T 세포 신호 전달의 척도인 칼슘 유입은 T 세포 수용체 자극에 대한 반응을 분석하는 효과적인 방법입니다. Indo-1을 세포 표면 분자를 겨냥한 항체 패널과 다중화하기 위한 이 프로토콜은 전체 스펙트럼 유세포 분석의 매우 유연한 기능을 활용합니다.
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방법 논문
Full Spectrum Flow Cytometry에 의한 Primary Murine T-cell의 T 세포 수용체 유도 칼슘 유입 분석
이 논문에서
요약
초록
T 세포 수용체 자극에 대한 반응으로 칼슘 유입은 T 세포 신호 전달의 일반적인 척도입니다. 띠 통과 유세포 분석에 의한 칼슘 신호 전달을 평가하기 위해 여러 칼슘 지표 염료가 개발되었습니다. 이 프로토콜은 전체 스펙트럼 유세포 분석을 사용하여 일차 쥐 T 세포에서 칼슘 반응을 측정하도록 설계되었습니다. 총 비장 세포는 세포 표면 분자에 대한 형광 색소 접합 항체 패널과 함께 비율 계량 칼슘 지표 염료 Indo-1로 표지됩니다. 전체 스펙트럼 유세포 분석의 기능을 활용하면 Indo-1과 함께 다양한 세포 표면 염색을 활용할 수 있는 플랫폼이 제공됩니다. 이어서, 세포는 T 세포 수용체를 자극하기 위해 항-CD3 항체의 첨가 전후에 37°C에서 실시간으로 분석된다. 스펙트럼 신호를 혼합하지 않은 후, 칼슘 결합 대 칼슘이 없는 Indo-1의 비율이 계산되고 비장 세포의 각 게이트 집단에 대해 시간 경과에 따라 시각화될 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 여러 세포 집단에서 칼슘 반응을 동시에 분석할 수 있습니다.
서론
T 세포 수용체(TCR) 유도 칼슘 유입은 T 세포 활성화의 유용한 척도이며 T 세포 집단이 TCR 신호 전달 경로1의 근위 단계에서 손상된 반응을 갖는지 여부를 결정하는 데 자주 사용됩니다. 칼슘 유입의 측정은 일반적으로 하나 또는 한 쌍의 형광 칼슘 지시약 염료로 T 세포를 사전 표지한 다음 TCR 가교후 실시간으로 유세포 분석을 사용하여 형광 신호를 검사하여 수행됩니다 2,3,4. 비율 미터법 칼슘 염료인 Indo-1은 칼슘 결합5에 따라 두 가지 다른 파장에서 피크 방출로 UV 레이저에 의해 여기되며, 살아있는 림프구의 칼슘 반응에 대한 유세포 분석 분석에 일반적으로 사용되는 지표 염료입니다. Indo-1의 방출 프로파일이 매우 광범위하기 때문에 Indo-1 평가와 대역 통과 유세포 분석에 의한 여러 세포 표면 마커의 동시 분석을 결합하는 것은 어려울 수 있습니다. 이러한 제한은 T 세포의 사전 정제된 집단 또는 제한된 세포 표면 분자 세트에 의해 식별된 집단에 대한 칼슘 반응의 유세포 분석 분석....
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프로토콜
마우스는 IACUC 프로토콜에 따라 콜로라도 대학교 안슈츠 메디컬 캠퍼스에서 유지되었습니다. 모든 마우스는 AAALAC 기준에 따라 안락사시켰다.
1. 마우스 비장에서 면역세포의 제조
참고: 순진한 마우스를 CO2 안락사로 안락사시킵니다. Jackson Laboratories에서 구입하여 사내에서 사육한 C57BL/6 마우스를 6-12주령의 실험에 사용합니다. 수컷과 암컷 마우스 모두 실험에 활용됩니다.
- 외부 오염 물질이 샘플에 들어갈 가능성을 줄이기 위해 70% 에탄올로 마우스 피부를 소독합니다.
- 해부 도구, 수술용 가위, 집게를 사용하여 쥐 비장을 해부합니다. 비장을 채취하고 분리된 비장을 얼음 위에 ~5mL의 완전한 RPMI 배지(cRPMI)가 있는 50mL 원뿔형 튜브에 넣습니다.
참고: Complete RPMI는 10% FBS, 2mM L-글루타민 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 구성됩니다.- 마우스 비장을 채취하려면 가위로 앞다리와 뒷다리 사이의 중간에 마우스 왼쪽을 따라 털과 피부를 5cm 절개합니다. 체강을 ~ 5cm 열고 집게를 사용하여 비장을 제거하십시오. 비장은 강낭콩의....
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결과
다중화 표면 염색이 있는 Indo-1 비율계량 염료를 사용하여 일차 쥐 T 세포에서 칼슘 반응을 평가하는 실험 워크플로는 그림 1에 나와 있습니다. 마우스 비장세포를 채취하여 단일 세포 현탁액으로 처리한 후, 세포를 Indo-1 AM 에스테르로 염색하고 표면을 형광 색소 결합 항체로 염색합니다. 염료 로딩 및 항체 염색이 완료되면 림프구 샘플을 생물학적 온도(37°C)로 예열합니다. 그런 다음 분석 전에 샘플을 분류할 필요 없이 원하는 개별 세포 유형에 대한 게이팅 후 Indo-1 형광에 대한 전체 스펙트럼 유세포 분석을 사용하여 샘플을 분석합니다. 전체 스펙트럼 유세포 분석기 내에서 APD(Avalanche Photo Diode) 검출기를 사용하려면 nm 단위로 측정된 대역통과 필터 파장의 피크 방출 파장을 APD의 해당 채널로 변환해야 합니다. 그림 2 에 표시된 표는 지침을 제공하지만 Indo-1의 두 가지 형광 시그.......
