다양한 광합성 유기체와 관련된 플라스토글로불 지질 방울의 분리를 위한 빠르고 효율적인 프로토콜이 제시됩니다. 분리된 플라스토글로불의 성공적인 준비는 단백질체학 및 지질체 분석과 같은 상세한 분자 조사에 앞서 중요한 첫 번째 단계입니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
Plastoglobule 지질 방울은 식물 엽록체와 시아 노 박테리아의 동적 하위 구획입니다. 광합성 종들 사이에서 유비쿼터스로 발견되는 그들은 빠르게 변화하는 환경 조건에서 틸라코이드 막의 적응 및 리모델링에 중심적인 역할을 하는 것으로 믿어집니다. 고순도의 플라스토글로블을 분리할 수 있는 능력은 단백질체, 지질 및 기타 방법론을 통해 연구를 크게 촉진했습니다. 고순도 및 수율의 플라스토글로블을 사용하면 다른 가능한 분자 특성 중에서 지질 및 단백질 조성, 효소 활성 및 단백질 토폴로지를 조사할 수 있습니다. 이 기사는 식물 잎 조직의 엽록체에서 플라스토글로불을 분리하기 위한 신속하고 효과적인 프로토콜을 제시하고 옥수수 잎, 부활 식물의 건조된 잎 조직, Eragrostis nindensis 및 시아노박테리움, Synechocystis 에서 플라스토글로블 및 관련 지질 방울 구조를 분리하기 위한 방법론적 변형을 제시합니다. PCC 6803. 분리는 이러한 지질이 풍부한 입자의 낮은 밀도에 의존하며, 이는 자당 밀도 부유선광에 의한 정제를 용이하게 합니다. 이 방법론은 다양한 종의 플라스토글로블 연구에 가치가 있음이 입증될 것입니다.
서론
플라스토글로불 구성 및 기능에 대한 현재의 이해는 상세한 단백질체학 및 지질체 연구 1,2,3,4,5를 통해 나타났습니다. 이러한 연구는 자당 구배를 사용하여 효율적인 분리를 위해 매우 낮은 밀도에 의존하는 신속하고 효과적인 분리 방법에 의해 크게 도움이되었습니다. 너도밤 나무 (Fagus sylvatica), 스카치 빗자루 (Sarothamnus scoparius), 양파 (부추 속 세파), 시금치 (Spinacia oleracea), 팬지 (비올라 삼색), 후추 (고추 일년) 및 완두콩 (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 원유 플라스토글로블 분리
- 스트레스를받지 않은 옥수수 잎 조직에서 추출한 원유 플라스토글로블 추출
- 약 3 주 된 6 개의 건강한 옥수수 묘목을 획득하고 거의 V5 성장 단계에 있으며 무게는 약 120g입니다.
- 줄기 바닥에있는 모든 잎을 잘라 내고 얼음 욕조에 빠르게 담그고 차가운 방으로 옮깁니다.
- 녹색 안전 램프 아래에서 작업하면서 얼음 욕조에서 옥수수 잎을 제거하고 가위를 사용하여 더 작은 조각 (약 5cm x 5cm)으로 자릅니다.
- 350mL의 분쇄 완충액에 상업용 블렌더에서 잘린 잎 조직의 절반을 부드럽지만 철저히 분쇄합니다(표 1). 블렌더 5x-6x를 시작하여 모든 잎이 잘리는지 확인하십시오. 블렌더에서 레벨 7 이상을 사용하지 마십시오.
- 큰 깔때기에 있는 25μm 나일론 천의 한 층을 통해 균질액을 4개의 250mL 원심분리기 병으로 여과합니다. 그런 다음 잘린 잎 조직의 후반부에 대해 1.1.4단계를 반복합니다.
