방법 논문

비침습적 미세투석 기술을 통한 쥐 심장의 동적 연속 혈액 추출

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DOI:

10.3791/64531

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2022년 9월 13일

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1School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

교신 저자: Xiaobo Wang <VitaDrwang@cdutcm.edu.cn>

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 미세투석 기술을 사용하여 쥐 심장 혈액의 실시간 및 동적 수집을 위한 간단하고 효율적인 방법을 설명한다.

초록

혈액 성분의 동적 분석은 심근 경색, 부정맥, 죽상 동맥 경화증, 심인성 폐부종, 폐색전증 및 뇌색전증과 같은 심혈관 질환 및 관련 질병을 이해하는 데 매우 중요합니다. 동시에, 독특한 민족 의학 요법의 효과를 평가하기 위해 살아있는 쥐에서 지속적인 심장 혈액 샘플링 기술을 돌파하는 것이 시급합니다. 이 연구에서는 정확하고 비침습적인 수술 절차로 쥐의 오른쪽 경정맥에 혈액 미세 투석 프로브를 이식했습니다. 그런 다음 온라인 미세 투석 샘플 수집 시스템에 연결하여 2.87nL/min에서 2.98mL/min의 속도로 심장 혈액 샘플을 수집했습니다. 더욱 중요한 것은 획득된 혈액 샘플을 4°C의 미세 투석 용기에 임시로 보관할 수 있다는 것입니다. 쥐 심장의 미세 투석 기반 온라인 연속 채혈 프로그램은 혈액 샘플의 품질을 크게 보장하여 전신 심혈관 질환 연구의 과학적 합리성을 발전시키고 활성화하며 혈액학의 관점에서 민족 의학 요법을 평가합니다.

서론

삶의 속도가 빨라지고 심리적 압박이 증가함에 따라 심혈관 질환 (CVD)은 젊은이, 중년 및 노인에서 발생하는 경향이 있습니다 1,2. CVD의 이환율과 사망률은 높으며, 급성 발병, 빠른 진행, 긴 질병 경과 등의 특징이 있어 환자의 안전에 심각한 영향을 미친다3. CVD의 발생은 콜레스테롤, 혈청 지질, 혈당, 심근 효소 및 단백질 키나아제 K 4,5,6과 같은 일부 혈액 성분의 변화와 밀접한 관련이 있을 수 있습니다. 환자의 관련 상황은 일상적인 혈액 검사 항목을 분석하여 가장 빠르게 관리 할 수 있습니다. 따라서 혈액 샘플의 품질에 따라 검사 결과의 정확도가 결정됩니다. 그러나, 종래의 채혈 방법은 몇 가지 불가피한 단점을 가지고 있으며, 이는 큰 외상 부위, 작은 혈액 수집량, 작업자에 대한 높은 요구 사항, 실시간으로 약물 변화를 반영 할 수 없음, 번거로운 혈액 샘플 전처리, 실험 동물의 대량 소비 및 동물 윤리적 요구 사항을 충족시키지 못하는 것과 같은 실험 결과에 심각한 영향을 미친다 7,8,9 . 의료 기술의 지속적인 발전으로 채혈의 품질도 더 높은 요구 사항을 제시했습니다. 따라서 상기와 같은 단점을 극복하기 위해 새로운 혈액 샘플링 기술을 개발하는 것이 시급하다.

미세투석(Microdialysis)은 투석 원리10에 기초한 생체 내 샘플링 기술이다. 비평형 조건 하에서, 측정될 화합물은 농도 구배를 따라 조직으로부터 투석액 내로 조직 내에 내장된 미세 투석 프로브 내로 확산 및 관류되고, 투석액과 함께 연속적으로 제거되어, 생체 조직으로부터 샘플링하는 목적을 달성한다(11,12). 전통적인 샘플링 방법과 비교하여, 미세 투석 기술은 다음과 같은 측면에서 훌륭한 이점을 갖는다13,14,15 : 혈액 내 다양한 화합물의 변화에 대한 지속적인 실시간 추적; 샘플링은 지루한 전처리가 필요하지 않으며 샘플링 현장에서 표적 화합물의 농도를 진정으로 나타낼 수 있습니다. 프로브는 표적 화합물의 흡수, 분포, 대사, 배설 및 독성을 조사하기 위해 신체의 다른 부분에 이식될 수 있습니다. 획득 한 샘플에는 생물학적 거대 분자 (>20 kD)가 포함되어 있지 않습니다. 따라서 고품질 혈액 샘플은 CVD와 민족 의학으로 치료되는 메커니즘에 대한 더 나은 해석을 보장합니다.