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토론
이 프로토콜은 전체 스펙트럼 유세포 분석 7,8을 사용하여 적정된 Indo-1 비율계량 지표 염료가 로드된 1차 쥐 T 세포에서 칼슘 반응을 측정하도록 설계된 최적화된 분석을 설명합니다. 전체 스펙트럼 유세포 분석을 사용하여 칼슘 플럭스 분석을 수행하는 이점은 Indo-1 형광 평가와 함께 표면 세포 마커 염색을 멀티플렉싱할 수 있다는 것입니다. 전체 스펙트럼 유세포 분석은 고도로 중첩되는 염료를 사용할 수 있어 패널에 사용할 수 있는 마커의 수를 늘릴 수 있다는 장점이 있습니다. 이는 전체 스펙트럼 유세포 분석기가 하나의 형광 색소 전용 검출기를 사용하는 것이 아니라 분석된 각 샘플에 대해 검출기 어레이에서 방출되는 모든 레이저 광을 수집하기 때문입니다. 각 형광체의 전체 스펙트럼을 사용하면 분석의 감도를 높일 수 있으며 대역 통과 유세포 분석기에서 수집할 경우 중첩 신호를 가질 수 있는 스펙트럼적으로 고유한 형광색소를 식.......
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공개 사항
저자는 선언 할 경쟁 이익이 없습니다.
감사의 글
R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro 유세포 분석 공유 리소스, RRID:SCR_021321, Aurora 및 SpectroFlo 소프트웨어에 대한 전체 스펙트럼 세포 분석 분석에 대한 지속적인 논의를 해주신 Cytek의 동료들에게 깊은 감사를 드립니다. 피규어는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 12웰 TC 처리 플레이트 | 셀 트리트 | 229111 | |
| 50mL 원뿔형 | Greiner Bio1 | 41-12-17-03 | 50mL 폴리프로필렌 원심분리기 튜브(캡 포함 |
| 5mL 폴리스테렌 플로우 튜브 | Corning | 352052 | |
| 5mL 주사기, | BD 주사기 | 309646 | 플런저만 사용, sheith 폐기, |
| 70uM 필터 | Greiner bio1 | 542070 | |
| aCD3 (17A2) | Biolegend | 100202 | |
| AKC 용해 버퍼 | Gibco | A1049201 | |
| Aurora 스펙트럼 유층 분석기 | https://cytekbio.com/pages/aurora | ||
| 목욕 구슬 | coleparmer | 항목 # UX-06274-52 | |
| CD19 PE | Tonbo | 50-0193-U100 | |
| CD1d 테트라머 APC | NIH | ||
| CD25 PECy7 | ebioscience | 15-0251 | |
| CD4 APC Cy7 | Tonbo | 25-0042-U100 | |
| CD8a FITC | ebioscience | 11-0081-85 | |
| 세포 인큐베이터 | 공식 과학 | ||
| 해부 도구 겸자 | McKesson | #487593 | 조직 집게 McKesson Adson 4-3/4 인치 길이 사무실 등급 스테인레스 스틸 NonSterile NonLocking 엄지 핸들 1 X 2 치아 |
| 해부 도구 가위 | McKesson | #970135 | 운영 가위 McKesson Argent™ 4-1/2 인치 수술용 스테인리스 스틸 손가락 반지 핸들 직선 날카로운 팁 / 날카로운 팁 |
| DPBS 1x | Gibco | 14190-136 | DPBS |
| EGTA | Fisher | NC1280093 | |
| FBS | Hyclond | SH30071.03 | 로트 AE29165301 |
| FlowJo 소프트웨어 | https://www.flowjo.com/ | ||
| Indo1-AM Ester Dye | ebioscience | 65-085-39 | 칼슘 로딩 염료 |
| ionomycin | Millipore | 407951-1mg | |
| Live/Dead Ghost 540 | Tonbo | 13-0879-T100 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브 1.7mL | Light Labs | A-7001 | |
| 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민 | Gibco | 10378-016 | |
| PRN694 | Med Chem Express | Hy-12688 | |
| 정제 안티 마우스 CD16/CD32 (FC 실드) ( 2.4G2) | Tonbo | 70-0161-M001 | FC 블록 |
| RPMI | Gibco | 1875093 | + 페놀 레드 |
| RPMI 페놀 프리 | Gibco | 11835030 | -페놀 레드 |
| 테이블 탑 원심분리기 | Beckman Coulter | Allegra612 | |
| TCRβ PerCP Cy5.5 | ebioscience | 45-5961-82 | |
| TCR&감마;/&델타; Pe Cy5 | ebioscience | 15-5961-82 | |
| Vi-Cell 블루 시약 팩 | 제품 번호: C06019 | 포함 Tripan | |
| Vi-Cell Blu | Beckman Coulter | ||
| Waterbath | Fisher 브랜드 드라이 배스 |
참고문헌
- Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).
- Huang, G. N.
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재인쇄 및 허가