- 여과액을 4개의 병 사이에 고르게 나누고 4°C에서 1,840 x g 에서 6분 동안 원심분리합니다. 잎 여과액의 분취량을 제거하고 대표적인 전체 잎 샘플로서 저....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
프로토콜의 단계 1이 완료되면, 상당한 양의 플라스토글로불/지질 액적 물질이 슈크로스 쿠션의 최상층 상(또는 그 근처)에 떠 있는 것을 쉽게 볼 수 있어야 한다(도 1B-C). 이 단계에서 다른 분획도 수집 할 수 있습니다. 예를 들어, 틸라코이드는 펠릿화되고 후속 분석을 위해 중간 R 0.2로 재현탁될 수 있습니다. 후속 원심분리 후, 정제 된 플라스토 글로불은 그림 1A, C에 도시된 바와 같이 자당 구배의 표면 또는 그 근처에서 얻어 질 것이다. 특정 상황 (예 : 특정 유전형 선 또는 환경 조건)에서 plastoglobules는 구배의 다른 층에서 분리되는 두 개의 별개의 하위 집단으로 분리됩니다 : 구배 표면의 저밀도 분획과 상위 두 구배 층 사이의 계면에 정착하는 두 번째, 더 조밀 한 분획. 분리 분획에 대한 신중한 비교.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
재료의 생리적/생화학적 변화를 최소화하고 플라스토글로불의 풍부한 성분인 특정 광학적 및 열에 불안정한 프레닐 지질 안료를 보호하려면 4°C에서 분리를 수행하고 빛으로부터 보호하는 것이 중요합니다. 위에서 지적한 바와 같이, 초기 단계는 녹색 발광 전구를 사용하여 안전 램프 아래의 냉장실에서 수행됩니다. 실험실에서 수행되는 후속 단계는 희미한 조명 아래에서 얼음 또는 냉장 원심 분리를 사용합니다. 유사한 이유로, 신선한 프로테아제 억제제 (및 단백질의 포스 포 조절 연구에 관심이있는 경우 포스파타제 억제제)를 포함하는 것이 중요합니다 (표 2 및 표 3).
다른 방법 (예 : Dounce 균질 기, 동결 - 해동 사이클)은 원칙적으로 고등 식물 엽록체의 틸라코이드에서 플라스토 글로 블을 방출하는 데 사용될 수 있지만, 초음파 처리는 최상의 수율과 순도를 제공하는 데 훨씬 우수한 것으로 밝혀졌습니다 (미공개 결과). 초음파.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
선언할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
Lundquist 실험실 그룹의 연구는 NSF (MCB-2034631) 및 USDA (MICL08607)에서 PKL에 대한 보조금으로 지원됩니다. 저자는 시아노박테리아 플라스토글로불 분리 방법의 개발에 대한 지원에 대해 Dr. Carrie Hiser(MSU)에게 감사를 표합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| AEBSF | 밀리포어 시그마 | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| 아프로티닌 | 밀리포어 시그마 | A6106 | |
| 아스코르브산 | BDH | BDH9242 | |
| 베스타틴 | 시그마 알드리치 | B8385 | |
| 베타-글리세로포스페이트. 2Na5H2O | EMD 밀리포어 | 35675 | |
| 소 혈청 알부민 | Proliant Biological | 68700 | |
| Chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N/A | 해당 없음 | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| 프랑스어 압력 셀 (모델 FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | 시그마 Aldrich | H3375 | |
| 류펩틴 | 시그마 Aldrich | L2884 | |
| 염화 마그네슘 | 시그마 Aldrich | M8266 | |
| Multitron 진탕 인큐베이터 | Infors HT | N / A | |
| 포스포 라미돈.2 Na | 시그마 Aldrich | R7385 | |
| 수산화 칼 | 피셔 화학 물질 | M16050 | |
| 감소된 시스테인 | MP 생화학 물질 | 101444 | |
| 불화나트륨 | 시그마 알드리치 | S7920 | |
| 오르토바나데이트 | 나트륨 시그마 알드리치 | 450243 | |
| 피로인산나트륨 &미드도트; 10H2O | 시그마 알드리치 | 3850 | |
| 소르비톨 | 시그마 알드리치 | S3889 | |
| 설탕 | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 W 형광 Gro-Lux 튜브 전구, 18" | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL 초원심분리기 | Beckman Coulter | A95761 | |
| Waring Blender (1.2 L) | VWR | 58977-227 | 상업용 블렌더 |
| 제아 메이스 | 해당 없음 N/A |
참고문헌
- Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. Lipid droplets throughout the evolutionary tree. Progress in Lipid Research. 78, 101029(2020).
- Lundquist, P. K., et al. The functional network of the Ara....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
태그