미세 투석 샘플링 시스템은 일반적으로 미세 주입 펌프, 연결 튜브, 동물이 없는 이동 탱크, 미세 투석 프로브 및 샘플 수집기로 구성된다16. 미세 투석 시스템의 장치의 가장 중요한 부분으로서, 일반적인 미세 투석 프로브는 동심 프로브, 플렉시블 프로브, 선형 프로브 및 션트 프로브(17)를 포함한다. 이 중에서, 플렉시블 프로브는 연질 및 비금속 프로브로서, 주로 깨어 있거나 자유롭게 움직이거나 마취된 동물의 혈관 및 심장, 근육, 피부 및 지방과 같은 말초 조직으로부터 샘플을 수집하는데 사용된다13. 혈관이나 조직과 접촉할 때 프로브를 유연하게 구부릴 수 있으므로 프로브 또는 샘플링 부위에 돌이킬 수 없는 손상을 방지할 수 있습니다. 프로브 기술의 지속적인 발전으로 다양한 분야에서 미세 투석 기술의 적용도 심화되고 있습니다. 본 논문에서는 채혈을 위해 설계된 플렉시블 프로브를 통해 비침습적 미세투석 기술로 쥐의 심장 혈액을 역동적이고 지속적으로 획득하였다.

프로토콜

동물 프로토콜은 청두 중의과대학 행정위원회의 승인을 받았습니다(기록 번호: 2021-11). 특정 병원체가 없는 수컷 Sprague Dawley(SD) 랫트(8-10주, 260-300g)를 독립적인 환기 케이지에서 키우고 실험실 환경을 22°C 및 65% 상대 습도로 유지하여 본 연구에 사용했습니다. 동물들은 상업적 공급원으로부터 입수하였다 ( 재료의 표 참조). 모든 랫트는 해당 기간 동안 무료 물과 식이요법으로 1주일 동안 적응 섭식에 익숙해졌습니다.

1. 실험 준비

  1. 그림 1과 같이 혈액 샘플링의 미세 투석과 관련된 장비를 조립합니다(재료 표 참조).
  2. 미세투석 채혈을 위한 관류액으로 구연산염 3.50mmol/L, 구연산나트륨 7.50mmol/L, 포도당 13.60mmol/L를 포함하는 항응고제 구연산염 포도당 용액(ACD)을 준비합니다( 재료 표 참조).
  3. 사용하기 전에 0.22μm 멤브레인 여과 장치로 ACD를 여과하고 초음파로 기포를 제거합니다. SD 쥐에 대한 자극을 줄이기 위해 ACD를 37°C로 유지하십시오.

2. 미세투석 배관 시스템의 개통 검사

  1. 투석 장치의 프로브 입구를 주사기 바늘, 튜브 어댑터 및 fep 튜브에 부착합니다( 재료 표 참조).
    알림: 미세 투석 프로브의 파란색 끝은 유체 유입용이고 투명 끝은 유체 유출용입니다.
  2. ACD18 을 2μL/min의 속도로 배관 시스템에 관류하여 미세 투석 배관 시스템의 개통성을 확인합니다.
    참고: ACD가 s에서 흐르는 경우ample 수집 장소, 방해받지 않는 미세 투석 시스템을 추가 심장 혈액 수집에 사용할 수 있습니다. 그렇지 않은 경우 혈액 프로브에 누출이 파손되었는지 또는 파이프-파이프 조인트가 밀봉되었는지 확인해야 합니다.

