IgG (H + L), Alexa Fluor 488InvitrogenA110081:300 희석
HistoCore MULTICUTLeicaFor sectioning
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher10828028
L-Acsorbic acidSigma AldrichA92902
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Thermo Fisher11140-050
N2 보충제 (100x)Thermo Fisher17502048
NanoDrop 2000Thermo FisherRNA
파라포름알데히드퀄리겐23995
파스퇴르 피펫, 9인치, 비멸균, 언플러그코닝7095D-9
페니실린-스트렙토마이신 Thermo Fisher15140-122
재조합 Anti-Otx2 항체, 토끼 단클론Abcamab1839511:300 희석
재조합 Anti-PAX6 항체; Rabbit MonoclonalAbcamab1950451:300 희석
재조합 Anti-RPE65 항체, Rabbit MonoclonalAbcamab2317821:300 희석
재조합 인간 Noggin 단백질R& D Systems6057-NG
SeaKem LE AgaroseLonza50004
혈청 피펫 10 mLTPP94010
혈청 피펫 5 mLTPP94005
염화나트륨시그마 AldrichS7653
구연산 나트륨 삼염 이수화물Sigma AldrichS4641
Starfrost ( 실란 코팅) 현미경 슬라이드Knittel
SuperScript III First-Strand Synthesis SystemThermo Fisher18080051
SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCRInvitrogen18080051
Triton X-100Sigma AldrichT8787
TRIzol  시약Invitrogen15596026
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher15575020
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI 벡터 연구소H-1200 
VitronectinThermo FisherA27940
Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor)Sigma AldrichY0503
Zeiss LSM 880Zeiss컨포칼 현미경
354277수 드

참고문헌

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