3. 미세투석 프로브 주입

  1. 0.6L/min의 공기-산소 혼합물에 2% 이소플루란으로 쥐를 마취하고, 완전히 의식을 잃은 쥐를 수술대에 고정하고, 동물 체온 유지제를 사용하여 체온을 37°C로 유지합니다( 재료 표 참조).
  2. 전기 면도기로 목에서 털을 제거하고 베타 딘과 70 % 알코올을 번갈아 가며 수술 부위를 소독하십시오. 쥐에게 부피바카인(1.5mg/kg)을 주사합니다. 목의 정중선을 따라 1.5cm 절개를 통해 연조직과 혈관주위 근막을 무딘 절개하여 오른쪽 경정맥을 노출시킵니다.
    참고: 실험에 사용된 모든 수술 기구 및 도구는 고압 증기멸균으로 미리 멸균해야 합니다. 멸균 장갑과 수술용 드레이프를 사용하십시오. 전체 실험 작업은 무균 환경에서 수행되어야합니다. 마취 및 진통 요법에 대한 현지 동물 사용 지침을 따르십시오.
  3. 심장 말단부의 우측 경정맥에 4-0 수술용 봉합사를 이용하여 탈착식 슬립노트를 만들어 일시적으로 혈류를 차단하고, 심장 근처의 우측 경정맥을 1.5cm 절개한다.
  4. 바늘 모양의 카테터 스타일릿(길이 25mm, 직경 0.7mm, 재료 표 참조)을 쥐 심장의 근위 끝을 향한 오른쪽 경정맥에 삽입하고 혈액 미세투석 프로브(총 프로브 길이 24mm, 막 길이 10mm)를 카테터에 삽입하고 카테터 스타일릿19의 비스듬한 절개를 따라 안과용 집게로 프로브를 이식합니다.
  5. 유도 카테터 탐침을 제거하고 프로브의 반투과성 막(막 길이 10mm, 막 직경 0.5mm)을 오른쪽 경정맥에 완전히 잠급니다. 오른쪽 경정맥의 혈류를 회복하기 위해 심장의 말단부에서 분리 가능한 슬립노트를 풉니다.
  6. 4-0 수술 봉합사를 사용하여 오른쪽 경정맥으로 프로브를 합자하고 프로브 테일 튜브를 목 뒤쪽에 피하 나사로 끼웁니다. 구체적인 프로브 주입 단계는 그림 2 를 참조하십시오.
    참고: 이 연구에 사용된 혈액 미세투석 프로브에 의한 분자 컷오프는 >20kD입니다. 수집 된 혈액 샘플에는 분자량이 20kD 미만인 물질이 포함되어 있습니다.

4. 미세 투석 샘플링

  1. 미세 투석 프로브 이식 일주일 후, 외과적 외상으로부터 회복된 쥐는 미세 투석 샘플링을 받습니다. 깨어 있는 쥐를 자유롭게 움직이는 탱크( 재료 표 참조)에 넣고 프로브를 미세 투석 시스템에 연결합니다. 1시간 동안 2μL/min의 속도로 ACD를 관개하여 프로브 투석막을 평형화합니다.
  2. 미세 투석 혈액 샘플을 2μL/min의 유속으로 수집하고 4°C 분수 용기에 임시로 보관합니다.
    참고: 얻은 혈액 샘플은 실온에서 20,000분 동안 10 x g 에서 원심분리하여 직접 테스트할 수 있습니다. 또는 다음 테스트를 위해 -80 °C에서 보관할 수 있습니다. 샘플을 수집할 때 프로브가 탈출 및/또는 누출되는지 항상 관찰하는 것이 중요합니다.

5. 샘플링 후 작업

  1. SD 쥐를 0.6L/min의 공기-산소 혼합물에서 2% 이소플루란으로 마취합니다.
  2. 프로브가 오른쪽 경정맥에 있는지 다시 확인하기 위해 해부합니다. 오른쪽 경정맥에서 미세 투석 프로브를 제거하고 초순수에 넣습니다.
  3. 마지막으로, 5% 이소플루란을 흡입하여 쥐를 안락사시킨다.
  4. 프로브를 파이프라인에 연결하고 초순수로 2μL/min의 속도로 밤새 헹구어 파이프와 프로브에 남아 있는 염분을 완전히 씻어냅니다.
  5. 프로브를 제거하고 초순수에 담그십시오. 프로브 투석막이 수축하는 것을 방지하기 위해 4°C에서 보관하십시오.
    알림: 투석액의 부피가 관류액의 부피와 일치하지 않으면 응고된 혈액에 의해 프로브가 차단될 수 있습니다. 프로브는 눈에 보이는 물질이 프로브 멤브레인의 끝에서 벗겨질 때까지 췌장 단백질 용액에 넣을 수 있습니다.

결과

본 프로토콜은 미세 투석 장비에 설정된 샘플링 매개변수에 따라 의식이 있는 쥐로부터 심장 혈액을 채취하는 것을 허용했습니다. 정상적인 혈액 샘플은 밝은 빨간색이어야하며 저산소증, 잠재적 혈전 또는 빈혈 질환이있는 동물은 짙은 자주색 또는 진한 빨간색을 가질 수 있습니다. 혈액 미세 투석 기술을 통해 얻은 샘플은 무색, 투명 및 투명하여 고성능 액체 크로마토 그래피 또는 질량 분석법을 사용하여 다양한 질병의 혈청 마커와 약물 및 대사 산물의 혈액 분포를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 설정된 파라미터 및 수집된 단일 혈액의 부피는 표 1에 나와 있습니다.

figure-results-1
그림 1: 혈액 미세 투석에 필요한 장비 및 장치 . (A) 동물 마취 시스템. (B) 수술 도구. (C) 수술대. (D) 샘플 수집 튜브. (E) 혈액 미세 투석 프로브, 카테터 및 주사기 바늘. (F) 미세 주입 펌프. (G) 미세주입 주사기. (H) 시험관 내 미세 투석 프로브 스탠드. (I) 쥐를위한 자유 이동 탱크. (J) 냉장 분획 분취기. (K) 쥐의 전혈 샘플 및 미세 투석 보조 혈액 샘플. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 쥐의 오른쪽 내부 경정맥에 이식된 혈액 미세 투석 프로브의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

매개 변수값
관류율2 μL/분
샘플링 속도2 μL/분
샘플링 온도섭씨 4도
단일 혈액 수집량12 마이크로리터

표 1: 미세 투석 혈액 샘플링 시스템의 매개변수를 설정합니다.

토론

CVD는 중국에서 발병률이 점차 증가하는 클리닉에서 흔한 만성 질환이며 발병 연령이 젊어지는 경향이 있어 대부분의 환자의 우려와 공황을 유발합니다20,21. CVD는 전 세계 주요 사망 원인이기 때문에 뇌경색 및 기타 사망률이 높은 질환을 유발하여 환자의 건강한 삶을 심각하게 위협할 수 있다22. 허혈성 심장 질환, 심근 병증, 죽상 동맥 경화증, 고혈압, 뇌졸중 및 심부전을 포함한 CVD는 심장에 혈액을 공급하는 동맥이 좁아지거나 굳어 질 때 발생합니다23,24. CVD를 진단하기위한 많은 방법이 있지만 혈액 검사는 여전히 가장 편리하고 빠릅니다. CVD와 관련된 초기 마커의 정확하고 민감하며 신속한 결정은 질병의 병태생리학적 상태를 신속하게 진단하고 이해할 수 있습니다. 그러므로, CVD 환자들의 진단 요구가 증가함에 따라, 고품질의 대표적인 혈액 샘플을 채취하는 것이 필요하다25. 동물 실험에서 일반적으로 사용되는 채혈 방법에는 꼬리 절단, 꼬리 정맥, 내안각, 복부 대동맥, 설하 정맥, 경동맥 동정맥, 참수, 주사기 심장 획득 및 대퇴 동정맥 채취가 포함된다26. 기존의 혈액 샘플링은 생체 내 약물 분석에 가장 일반적으로 사용되는 샘플링 방법입니다. 그러나, 복잡한 혈액 조성과 많은 내인성 장애로 인해, 분리 및 정제 과정은 앵무새처럼 지루하고 지루하며, 이 과정에서 약물 손실과 오염의 가능성이 있다27. 동물 윤리의 요구 사항을 고려하는 것 외에도, 조직 손상이 큰 장기간의 혈액 수집은 동물의 죽음을 초래할 수 있으며 지표28의 오도 테스트 결과를 유발할 수 있다. 동시에, 고품질의 수용 가능한 혈액 샘플은 동물 혈액의 민족 약초에서 추출한 활성 성분의 동적 변화의 정성적 및 정량적 검출을 보장하는 데 결정적입니다.

본 연구에서 사용된 미세투석 샘플링 기법은 지난 20년 동안 개발된 새로운 생검 샘플링 기법으로, 민족 약초의 약리학적 연구에 점진적으로 적용되고 있다29. 혈액 미세 투석은 체액을 잃지 않고 개별 동물로부터 많은 양의 샘플을 지속적으로 획득 할 수있는 선택적 투과성 막입니다. 그리고 더 주목할 만한 것은, 미세 투석 기반 혈액 샘플링 기술은 체액의 동적 균형을 유지하고, 전통적인 혈액 수집 기술로 인한 혈류 감소 문제를 피하며, 약물 분포가 검사 결과에 미치는 영향을 제거한다는 것이다30,31. 온라인 미세 투석에 의한 혈액 획득은 표적 부위32,33에서 의식이 있는 동물의 혈중 약물 농도를 실시간으로 감지할 수 있으며, 이는 특히 심부 조직 및 중요한 장기의 생체 내 연구에 적합하다는 점을 언급할 가치가 있습니다. 미세 투석 기술의 적용이 점점 더 성숙해짐에 따라 새로운 조직 특이적 프로브의 출현은 뇌의 단일 부위의 초기 검출에서 간, 피부/피부 플랩, 골격근 및 눈과 같은 여러 부위로 점차 발전하여 여러 조직 및 기관에서 민족 허브의 약리 작용에 대한 조사를 확대합니다33, 34.

미세 투석 샘플링 기술은 전통적인 샘플링 기술에 비해 고유한 장점이 있지만, 그 자체의 한계도 있다35. 첫째, 미세투석은 반투과막에 비가역적으로 결합할 수 있는 단백질 생체고분자 및 약물 검출과 같은 모든 물질의 샘플 수집에 적합하지 않습니다. 둘째, 프로브 특성, 관류액 특성 및 프로브 주입 작동은 프로브의 재활용 및 재사용을 제한합니다. 셋째, 고가의 프로브와 온라인 결합 기기의 높은 비용으로 인해 미세 투석 기술의 사용이 어느 정도 제한되었습니다. 결론적으로, 미세 투석 기술의 적용은 의심할 여지 없이 CVD 탐사에서 민족 의학을 홍보하는 데 큰 역할을 할 것입니다.

공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 중국 국립 자연 과학 재단(82104533), 중국 박사후 과학 재단(2020M683273), 쓰촨성 과학 기술부(2021YJ0175) 및 쓰촨성 과학 기술 계획의 핵심 R&D 프로젝트(2022YFS0438)의 지원을 받았습니다. 한편, 저자들은 TRI-ANGELS D&H TRADING PTE의 수석 장비 엔지니어인 Yuncheng Hong에게 감사의 말을 전하고 싶습니다. LTD. (싱가포르 시, 싱가포르), 미세 투석 기술에 대한 기술 서비스 제공.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
동물 마취 시스템Rayward Life Technology Co., LtdR500IE
동물 온도 유지기Rayward Life Technology Co., Ltd69020
혈액 미세투석 프로브  CMA 미세투석 ABT55347
카테터  CMA Microdialysis ABT55347
CitrateMerck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd251275
전기 면도기Rayward Life Technology Co., LtdCP-5200
Fep 튜빙  CMA 미세투석 AB3409501
동물을 위한 자유로운 이동 탱크  CMA 미세 투석 ABCMA120
포도당 Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., LtdG8270
지혈겸자 Rayward Life Technology Co., LtdF21020-16
IsofluranRayward Life Technology Co., LtdR510-22
마이크로 가위Beyotime Biotechnology Co., LtdFS221
미세 투석 제품분류 Tube  CMA 미세투석 AB7431100
미세  CMA Microdialysis ABCMA4004
Microdialysis in vitro 스탠드  CMA 미세투석 ABCMA130
미세투석 미세주입 펌프  CMA 미세투석 AB788130
미세투석 주사기 (1.0 mL)  CMA Microdialysis AB8309020
Microdialysis 튜빙 어댑터  CMA 미세 투석 AB3409500
미세 다공성 필터 멤브레인Merck Millipore Ltd.
비흡수성 외과용 봉합사Shanghai Tianqing Biological Materials Co., LtdS19004
수술대Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd30153
안과 겸자Rayward Life Technology Co., LtdF12016-15
구연산나트륨Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd1613859
스프라그 돌리  (SD) 쥐Chengdu Dossy Experimental Animals Co., LtdSYXK(figure-materials-1)2019-049
수술용 가위Rayward Life Technology Co., LtdS14014-15
수술용 가위Shanghai Bingyu Fluid technology Co., LtdBY-103
주사기 바늘  CMA 미세 투석 ABT55347
초음파 세척기Guangdong Goote Ultrasonic Co., LtdKMH1-240W8101
투석 수집기R0DB36622

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